一种使用DNA聚合酶突变株高效合成5’标记RNA的方法

摘要

本发明属于生物技术领域，公开了一种使用DNA聚合酶突变株高效合成5’标记RNA的方法。该方法包括：将含目标序列的单链DNA、聚合酶缓冲溶液、5’末端带修饰的DNA寡核苷酸链的引物混合均匀，升温进行去空间结构处理再降温退火，得到混合体系1；往混合体系1中加入核糖核苷酸，SFM4‑3聚合酶，混合均匀，得到转录体系，孵育，纯化分离RNA，得到目标序列的5’标记RNA。本发明提供的方法，利用定向改造获取的热稳定DNA聚合酶在合成RNA的时候直接实现对所有RNA产物5’末端的荧光素或生物素等标记，并且在实现标记的同时仍然保持RNA分子的活性与功能。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种使用DNA聚合酶突变株高效合成5’标记RNA的方法。

背景技术

在核酸分子的研究和应用中，单链RNA末端标记是一项很重要的技术。单链RNA末端标记是将标记物(如荧光素、生物素等)通过一定的方式连接到RNA的5’末端或者RNA的3’末端，通过检查标记物，进而实现对RNA鉴别、检测，或对功能核酸(如RNA适配体)进行亲和力测定和应用开发。

单链RNA末端标记主要分为化学标记和酶法标记。化学标记难度大，成本高，而酶法标记比化学标记简单方便。单链RNA的5’末端标记和3’末端标记的方法各不相同。单链RNA的3’末端标记技术主要通过TdT法和T4 RNA连接酶法在RNA 3’末端增加一个修饰的核苷酸或者带修饰的小核酸片段。单链RNA的5’末端标记技术比较复杂，一般是先利用T4多聚核苷酸激酶对RNA的5’末端进行磷酸化，然后在T4 RNA连接酶的作用下，与一条通过化学修饰的寡核苷酸链连接。由于T4 RNA连接酶将带修饰的DNA片段连接到磷酸化的RNA 5’或3’末端的反应效率都较低，难以保证所有目标RNA分子的完全标记，单链RNA5’末端标记又一直没有很好的技术，因此使用该方法进行RNA的5’末端标记仍然比较困难。

RNA适配体是指在没有互补链存在的情况下，自身经过卷曲和折叠，形成特定的三级结构，并对靶标分子具有高亲和力和高特异性的单链RNA分子。RNA适配体文库经指数富集的配体系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by ExponentialEnrichment,SELEX)筛选后，需要通过亲和力表征确定是否成功筛选到RNA适配体，而RNA的末端标记是测定RNA适配体亲和力的重要技术工具。RNA适配体的末端标记要符合以下要求：1)不破坏适配体的结构；2)不影响适配体对靶标的亲和力；3)标记物灵敏度高。已报道的RNA适配体亲和力测定都是采用放射性标记，此方法具有一定的危险性，需要专门的实验条件和资源，无法普及。单链RNA的5’末端标记技术又难以满足需求，因此RNA适配体末端标记还没有简便、安全、高效的方法。

SFM4-3聚合酶是以Taq DNA聚合酶的催化结构域SF片段为进化起点，通过使用噬菌体展示系统经定向进化后具有转录活性的DNA聚合酶。经过改造的SFM4-3聚合酶能识别2’-F/2’-OMe修饰的核糖核苷酸，并且可以直接转录合成天然的RNA以及带修饰的非天然RNA链。与T7 RNA聚合酶转录RNA不同，SFM4-3聚合酶转录RNA时不需要启动子，而是以单链DNA为模板，从DNA引物的3’末端开始延伸，直到模板的5’末端结束。由于使用SFM4-3聚合酶突变株进行的RNA以及修饰RNA的转录具有这一特点，所以可以方便地通过DNA引物在转录产物的5’端快速地引入各种标记。同时，如果选取适当的DNA引物，5’端的标记以及DNA小片段也不会对RNA转录产物的活性与功能产生太大的影响。

发明内容

为了克服现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种使用DNA聚合酶突变株高效合成5’标记RNA的方法。

本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。

本发明提供了一种简便、高效的RNA5’末端加标记的方法。该方法以含目标序列的单链DNA为模板，以5’末端带修饰的DNA寡核苷酸链为引物(由15个胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸组成)，通过使用定向改造获取的SFM4-3聚合酶转录合成5’标记的目标RNA或糖环修饰/非天然RNA。

本发明提供的使用DNA聚合酶突变株高效合成5’标记RNA的方法，包括如下步骤：

(1)将含目标序列的单链DNA、聚合酶反应缓冲液、5’末端带修饰的DNA寡核苷酸链的引物混合均匀，得到混合液，然后升温进行去空间结构处理，再降温退火，得到混合体系1；

(2)往步骤(1)所述混合体系1中加入核糖核苷酸、SFM4-3聚合酶，混合均匀，得到转录体系；

(3)将步骤(2)所述转录体系进行孵育处理，得到转录产物，纯化分离RNA，得到目标序列的5’标记RNA。

进一步地，步骤(1)所述聚合酶反应缓冲液包含400-600mM的Tris、400-600mM的MgCl

进一步地，步骤(1)所述5’末端带修饰的DNA寡核苷酸链的引物包括15个胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸及修饰部分；所述修饰部分为生物素标记、荧光素标记、放射性标记中的一种以上。

进一步地，在步骤(1)所述混合液中，含目标序列的单链DNA的终浓度为400-600nM，Tris的浓度为40-60mM、MgCl

进一步地，步骤(1)所述去空间结构处理的温度为90-98℃，去空间结构处理的时间为2-5min。

进一步地，步骤(2)所述的天然的核糖核苷酸包括ATP、UTP、GTP、CTP，非天然核糖核苷酸包括糖基2’位修饰的ATP、糖基2’位修饰的UTP、糖基2’位修饰的GTP、糖基2’位修饰的CTP，所述修饰为2’-F、2’-OMe、2’-N

进一步地，步骤(2)所述的SFM4-3聚合酶的序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，在步骤(2)所述转录体系中，核糖核苷酸的终浓度为0.2-0.6mM，SFM4-3聚合酶的终浓度为0.8-1.6μM。

进一步地，步骤(3)所述孵育处理的温度为45-70℃，孵育处理的时间为8-16h。

进一步地，步骤(3)所述纯化分离RNA，包括：

将转录产物经过变性胶分离后，切胶回收5’末端带标记的RNA或糖环修饰/非天然RNA，完成RNA的纯化分离。

所述变性胶的组分包含15％PAGE和8M尿素，所述15％PAGE主要成分包括：40％丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺，1×TBE缓冲液，30wt％的过硫酸铵(APS)和100wt％四甲基乙二胺(TEMED)，所述丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的质量比为29:1。

优选地，本发明提供的使用DNA聚合酶突变株高效合成5’标记RNA或糖环修饰/非天然RNA的方法中，转录体系如表1所示，单链DNA模板和带标记的引物混合后，95℃加热5min，然后冷却至室温，然后将NTPs或含修饰的NTPs混合物或修饰的NTPs混合液、10×聚合酶缓冲液(含500mM Tris，pH 8.5)，500mM MgCl

表1RNA 5’末端加标记的转录体系

本发明转录合成的5’末端带修饰的RNA适配体仍然具有优良的与靶标结合的亲和力。本发明以15个胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸为连接臂，将生物素、荧光素等标记到RNA适配体的5’末端，RNA适配体经90℃加热4min后，缓慢冷却至室温。经过热处理后的5’末端带修饰的RNA适配体，连接臂不会影响链间的折叠，仍能折叠成具有生物活性的特定结构。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：

本发明提供的方法，利用定向改造获取的热稳定DNA聚合酶在合成RNA或糖修饰/非天然RNA的时候直接实现对所有RNA产物5’末端的荧光素或生物素等标记，并且在实现标记的同时仍然保持RNA分子的活性与功能(以5’末端带修饰的RNA适配体为例)。

附图说明

图1为RNA5’末端标记标签的技术流程图。

图2为实施例1中合成5’末端标记Biotin的RNA的电泳图。

图3为实施例2中测定5’末端标记FAM的靶向人凝血酶的RNA适配体以及2’-F-C,U修饰的RNA适配体的凝血酶结合活性的实验结果图。

图4为用靶向人凝血酶5’末端标记Biotin的RNA适配体检测人凝血酶的夹心ELISA实验原理图。

图5为用靶向人凝血酶5’末端标记Biotin的2’-F-C,U修饰的RNA适配体的检测人凝血酶ELISA实验结果图。

具体实施方式

以下结合附图和实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。

以下实施例采用的SFM4-3聚合酶，序列如SEQ ID NO.1所示。

以下实施例采用的1×聚合酶缓冲溶液中，Tris的浓度为40-60mM、MgCl

实施例1制备5’末端带Biotin标记的RNA

实施例1中采用的模板和引物序列如表2所示。

表2

参照图1所示，制备5’末端带Biotin标记的RNA的方法，包括：

1)1×聚合酶缓冲溶液中加入500nM的引物与500nM的模板，混合物于95℃加热5min后，冷却至室温，得到反应体系。

2)向反应体系加入0.5mM NTPs(NTPs包括ATP、UTP、GTP、CTP，所述ATP、UTP、GTP、CTP的浓度相同，均为0.5mM)和1μM SFM4-3聚合酶，混合均匀得到转录体系，转录体系于50℃孵育12h。

3)转录产物(DNA/RNA杂合体)经含8M尿素的15％PAGE胶分离后，切下5’末端标记上Biotin的RNA链。

4)含有5’末端标记Biotin的RNA适配体的PAGE胶块，经枪头挤压破碎后，加入洗脱缓冲液(0.5M乙酸铵，1mM EDTA(pH 8.0)，0.1％SDS)，经45℃水浴处理1h后，用0.22μm过滤器除去碎胶块，保留上清液。向上清液中加入2倍体积的无水乙醇以及总体积1/10的3M乙酸钠，混合液于-20℃静置1h。静置后的混合液于4℃，12000rpm离心10min，弃上清液。沉淀用预冷的70％的乙醇洗3次后，用DEPC处理水重悬5’末端标记Biotin的RNA链(如图2所示)。图2为实施例1中合成5’末端标记Biotin的RNA的电泳图，其中a是5’末端标记Biotin的RNA适配体；b是5’末端标记Biotin的引物。由图2可知，利用定向改造获取的热稳定DNA聚合酶在合成RNA的时候直接实现对所有RNA产物5’末端的生物素标记。

实施例2制备具有生物活性的5’末端带FAM标记的RNA适配体以及2’-F-C,U修饰的RNA适配体

实施例2中采用的模板和引物序列如表3所示。

表3

1)1×聚合酶缓冲溶液中加入500nM的引物与500nM的模板，混合物于95℃加热5min后，冷却至室温，得到反应体系。

2)向反应体系加入0.5mM NTPs(NTPs包括ATP、UTP、GTP、CTP，所述ATP、UTP、GTP、CTP的浓度相同，均为0.5mM)或含修饰的NTPs混合物(含修饰的NTPs包括ATP、GTP、2’-F-CTP、2’-F-UTP，所述ATP、GTP、2’-F-CTP、2’-F-UTP的浓度相同，均为0.5mM)和1μMSFM4-3聚合酶，混合均匀得到转录体系，转录体系于50℃孵育12h。

3)转录产物(DNA/RNA杂合体)经含8M尿素的15％PAGE胶分离后，切下5’末端标记FAM的RNA适配体以及2’-F-C,U修饰的RNA适配体。

4)含有5’末端标记FAM的RNA适配体以及2’-F-C,U修饰的RNA适配体的PAGE胶块，经枪头挤压破碎后，加入洗脱缓冲液(0.5M乙酸铵，1mM EDTA(pH 8.0)，0.1％SDS)，经45℃水浴处理3h后，用0.22μm过滤器除去碎胶块，保留上清液。向上清液中加入2倍体积的无水乙醇以及总体积1/10的3M乙酸钠，混合液于-2℃静置1h。静置后的混合液于4℃，12000rpm离心10min，弃上清液。沉淀用预冷的70％的乙醇洗3次后，用DEPC处理水重悬5’末端标记FAM的RNA适配体。

5)5’末端标记FAM的RNA适配体以及2’-F-C,U修饰的RNA适配体加入折叠缓冲液(150mMNaCl,2mM CaCl

6)将上一步折叠好的5’末端标记FAM的RNA适配体以及2’-F-C,U修饰的RNA适配体与人的凝血酶于37℃，孵育15min，5’末端标记FAM的RNA适配体以及2’-F-C,U修饰的RNA适配体靶向人凝血酶(如图3所示)。图3为实施例2中测定5’末端标记FAM的靶向人凝血酶的RNA适配体以及2’-F-C,U修饰的RNA适配体的凝血酶结合活性的实验结果图，其中，a和d是5’末端标记FAM的引物；b是靶向人凝血酶的5’末端标记FAM的2’-F-C,U修饰的RNA适配体(2’-F-C,U-RNA)；c是该5’末端FAM标记的2’-F-C,U修饰的RNA适配体与人凝血酶结合的复合物；e是靶向人凝血酶的5’末端标记FAM的RNA适配体；f是该5’末端FAM标记的RNA适配体与人凝血酶结合的复合物。由图3可知，利用定向改造获取的热稳定DNA聚合酶在合成RNA适配体或者2’-F-C，U修饰的RNA适配体的时候直接实现对所有RNA适配体产物5’末端的荧光素标记，并且靶向人凝血酶5’末端标记FAM的RNA适配体和2’-F-C，U修饰的RNA适配体仍然保持活性与功能。

实施例3制备具有生物活性的5’末端带Biotin标记的2’-F-C,U修饰的RNA适配体的方法

实施例3中采用的模板和引物序列如表4所示。

表4

1)1×聚合酶缓冲溶液中加入500nM的引物与500nM的模板。混合物于95℃加热5min后，冷却至室温，得到反应体系。

2)向反应体系加入0.5mM的含修饰的NTPs混合物(含修饰的NTPs包括ATP、GTP、2’-F-CTP、2’-F-UTP，所述ATP、GTP、2’-F-CTP、2’-F-UTP的浓度相同，均为0.5mM)和1μM SFM4-3聚合酶，混合均匀得到转录体系，转录体系于50℃孵育12h。

3)转录产物(DNA/RNA杂合体)经含8M尿素的15％PAGE胶分离后，切下5’末端标记Biotin的RNA适配体。

4)含有5’末端标记Biotin的2’-F-C,U修饰的RNA适配体的PAGE胶块，经枪头挤压破碎后，加入洗脱缓冲液(0.5M乙酸铵，1mM EDTA(pH 8.0)，0.1％SDS)，经45℃水浴处理3h后，用0.22μm过滤器除去碎胶块，保留上清液。向上清液中加入2倍体积的无水乙醇以及总体积1/10的3M乙酸钠，混合液于-20℃静置1h。静置后的混合液于4℃，12000rpm离心10min，弃上清液。沉淀用预冷的70％的乙醇洗3次后，用DEPC处理水重悬5’末端标记Biotin的RNA适配体。

5)将5’末端标记Biotin的2’-F-C,U修饰的RNA适配体加入折叠缓冲液(150mMNaCl,2mM CaCl

6)用靶向人凝血酶5’末端标记Biotin的RNA适配体检测人凝血酶的夹心ELISA实验原理如图4所示，具体操作是：将上一步折叠好的5’末端标记Biotin的2’-F-C,U修饰的RNA适配体加入用人凝血酶铺板并用牛血清蛋白(BSA)封闭、洗涤好的96孔板中，37℃，孵育15min。

7)用折叠缓冲液洗3次孔后，加入1:1000稀释后的辣根过氧化物标记链霉亲和素，室温静置1h。

8)用折叠缓冲液洗6次孔后，加入邻苯二胺盐酸盐(OPD)显色液后，室温静置15-20min显色。

9)读取490nm处的吸光值，对照(不加适配体)读数为：0.075，0.091，0.087；靶向人凝血酶的5’末端标记Biotin的RNA适配体读数为：1.72，1.407，1.651。计算每组的平均值以及标准差后，绘制误差柱状图(如图5所示)。图5为用靶向人凝血酶5’末端标记Biotin的2’-F-C,U修饰的RNA适配体的检测人凝血酶ELISA实验结果图。图5的纵坐标为吸光度490nm，图5的横坐标为对照(不加适配体)和添加适配体。如图5所示，利用定向改造获取的热稳定DNA聚合酶在合成2’-F-C，U修饰的RNA适配体的时候直接实现对所有RNA适配体产物5’末端的生物素标记，并且靶向人凝血酶5’末端标记Biotin的2’-F-C，U修饰的RNA适配体仍然保持活性与功能。

以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 华南理工大学

<120> 一种使用DNA聚合酶突变株高效合成5’标记RNA的方法

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1652

<212> DNA

<213> 水生嗜热菌(Thermusaquaticus)

<400> 1

atggcccagc cggccagccc caaggccctg gaggaggccc cctggccccc gccggaaggg 60

gccttcgtgg gctttgtgct ttcccgcaag gagcccatgt gggccgatct tctggccctg 120

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<210> 2

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<212> DNA

<213> 人工合成(人工序列)

<400> 2

caccaaacgg ggggccagac cctgcagcca aaaaaaaaaa aaaaagttgt gtccctatag 60

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<210> 3

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<212> DNA

<213> 人工合成(人工序列)

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<212> DNA

<213> 人工合成(人工序列)

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<210> 5

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<212> DNA

<213> 人工合成(人工序列)

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<210> 6

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工合成(人工序列)

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<210> 7

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工合成(人工序列)

<400> 7

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