一种HEK293F悬浮细胞高效电转染方法

摘要

本发明提供一种HEK293F悬浮细胞高效电转染方法，该方法通过对电转染时的电压强度、脉冲次数、脉冲间隔时长、电击时长等方面进行优化，实现了对悬浮培养的HEK293F细胞的高效电转染，其在电转时无需配制电转染缓冲液，即可得到较高的转染效率。该方法可用于不同质粒转染悬浮培养的HEK293F细胞，得到大量的目的蛋白(如抗体、酶等蛋白产物)的真核表达。

说明书

技术领域

本发明属于转基因技术领域，尤其涉及一种HEK293F悬浮细胞高效电转染方法。

背景技术

脂质体转染方法是目前用的最多的转染方法，脂质体包裹DNA形成DNA/脂质体复合物，细胞通过内吞的方式将DNA转入细胞内。但是DNA的质量对转染效率影响非常大，小剂量的内毒素、盐离子、蛋白和多糖等都会影响复合物的形成，因此低质量的DNA与细胞长时间接触会导致细胞死亡率升高，降低转染效率。且市面上的脂质体价格较高，不适合做大体积的转染。PEI虽价格便宜，但是转染效率低，且细胞毒性很大。磷酸钙转染细胞需要大量的DNA，且对转染缓冲液的pH变化比较敏感。

针对脂质体转染方法效率较低的问题，研究者们提出了采用电转染的方法。细胞电转染(电转)，也叫细胞电穿孔(electroporation)，是把外源大分子物质DNA、RNA、siRNA、蛋白质等以及一些小分子导入细胞膜内部的重要方法。在外加的电场下，细胞膜具有一定的通透性，使得DNA等带电外源物质可以通过类似电泳的方式进入细胞中。细胞膜由磷脂双分子层构成，近似绝缘体，因而在电场中细胞质内部几乎没有电流，吸附在细胞膜表面的DNA通过细胞膜的流动进入胞内。当条件合适时，外部电压对细胞的毒性很小，电转染后存活下来的细胞可以正常增殖。

目前，已有许多关于细胞电转染条件优化的报道，包括巨噬细胞、树突状细胞、成纤维细胞、CHO细胞、SGC7901/ADM等。唐岩等人在300V电压脉冲500μs时得到树突状细胞的最高转染效率。张禾璇等人用电转染法对HepG2、SGC7901/ADM两种细胞进行转染，均得到50％左右的转染效率。而对于HepG2细胞，电转缓冲液中将20μg DNA与2×10

电转染是给细胞施加外部电场强度，使细胞膜出现微孔，暂时失去屏蔽作用，细胞膜外部的DNA可以通过微孔进入细胞内。对于同种细胞，电场强度太低不能形成微孔，转染效率低；电场强度太高，对细胞产生很大的不可逆损伤，细胞死亡率高。现有电转染技术中，对于不同细胞，最佳电转染条件不同；细胞大小及细胞膜结构组分不同，电转条件也不同。因此对于特定的细胞，需要摸索最佳电转染条件。树突状细胞是目前发现的功能最强的抗原呈递细胞，HepG2细胞是肝癌研究的重要细胞模型，二者都是贴壁细胞，是肿瘤生物治疗领域的焦点；然而针对树突状细胞以及HepG2细胞进行电转染时，由于其细胞密度大，使得部分细胞较难达到阈值。报道的DC细胞和HepG2细胞最佳电转条件下，电转效率为50％-60％，但存在电转时需要电转缓冲液、电转前4℃孵育或者核酸用量大等问题。HEK293F细胞是从HEK293细胞中分离出的一种适应于悬浮细胞培养的细胞，可用于真核蛋白的大量表达。作为真核表达宿主，可以表达出原核细胞难以表达的真核蛋白，并可以对蛋白进行翻译后的修饰。

针对上述问题，本申请通过选择特定的悬浮细胞系HEK293F，并对电转染时的电压强度、脉冲次数、脉冲间隔时长、电击时长等方面进行优化，实现了操作简便，转染效率高，细胞毒性低等效果，该方法可在不进行预处理且无需使用电转染缓冲液的情况下，进行大体积转染，并应用于细胞生物学、免疫学、血液学、癌症研究、抗体及新药研发等。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种操作简便，转染效率高，细胞毒性低的HEK293F悬浮细胞高效电转染方法。

为了实现上述发明目的，本发明采用了以下技术方案：一种HEK293F悬浮细胞高效电转染方法，1)制备转染质粒；2)HEK293F细胞悬浮培养，使其进入对数生长期；3)细胞电转染，取对数生长期的HEK293F细胞，将其与转染质粒混匀进行电击，电击完成后进行培养得到；

上述转染质粒可以为包含外源基因的表达载体，所述外源基因可以为表达产物对细胞本身无毒无害的任意外源基因，包括但不限于表达抗原、抗体、酶等外源基因；所述表达载体可以为哺乳动物适用的任意表达载体，包括但不限于pcDNA、pIRES、pINFUSE-hIgG-Fc等；

上述电击步骤中，电击条件为，在200-300V电压下，1-2次电击，电击持续时间为10ms-20ms；其中电压可优选为230V，250V，280V，300V，进一步的，电压可更优选为230V；电击次数优选为2次，其中每次间隔0.1-10s，其中间隔时间可优选为1s，3s，5s，进一步的，间隔时间可更优选为1s；电击持续时间可优选为10ms，15ms，20ms，25ms，进一步的，电击持续时间可更优选为20ms；

进一步的，其电击条件最优选为230V电压下，电击20ms，连续电击两次，每次间隔1s；

HEK293F在其电击条件下可大大提高其细胞的存活率以及转导率，且在其更优条件下可获得更高的阳性细胞转导率；

进一步的，在电转染前还包括将HEK293F细胞离心除去旧培养基后用新鲜的基础培养基调整HEK293F细胞浓度，然后再加入转染质粒混匀的步骤；

进一步的，在电转染前，HEK293F细胞与转染质粒混匀后，不需要在4℃孵育的步骤；

进一步的，在其电转染方法中，无需使用电转染缓冲液；

进一步的，在其电转染方法中，无需更换电转染后细胞所用培养基的步骤，只需加入细胞生长所需L-谷氨酰胺或者L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，即可对经过电击的HEK293F细胞进行培养。

本发明中，电转前细胞与DNA混合液无需置于4℃孵育；电转时使用正常培养基即可，无需配制、使用电转染缓冲液，电转后也仍然可以得到高的转染效率，其克服了现有技术中存在的电转时需要配置电转缓冲液、电转前进行4℃孵育等繁琐的步骤问题以及电转时核酸用量大等问题。进一步的，本申请涉及的电转染方法，在电转后，无需更换为细胞所用培养基，使操作更简便，进一步节省时间，节约成本。本发明涉及的电转染方法可用于转染表达不同目的蛋白的载体进入HEK293F悬浮细胞，实现所需蛋白在真核体系中的大量表达。在表达载体中加入一段编码分泌信号肽的序列，即可将表达的蛋白分泌至细胞外，有利于细胞大量表达蛋白及目的蛋白后续的纯化工作。

附图说明

图1是不同电压处理下细胞活率。

图2是不同脉冲次数对应转染效率。

图3是两次脉冲下，不同间隔时间对应转染效率。

图4是不同脉冲时长对应电转染效率。

图5是最佳电转染条件下转染结果。

具体实施方式

一、HEK293F电转染的方法

1.1pTT5-EGFP表达载体构建

将EGFP的基因克隆到真核表达载体pTT5上，通过引物设计，在EGFP 5'端和3'端分别引入EcoR I和Not I酶切位点，5'端引入kozak序列和起始密码子，3'端引入终止密码子。

引物设计如下：

F：5’CCGGAATTCGCCACCATGCACCACCACCACCACCACATGGTGAGCAAGGGCGAGG3’

R：5’TTGCGGCCGCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG3’

使用pCDNA3.1-EGFP作为模板，使用上述引物与其进行PCR。PCR产物电泳之后进行胶回收获得EGFP片段。将载体pTT5和目的片段EGFP使用EcoR I和Not I两个限制性内切酶在37℃酶切30min，电泳后进行胶回收得到双酶切产物。利用T4 DNA连接酶将片段与线性化的pTT5载体在22℃下孵育15min，随后通过42℃热处理45s转化到感受态细胞DH5α中，经37℃培养复苏1h然后涂布到LB平板(含有氨苄青霉素)上进行筛选，37℃过夜培养。第二天挑取单菌落进行菌落PCR和双酶切鉴定阳性克隆，筛选到的阳性菌株经培养后提取质粒，最后进行基因测序鉴定。

将测序成功的菌种37℃过夜培养，第二天用无内毒素试剂盒提取重组pTT5-EGFP质粒，最后质粒溶于无菌无内毒素的水中，Nanodrop测核酸浓度。

1.2HEK293F细胞悬浮培养

从液氮罐中快速取出待复苏的HEK293F细胞，放入37℃水浴锅中慢慢摇晃2分钟之内融化。将冻存管表面酒精消毒后放入超净台中，用移液枪将细胞转入含8ml HEK293F基础培养基的15ml离心管中，1000rpm离心5分钟。

其中，本实施例中的HEK293F基础培养基包含2mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，例如使用市售的GlutaMax

在上述用移液枪将细胞转入含8ml HEK293F基础培养基的15ml离心管中，1000rpm离心5分钟操作之后，继续如下操作：弃上清，用手指轻弹离心管底将细胞分散，加入2ml培养基后用移液枪轻轻吹打细胞使细胞分散。将细胞转移至准备好的125ml摇瓶中，并加入18ml HEK293F基础培养基。将125ml摇瓶置于5％二氧化碳培养箱中，130rpm摇床37℃培养24h。在Luna细胞自动计数仪下计数，若细胞密度达到2-3×10

用移液器轻轻吹打细胞后将细胞悬液转移入无菌离心管中。1000rpm离心5min。弃上清，加入培养基使细胞密度至0.5×10

1.3细胞电转染

取出处于对数生长期的HEK293F细胞，离心去除旧培养基，分别用新鲜的不含L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(GlutaMax

取出处于对数生长期的HEK293F细胞，离心去除旧培养基，分别用新鲜的不含L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(GlutaMax

取出处于对数生长期的HEK293F细胞，离心去除旧培养基，分别用新鲜的不含L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(GlutaMax

取出处于对数生长期的HEK293F细胞，离心去除旧培养基，分别用新鲜的不含L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(GlutaMax

根据上述电转实验结果，在不含L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(GlutaMax

上面所述的只是说明本发明的一些实施方式，由于对相同技术领域的普通技术人员来说很容易在此基础上进行若干修改和改动，因此本说明书并非是要将本发明局限在所示和所述的具体结构、方法步骤和适用范围内，故凡是所有可能被利用的相应修改及等同物，均属于本发明所申请的专利范围。