一种检测诊断骨骼发育障碍致病基因的DNA文库及其应用

摘要

本发明涉及一种通过靶向高通量测序技术检测诊断骨骼发育障碍致病基因的DNA文库及其应用，该文库包括507个骨骼发育障碍的致病基因。本发明优选507个骨骼发育障碍致病基因，设计探针池，建立针对507个骨骼发育障碍致病基因的目标区域文库，文库利用高通量测序技术进行测序，寻找致病突变，为临床诊断提供遗传学和分子生物学依据。本发明具有准确、快速、灵活、低成本的特点，本发明涉及的507个基因包括胶原蛋白生成不良、干骺端发育不良、成骨不全及骨密度减少、黏多糖贮积症、软骨发育不良等几乎全部以骨骼发育障碍为临床表现的遗传病的致病基因，对骨骼发育障碍的诊断、鉴别诊断和精准治疗有着重要的意义和临床价值。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种通过靶向高通量测序技术检测诊断骨骼发育障碍致病基因的DNA文库及其应用。

背景技术

骨骼发育障碍(skeletal dysplasia，SD)是一类影响骨和软骨组织组成与结构的遗传性疾病，临床表现为各类骨骼组织生长发育异常，如身材矮小、关节错位、头颅和四肢畸形、脊柱曲度异常、骨密度变化等。该病的发病率约为3/10000，保守估计全国患者有数百万。患者常并发全身不同部位的骨骼畸形，临床上表型不一，以软骨发育不良、成骨不全为最常见类型。一般的症状为身材矮小、关节错位、头颅和四肢畸形、脊柱曲度异常、骨密度变化等。该病病情有时轻微，也可严重至出生前自发流产。但大多在发育阶段快速发展，病情严重，甚至合并其他器官功能障碍，因此一旦发现骨骼发育障碍表现，应及时明确病因，采用有针对性的治疗和咨询。

目前，骨骼发育障碍依其的分子遗传学基础、病因学和表型，包含数十大类几百种类型，例如胶原蛋白生成不良、干骺端发育不良、成骨不全及骨密度减少、黏多糖贮积症、软骨发育不良等，只有利用基因检测才能对骨骼发育障碍做出确诊。目前，临床实验室检测基因突变大多采用传统的Sanger测序法，而如果对骨骼发育障碍的众多致病基因同时检测，不仅工作量巨大，而且导致检测效率低，更重要的是浪费珍贵的DNA样本、明显增加基因诊断的检测成本，严重制约了其在临床分子诊断中的大规模应用。因此，有必要寻求一种新的检测骨骼发育障碍致病基因突变的方法，提高诊断准确率，降低成本和劳动强度并提高时效性。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种能够提高诊断准确率、降低成本和劳动强度的通过靶向高通量测序技术检测诊断骨骼发育障碍致病基因的DNA文库。

本发明的目的之二在于提供所述DNA文库的应用。

本发明的目的通过如下技术方案实现：一种基于高通量测序技术诊断骨骼发育障碍的DNA文库，该文库包括507个骨骼发育障碍致病基因，其中，所述507 个骨骼发育障碍致病基因如下：

ABCC6、ABCC9、ACAN、ACP5、ACTB、ACTG1、ACVR1、ADAMTS10、 ADAMTS17、ADAMTSL2、AGA、AGPS、AKT1、ALDH3A2、ALG9、ALPL、 ALX1、ALX3、ALX4、AMER1、ANKH、ANKRD55、ANO5、ANOS1、ANTXR2、 AP2S1、APC、ARHGAP31、ARID1B、ARSB、ARSE、ARVCF、ASXL1、ATP6V0A2、ATP6V0A4、ATP7A、B3GALT6、B3GAT3、B4GALT7、BAAT、BAZ1B、BGN、 BHLHA9、BMP1、BMP2、BMP4、BMPER、BMPR1B、BRAF、BRF1、BUB1、 BUB1B、BUB3、C21orf2、CA2、CANT1、CASR、CAV1、CC2D2A、CCBE1、 CCDC141、CCDC8、CCNQ、CCR6、CD247、CD96、CDC45、CDC6、CDH3、 CDKN1C、CDT1、CEP120、CEP290、CEP57、CHD7、CHEK2、CHRNA1、 CHRND、CHRNG、CHST14、CHST3、CHSY1、CKAP2L、CLCN5、CLCN7、 CLIP2、COG1、COL10A1、COL11A1、COL11A2、COL1A1、COL1A2、COL2A1、 COL3A1、COL5A1、COL5A2、COL9A1、COL9A2、COL9A3、COLEC11、COMP、 COMT、CORO7-PAM16、CREB3L1、CREBBP、CRTAP、CTGF、CTNNB1、 CTNS、CTSA、CTSC、CTSK、CUL7、CYP26B1、CYP27A1、CYP27B1、CYP2R1、 DCHS1、DDR2、DHCR24、DHODH、DLL3、DLX3、DLX5、DLX6、DMP1、 DNASE1L3、DOCK6、DOK7、DUSP6、DVL1、DYM、DYNC2H1、DYNC2LI1、 EBP、EFNB1、EFTUD2、EIF2AK3、ELN、ENPP1、EOGT、EP300、EPHX1、 ERCC1、ERF、ESCO2、EVC、EVC2、EXT1、EXT2、EXTL3、EZH2、FAH、 FAM111A、FAM20C、FAS、FAT4、FBLN1、FBN1、FBN2、FBXW4、FERMT3、 FEZF1、FGF10、FGF16、FGF17、FGF23、FGF3、FGF8、FGF9、FGFR1、FGFR2、 FGFR3、FIG4、FKBP10、FLNA、FLNB、FLRT3、FMN1、FN1、FREM1、FUCA1、 FZD2、GALNS、GALNT3、GBA、GCDH、GDF3、GDF5、GDF6、GJA1、GJB2、 GJB6、GLB1、GLE1、GLI3、GMNN、GNA11、GNAS、GNE、GNPAT、GNPTAB、 GNPTG、GNS、GORAB、GP1BB、GPC3、GPC6、GPX4、GREM1、GTF2IRD1、 GUSB、HBB、HDAC4、HDAC8、HES7、HESX1、HFE、HGD、HGSNAT、 HIRA、HNF4A、HNRNPA1、HNRNPA2B1、HOXA11、HOXA13、HOXD13、 HPGD、HS6ST1、HSPG2、IARS2、ICK、IDH1、IDH2、IDS、IDUA、IFITM5、IFT122、IFT140、IFT172、IFT43、IFT80、IGF1R、IHH、IKBKG、IL11RA、IL17RD、 IL1RN、IL2RA、IL2RB、IMPAD1、INPPL1、IRF5、IRX5、JAG1、JMJD1C、 KAT6A、KAT6B、KCNJ2、KCNJ8、KIF22、KIF7、KISS1R、KL、KRAS、LBR、 LEMD3、LFNG、LIFR、LIMK1、LMBR1、LMNA、LMX1B、LONP1、LPIN2、 LRP4、LRP5、LTBP2、MAFB、MAN2B1、MAN2C1、MASP1、MATN3、MEGF8、MEOX1、MESP2、MGAT2、MGP、MITF、MKS1、MMP13、MMP2、MMP9、 MNX1、MSX2、MUSK、MYCN、NAGLU、NANS、NDUFS8、NEK1、NEU1、 NF1、NFIX、NIPBL、NKX3-2、NLRC4、NLRP3、NOG、NOTCH2、NOTCH3、NPPC、NPR2、NSD1、NSDHL、NSMCE2、NSMF、OBSL1、OCRL、OFD1、 ORC1、ORC4、ORC6、OSTM1、P3H1、P4HB、PAM16、PANK2、PAPSS2、 PCNT、PCYT1A、PDE3A、PDE4D、PDGFRB、PEX10、PEX11B、PEX12、PEX13、 PEX14、PEX16、PEX19、PEX2、PEX26、PEX3、PEX5、PEX6、PEX7、PHEX、 PHYH、PIGV、PIK3CA、PITX1、PLEKHM1、PLOD1、PLOD2、PLS3、POLR1C、 POLR1D、POP1、POR、PPIB、PPP3CA、PRKAR1A、PROK2、PROKR2、PTDSS1、 PTEN、PTH1R、PTHLH、PTPN11、PTPN2、PTPN22、PYCR1、RAB23、RAB33B、 RAD21、RAPSN、RASGRP2、RB1、RBM8A、RBPJ、RECQL4、RFC2、RMRP、 RNU4ATAC、ROR2、RPGRIP1L、RREB1、RUNX2、SALL1、SALL4、SBDS、 SCARB2、SCARF2、SEC23A、SEC24C、SEC24D、SEMA3A、SERPINF1、 SERPINH1、SETD2、SF3B4、SFRP4、SFTPC、SGSH、SH3BP2、SH3PXD2B、 SHH、SHOX、SKI、SLC17A5、SLC25A12、SLC26A2、SLC29A3、SLC34A1、 SLC34A3、SLC35D1、SLC39A13、SLC40A1、SLC4A1、SLC9A3R1、SLCO2A1、 SLCO5A1、SMAD3、SMAD4、SMARCA2、SMARCAL1、SMC1A、SMC3、 SNRPB、SNX10、SNX22、SOST、SOX10、SOX6、SOX9、SP7、SPAG8、SPARC、 SPECC1L、SPRY4、SQSTM1、SSR4、STAT3、STAT4、SULF1、SUMF1、TACR3、 TBCE、TBL2、TBX1、TBX15、TBX3、TBX4、TBX5、TBX6、TBXAS1、TCF12、 TCIRG1、TCOF1、TCTN3、TGDS、TGFB1、TGFB2、TGFBR1、TGFBR2、 THPO、TJP2、TMCO1、TMEM165、TMEM216、TMEM38B、TMEM67、TNFRSF11A、TNFRSF11B、TNFSF11、TP53、TP63、TRAPPC2、TREM2、TRIP11、 TRIP13、TRPS1、TRPV4、TTC21B、TWIST1、TYK2、TYROBP、UROS、VCP、 VDR、VPS33A、WDR11、WDR19、WDR34、WDR35、WDR60、WISP3、WNT1、WNT10B、WNT3、WNT5A、WNT6、WNT7A、XYLT1、XYLT2、ZMPSTE24。

本发明提供的DNA文库覆盖了胶原蛋白生成不良、干骺端发育不良、成骨不全及骨密度减少、黏多糖贮积症、软骨发育不良等几乎全部以骨骼发育障碍为临床表现的遗传病，包含507个骨骼发育障碍致病基因。这507个基因选择基于国际已报道和公认的临床致病基因数据库(OMIM数据库、HGMD数据库、 ClinVar数据库)。这507个基因上的致病基因变异既可以单独致病，也可以联合致病导致更加严重和复杂的临床表型，本发明首次做到可以一次性全面的对它们进行测序。

本发明根据507个骨骼发育障碍致病基因，设计能覆盖上述基因外显子及毗邻±20bp内含子区域的探针池，利用探针靶向捕获建立含有507个骨骼发育障碍致病基因的目标区域文库，文库利用高通量测序技术进行测序，寻找致病突变，明确骨骼发育障碍的遗传学病因，为临床诊断提供遗传学和分子生物学的理论依据。

本发明还提供一种上述DNA文库在制备诊断试剂盒中的应用，所述试剂盒用于寻找骨骼发育障碍的致病基因，进而用于诊断骨骼发育障碍。

进一步，所述应用包括下列步骤：

1)收集骨骼发育障碍患者的临床资料及临床生物样本，优选的，所述的临床生物样本是指来源于人体的各类样本，包括但不限于来自受检者的外周血、体液、组织器官样本，如受检者的唾液、毛发或口腔黏膜等。

2)提取样本的基因组DNA，优选的，提取方法包括DNA提取试剂盒或各种手工提取方法；

3)对提取的基因组DNA进行定量，并构建文库，优选的，所述定量方法包括但不限于荧光定量方法和电泳；其中，构建文库包括如下步骤：

a)将基因组DNA进行片段化，优选的，所述片段化方法包括但不限于超声破碎、转座酶酶切和限制性内切酶酶切；

b)将片段化的基因组DNA进行末端修复的同时进行3'末端加A；

c)将3'末端加A的产物连接接头，以便进行有效连接产物的扩增，优选的，所述链接接头来自于高通量测序建库试剂盒；

d)将连接产物利用通用引物进行PCR扩增，加上完整的接头，优选的，所述通用引物来自于高通量测序建库试剂盒；

e)使用针对上述507个骨骼发育障碍致病基因的探针靶向捕获目标区域，优选的，所述捕获方法包括但不限于液相探针捕获和固相芯片杂交捕获；

f)将未捕获的文库清洗掉，仅保留目标区域文库；

j)获得目标区域捕获文库。

4)对文库进行定量操作，优选的，所述定量方法包括但不限于荧光定量方法和电泳；

5)利用测序设备对文库进行高通量测序，优选的，所述测序设备包括但不限于Novaseq系列、Hiseq系列、Nexeseq系列、BGIseq系列第二代核酸测序仪；

6)将得到的测序数据进行生物信息学比对，并通过变异解读得到致病位点相关信息。

一种诊断试剂盒，所述试剂盒包括所述的DNA文库。

较之现有技术而言，本发明的优点在于：

1.骨骼发育障碍与多种遗传性疾病有关，其严重程度不一，临床表现多样，从出生前死亡到仅表现为脊柱侧弯，甚至无明显症状，临床很难做出准确的病因学诊断，由于骨骼发育障碍可能伴有心脏病、脑病等严重的并发症或其他症状，因此确定致病基因是骨骼发育障碍临床正确诊断的关键。本发明旨在建立一种快速、准确、高通量检测骨骼发育障碍致病基因的新方法，从而帮助了解发病机制，辅助临床诊断、预后判断、产前诊断和精准治疗奠定基础。

2.基因诊断有助于临床遗传咨询和产前诊断等。通过临床遗传咨询，家属可了解自身的患病可能；患者父母或本人可通过基因检测指导生育，确保将来生育后代的健康。骨骼发育障碍常常是遗传疾病的临床表型之一，只有进行基因检测才能够提供准确的健康和生殖指导。发现家系中尚无症状的年幼致病基因携带者也有助于更早制定家庭医疗和康复计划。

3.本申请的DNA文库是发明人在多年开展高通量基因检测服务积累大量中国骨骼发育障碍临床病例的基础上，查阅大量文献，并采用ClinGen等权威数据库提供的疾病-基因相关性筛选方法，最终优选的507个骨骼发育障碍致病基因，兼顾了全面性、准确性和科学性，这些基因的绝大多数均为发明人在汉族人群中发现的致病基因，尤其适合包括中国人在内的黄色人种患者的检测。本发明优选507个骨骼发育障碍致病基因，设计探针池，建立针对507个骨骼发育障碍致病基因的目标区域文库，文库利用高通量测序技术进行测序，寻找致病突变，为临床诊断提供遗传学和分子生物学依据。本发明具有准确、快速、灵活、低成本的特点，本发明涉及的507个基因检测区域能够检测胶原蛋白生成不良、干骺端发育不良、成骨不全及骨密度减少、黏多糖贮积症、软骨发育不良等几乎全部以骨骼发育障碍为临床表现的遗传病，对骨骼发育障碍的诊断和鉴别诊断有着重要的意义和临床价值。

4.本发明中采用高通量测序技术对目标区域捕获文库进行测序，能够在一次测序反应中同时检测本发明中涉及的507个骨骼发育障碍致病基因的全部外显子及其毗邻区域。与传统测序技术相比，本发明的检测效率显著提高、成本显著降低，在骨骼发育障碍基因挖掘和致病基因筛查方面具有巨大优势，是高效、可信、经济的骨骼发育障碍致病基因检测技术。

5.综合来看，本发明中涉及的DNA文库及其应用具有准确、灵活、快速、低成本的特点；经过临床评估，该发明对骨骼发育障碍具有很好的辅助诊断价值。

附图说明

图1是实施例1中对先证者样本的507个骨骼发育障碍致病基因建立目标区域靶向DNA文库的质控信息；

图2是实施例1中对先证者样本的507个骨骼发育障碍致病基因的目标区域进行测序的数据覆盖信息；

图3是实施例1中对先证者样本的507个骨骼发育障碍致病基因的目标区域进行测序的数据量信息；

图4是实施例1中所述的骨骼发育障碍家系的家系图谱，图中箭头指向的是先证者，实心图标表示为患者，空心图标表示为健康个体。

具体实施方式

本发明提供了一种检测诊断骨骼发育障碍致病基因的DNA文库及其应用，下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明，根据本发明的一个实施例，通过高通量测序平台进行测序，优选Illumina Hiseq平台，并进行数据分析，通过确定骨骼发育障碍表现者是否携带致病基因，判断其是否为骨骼发育障碍患者。

若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》第四版或者相关资料进行，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

实施例1：

本实施例是采用Illumina公司的Hiseq测序平台对受检人外周血基因组 DNA进行检测，具体实施步骤如下：

1.样本来源

来自中国山东省的一个先天性骨骼发育障碍患儿，先证者为12岁男性，先证者8岁以前同正常儿童，8岁以后反复发生多部位骨折：单侧锁骨骨折、右下肢胫、腓骨骨折在轻体力活动后发生骨折。查体：体格及智力发育正常，毛发无异常，蓝色巩膜，听力正常。实验室检查：血常规、自身抗体正常、血沉正常、肝肾功能无异常。其家庭成员健康，否认与骨骼发育障碍家族史。该家系的家系谱如图4所示，箭头指向的是先证者，实心图标表示为患者，空心图标表示为健康个体。共有3名家系成员参与检测，包括先证者(患病)、先证者母亲(健康)、先证者父亲(健康)，获得先证者父母的知情同意书，从该实施例家系成员的肘静脉采集静脉血10mL(EDTA抗凝处理)，用于检测。

2.标本基因组DNA的提取：

按照商家提供的说明书操作，使用Magen公司的基因组DNA提取试剂盒 (HiPureBlood&Tissue DNA Kit)从外周血样本中提取基因组DNA，使用 Nanodrop one测量DNA的纯度，所得基因组DNA的OD

3.基因组扩增文库的建立：

按照商家提供的说明书操作，使用KAPA公司的试剂盒(KAPA HyperPlus LibraryPreparation Kit)对基因组DNA进行酶切片段化、末端修复、3'末端加A、链接接头和PCR扩增，最后对获得文库进行定量和质检，具体实施步骤如下：

1)基因组DNA片段化反应，反应体系如下：

反应条件：37℃反应12min。

2)末端修复和3'末端加A反应，反应体系如下：

反应条件：20℃反应1min；65℃反应30min；20℃恒温

3)接头链接反应，反应体系如下：

反应条件：20℃反应20min。

4)第一次PCR扩增反应，反应体系如下：

反应条件：98℃45s；(98℃15s，60℃30s，72℃30s)×6cycles；72℃1min； 12℃保存。

5)DNA定量和质检：

使用Nanodrop one测量PCR扩增产物的浓度和条带分布情况；配置2％琼脂糖凝胶，将获得PCR扩增产物与上样缓冲液混合，电泳观察条带的位置、亮度、均一性，条带大小在200-800bp之间为合格。

4.基于探针杂交捕获构建目标区域靶向DNA文库：

按照商家提供的说明书操作，文库的构建采用IGT公司的文库构建试剂盒，探针根据候选的507个骨骼发育障碍致病基因序列设计，合成并生物素标记，具体实施步骤如下：

1)探针杂交：

将步骤3获得PCR产物5μg与5μL Cot-1human DNA混合，涡旋振荡；根据总体积，加入2.5×Ampure XP beads，混匀离心，室温静置5min；上述磁珠用 80％的乙醇离心清洗2次，用杂交液洗脱并进行杂交反应，杂交液的体系如下：

杂交条件：95℃反应10min；65℃过夜

2)使用80μL链霉亲和素标记的磁珠(M-270Streptavidin beads)，通过生物素与链霉亲和素结合，将杂交有样品目标序列的探针捕获到磁珠上。利用200μL 的1×BeadWash Buffer依次在65℃和室温洗涤三次，每次3min，最后磁珠用 20μL NF H

3)对捕获到的目标序列进行第二次PCR扩增反应，反应体系如下：

反应条件：98℃45s；(98℃15s,60℃30s,72℃30s)×7cycles；72℃1min；4℃保存。

5)PCR产物定量和质检：

使用Nanodrop one测量PCR扩增产物的浓度和条带分布情况；配置2％琼脂糖凝胶，将获得PCR扩增产物与上样缓冲液混合，电泳观察条带的位置、亮度、均一性，条带大小在200-800bp之间为合格。

5.测序数据的生信分析和变异解读：

使用Novocraft NovoAlign将NGS测序结果和人类参考基因组UCSC NCBI37/hg19进行比对，获得比对到基因组上的唯一比对序列。利用VarScan mpileup2snp和VarScanmpileup2indel检测确定507个骨骼发育障碍致病基因区域的变异。利用Remove RunCommon Variants和Remove Global Common Variants软件去除dbSNP和ExAC数据库中的常见变异。然后利用Interactive Biosoftware Alamut Batch对变异进行注释。注释用到的数据库包括：dbSNP、 ExAC、1000g、ClinVar、OMIM等，并利用FATHMM、FATHMMMKL、METALR、METASVM、MUTATIONASSESSOR、MUTATIONTASTERAGVGD、AGVGD、 LRT、PROVEAN、SIFT软件进行变异功能预测。根据《ACMG遗传变异分类标准与指南》，分析得到对骨骼发育障碍诊断有意义的突变位点。

6.测序结果说明及分析

通过本发明中提供的一种检测诊断骨骼发育障碍致病基因的DNA文库，一次性对3个受检者的507个骨骼发育障碍致病基因进行测序。以先证者为例，经质控分析，所得DNA文库大小主要分布在200-800bp，平均长度为496bp，浓度和片段大小符合测序要求，提示文库构建质量合格(如图1)。DNA文库包括507个基因的编码区长度为3942109bp，非编码区长度为766722bp，共计 4708831bp。其中编码区的10×覆盖度为99.47％，20×覆盖度为99.34％，50×覆盖度为95.78％(如图2)。总共获得7065041个片段读长数据(TotalReads)，匹配率(Aligned)为86.87％(如图3)。以上测序结果满足变异解读的数据要求。经过对测序数据的分析，发现与受检者临床表型相关的，骨骼发育障碍(成骨不全)的致病基因变异，如下表所示：

受检者COL1A1基因发现一杂合变异，NM_000088.3:c.159del(p.Trp53*)。 COL1A1常染色体显性变异与Ehlers-Danlos综合征I型和VII型(Ehlers-Danlos syndrome,typesI and VII)、成骨不全I-IV型(osteogenesis imperfecta,types I-IV) 和Caffey病的发生相关(PubMed：20301472，22855962；OMIM：120150)。

成骨不全(Osteogenesis imperfecta,OI)又称脆骨病、瓷娃娃，是一组罕见的遗传性疾病，患儿易发骨折，即使轻微的碰撞也会造成严重骨折，部分亚型有蓝巩膜的典型表现。成骨不全I型主要是由于胶原蛋白I减少导致骨脆性和蓝巩膜的表现；成骨不全II型患者症状最为严重，表现为长骨严重弯曲、骨折，常于围产期死亡；成骨不全III型表现为反复多次骨折、骨骼畸形，症状进行性加重，最终身材矮小，部分患者有蓝巩膜；成骨不全IV型表型变异较大，严重程度不一，本型可无骨折而仅表现为骨质疏松、骨质脆弱，一般巩膜正常。

c.159del(p.Trp53*)变异导致了一个提前终止密码子，可能引起蛋白截短或激活无义介导的mRNA降解，从而影响COL1A1基因编码蛋白产物的功能。该变异尚无文献报道，相同氨基酸位置的另一无义变异(c.158G>A,p.Trp53*)已在成骨不全患者中报道过(PubMed：30886339)。该变异在先证者父母的DNA 样本中未检出，提示该变异为新发的致病变异。该致病变异提示先证者为成骨不全患者，成功实现了临床精准诊断。患者属于成骨不全的迟发型，临床表现相对较轻，预防骨折主要是避免不必要的运动损伤。迟发型有逐渐好转的倾向，无需特殊治疗，如再出现骨折，可考虑缩短固定时间，防止广泛骨萎缩。对于遗传咨询，由于该变异为新发，患者父母生育成骨不全后代的再发风险较低，通常低于1％。由于该疾病为常染色体显性遗传病，患者有1/2几率生育患病子女。(如图4)

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“该实施例”、“实施例”等的描述意指结合该实施例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例中，且不做特定指代。

需要说明的是，尽管在本文中已经对上述实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。