一种L-岩藻糖合成方法

摘要

本发明涉及岩藻糖技术领域，且公开了一种L‑岩藻糖合成方法，包括以下步骤：S1：从海藻或者树胶内提取岩藻糖；S2：将岩藻糖与酸进行融合酸碱中和；S3：以苯腙形式析出α‑L‑岩藻糖结晶；S4：提供酶种类EC1.1.3.9的半乳糖氧化酶和任选的一种或多种另外的成分；S5：采用S4中半乳糖氧化酶和S3中α‑L‑岩藻糖结晶，并且在允许α‑L‑岩藻糖结晶催化氧化成L‑岩藻糖的条件下温育得到的混合物；S6：分离合成的L‑岩藻糖；通过α‑L‑岩藻糖结晶和半乳糖氧化酶和任选的选自过氧化物酶和/或过氧化氢酶(catalase)的另外的酶的方法实现该目的，由此将α‑L‑岩藻糖结晶转化成L‑岩藻糖可以在单一步骤反应中进行，并且在这种情况下可得到高产率。

说明书

技术领域

本发明涉及岩藻糖技术领域，具体为一种L-岩藻糖合成方法。

背景技术

岩藻糖是六碳糖的一种，又称6-脱氧-L-半乳糖，并可以看做是一种甲基戊糖，自然界存在的岩藻糖绝大多数为L-岩藻糖，D构型的岩藻糖仅作为稀有糖，发现于一些糖甘类化合物中，L-岩藻糖较大量地存在于海藻及树胶中，也发现于某些细菌的多糖中，岩藻糖作为糖蛋白中糖链的组成部分，广泛存在于各类细胞表面的质膜上，岩藻糖比一般六碳糖在第六碳原子上少一个羟基，所以岩藻糖比其他单糖亲水性弱，而疏水性强一些，在某些血型物质分子中的岩藻糖是一定的血型的标记，岩藻糖是许多细胞表明聚糖的末端糖，在许多生理和病理过程中发挥重要的作用。例如，唾液酸化的Lewis X，其末端是一个岩藻糖，这个四糖表达于白血细胞如粒细胞和单核细胞，这种聚糖与多种肿瘤包括胰腺癌、乳腺癌、结肠癌和肺癌等组织来源密切相关。但是，这些聚糖作用机制还不明确，其原因在于聚糖结构的复杂性，对其末端糖(如岩藻糖)进行结构修饰改造，比如加上探针(probe)，就可以对该糖的作用过程进行跟踪，进而研究其作用机理；已提出生物技术方法来获得L-岩藻糖，例如，WO 2012/034996 A1教导了使用具有根据SEQ ID NO：1的特异性16S rRNA的，肠杆菌科(Enterobacteriaceae)(保藏为DSM 22227)的分离的微生物来生产L-岩藻糖的方法，用于通过发酵生产L–岩藻糖。

已有文献报道了一些L-岩藻糖类似物的合成方法，L-半乳糖价格昂贵 (非天然提取，$260/100mg)，该方法不适合于大量合成。因此，发展一种廉价，有效的制备L-岩藻糖类似物的方法成为一种必要和紧迫的工作。本发明以L-半乳糖酸-1,4-内酯($300/2g)为原料，发展了一种L-岩藻糖合成方法。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种L-岩藻糖合成方法，具备简易有效的优点，解决了价格昂贵的问题。

(二)技术方案

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种L-岩藻糖合成方法，包括以下步骤：

S1：从海藻或者树胶内提取岩藻糖；

S2：将岩藻糖与酸进行融合酸碱中和；

S3：以苯腙形式析出α-L-岩藻糖结晶；

S4：提供酶种类EC 1.1.3.9的半乳糖氧化酶和任选的一种或多种另外的成分；

S5：采用S4中半乳糖氧化酶和S3中α-L-岩藻糖结晶，并且在允许α-L- 岩藻糖结晶催化氧化成L-岩藻糖的条件下温育得到的混合物；

S6：分离合成的L-岩藻糖。

优选的，S4中一种或多种任选的另外成分选自过氧化物酶和/或过氧化氢酶。

优选的，S5中发酵温度32-36℃、摇床转速160-220r/min、发酵时间 38-46h。

优选的，S5中催化温度35-40℃、反应时间7-9h。

优选的，S5中的温育开始时α-L-岩藻糖结晶在混合物中的浓度为 1-500g/L，优选5-250g/L，特别优选20-125g/L。

优选的，S5中的温育开始时半乳糖氧化酶在混合物中的浓度为 0.005-6.25g/L，优选0.005-3.2g/L，更优选0.005-0.5g/L，且尤其优选0.005-0.05g/L。

优选的，S2中岩藻糖在盐酸溶液中进行，反应温度为0℃，反应时间为 2-4小时。

优选的，S3中以苯腙形式析出α-L-岩藻糖结晶的同时除去苯肼，α-L- 岩藻糖结晶的熔点为145℃。

优选的，S4还包括以下步骤：

S41、提供重组微生物或真菌，其用于酶种类EC 1.1.3.9的半乳糖氧化酶的重组表达，其中微生物或真菌包含编码半乳糖氧化酶的转基因，半乳糖氧化酶来自肉座菌目的真菌，优选选自镰刀菌属、特别是尖镰孢菌种；

S42、在允许合成半乳糖氧化酶的条件下培养所述重组微生物；

S43、分离合成的半乳糖氧化酶。

(三)有益效果

与现有技术相比，本发明提供了一种L-岩藻糖合成方法，具备以下有益效果：

该L-岩藻糖合成方法，通过α-L-岩藻糖结晶和半乳糖氧化酶和任选的选自过氧化物酶和/或过氧化氢酶(catalase)的另外的酶的方法实现该目的，由此将α-L-岩藻糖结晶转化成L-岩藻糖可以在单一步骤反应中进行，并且在这种情况下可得到高产率。

附图说明

图1为本发明结构示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1，一种L-岩藻糖合成方法，包括以下步骤：

S1：从海藻或者树胶内提取岩藻糖；

S2：将岩藻糖与酸进行融合酸碱中和；

S3：以苯腙形式析出α-L-岩藻糖结晶；

S4：提供酶种类EC 1.1.3.9的半乳糖氧化酶和任选的一种或多种另外的成分；

S5：采用S4中半乳糖氧化酶和S3中α-L-岩藻糖结晶，并且在允许α-L- 岩藻糖结晶催化氧化成L-岩藻糖的条件下温育得到的混合物；

S6：分离合成的L-岩藻糖。

本实施例中，具体的，S4中一种或多种任选的另外成分选自过氧化物酶和/或过氧化氢酶。

本实施例中，具体的，S5中发酵温度32-36℃、摇床转速160-220r/min、发酵时间38-46h。

本实施例中，具体的，S5中催化温度35-40℃、反应时间7-9h。

本实施例中，具体的，S5中的温育开始时α-L-岩藻糖结晶在混合物中的浓度为1-500g/L，优选5-250g/L，特别优选20-125g/L。

本实施例中，具体的，S5中的温育开始时半乳糖氧化酶在混合物中的浓度为0.005-6.25g/L，优选0.005-3.2g/L，更优选0.005-0.5g/L，且尤其优选0.005-0.05g/L。

本实施例中，具体的，S2中岩藻糖在盐酸溶液中进行，反应温度为0℃，反应时间为2-4小时。

本实施例中，具体的，S3中以苯腙形式析出α-L-岩藻糖结晶的同时除去苯肼，α-L-岩藻糖结晶的熔点为145℃。

本实施例中，具体的，S4还包括以下步骤：

S41、提供重组微生物或真菌，其用于酶种类EC 1.1.3.9的半乳糖氧化酶的重组表达，其中微生物或真菌包含编码半乳糖氧化酶的转基因，半乳糖氧化酶来自肉座菌目的真菌，优选选自镰刀菌属、特别是尖镰孢菌种；

S42、在允许合成半乳糖氧化酶的条件下培养所述重组微生物；

S43、分离合成的半乳糖氧化酶。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。