基于飞行时间质谱平台的rooptag不对称多重PCR检测心血管疾病用药基因的方法

摘要

本发明公布了核酸质谱技术检测心血管疾病用药相关基因的核酸组合物、试剂盒和检测方法，涉及一种检测心血管疾病用药基因的试剂盒及检测方法，试剂盒包括11种基因17个突变位点的检测试剂，针对11种基因出现的异常的基因变异位点，设计每个位点的带Roop结构的扩增引物，无需繁琐的单碱基延伸及后续纯化等处理步骤，可以快速地完成上机前的样本预处理流程，进而进行质谱分析其特异性的产物，判定每一个位点的基因型，其检测特异性强、灵敏度高，可应用于科研、药物疗效研究、心血管疾病相关调查、以及心血管临床用药指导。

说明书

技术领域

本发明属于飞行时间质谱基因检测技术领域，涉及一种检测心血管疾病用药基因的试剂盒，具体涉及人类样本中心血管疾病用药相关的11种基因17个突变位点的检测。针对11种基因出现的异常的基因变异位点，设计每个位点的rooptag引物引物组合，通过不对称多重PCR，进而进行质谱分析其特异性的产物，判定每一个位点的基因型。本发明及应用涉及的技术领域是医学检验和核酸质谱技术。

背景技术

心血管疾病是全球人类健康的首要疾病负担，心血管疾病严重威胁着中国人的健康，我国心血管病的发病率和死亡率呈快速上升趋势，具有患者基数大，死亡率高的特点。根据《中国心血管病报告2019》数据，心血管病现患人数3.30亿，其中脑卒中1300万，冠心病1100万，肺原性心脏病500万，心力衰竭890万，风湿性心脏病250万，先天性心脏病200万，下肢动脉疾病4530万，高血压2.45亿。农村和城市心血管病分别占死因的45.91%和43.56%。

随着基因检测技术的普及，临床用药经逐渐发展为个性化用药阶段。药物基因组学正是通过研究不同基因型对药物药效和毒性的不同反应，进而为携带不同基因型的个体临床用药提供差异化指导。通过精准用药指导，可以降低患者不良心血管事件发生的风险，以期达到“精准医疗”、“个性化用药”、“合理用药”的目标。

高血压和心血管疾病是复杂疾病，由多个微效基因与环境因素长期相互作用所致。鉴定出与高血压和/或血压升高相关的易感基因和/或致病基因，在人群中筛选增加疾病风险的易感基因确定易感个体，将有助于高血压和心血管疾病事件(冠心病和脑卒中)的发病风险预测、新药开发、诊断和个体化治疗。

基因检测是诊断医学和分子生物学研究的重要工具在诸如以下方面起到重要的作用：病原体如真菌，细菌和病毒检测，遗传病筛查，疾病精准用药，肿瘤筛查，法医鉴定等各个领域。

国家卫生计生委印发的《医疗机构临床检验项目目录2013年版》中“五、临床分子生物学及细胞遗传学检目录下用药指导的分子生物学检验”推荐进行CYP2D6*10、CYP2C9*3、ADRB1(1165G>C)、AGTR1(1166A>C)、ACE(I/D)、CYP2C19、CYP2C9、VKORC1、MTHFR(C677T)以及APOE基因检测。

目前药物用药相关基因检测产品已有获批，考虑到临床上心血管疾病多伴有其他并发症，患者常有多药物联用的情况，但由于药物间的相互作用、患者自身情况等多方面因素的影响，易导致不良反应的发生。所以针对心血管常用药，基因检测能更有效地指导患者用药。

基因检测技术平台主要包括：Taqman 探针法、Sanger测序法、飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）分型、HRM（高分辨率熔解曲线）、杂交法、高通量测序等技术平台。其中，基于时间飞行质谱（MALDI-TOF）完成的核酸检测比如SNP检测准确率可达99.9%，除了准确性高、灵活性强、通量大、检测周期短等优势外，最有吸引力的应该还是它的性价比。以SNP为例，飞行时间质谱平台（MALDI-TOF）是国际通用的基因单核苷酸多态性（SNP）的研究平台，该方法凭借其科学性和准确性已经成为该领域的新标准。

MALDI-TOF MS(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time ofFlight mass spectrometry)，即基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪，是20世纪80年代发展起来的一种新型软电离质谱，具有灵敏度高、检测速度快、样本用量少、高通量等特点。MALDI-TOF质谱仪检测的基本原理为分析物样本和基质形成共结晶，当用激光轰击共结晶体的时候，基质吸收能量并将其传递给分析物，辅助分析物分析解吸附并实现离子化，由固态变为气态离子。带电荷的离子，经加速电压通过飞行时间离子分离器，进而被离子检测器所检测。这个过程中，因为离子质量大小不同，飞行到达检测器时间的长短不同，最后将质量不同的离子根据质荷比分离开来，形成质谱图。

目前基于单碱基引物延伸原理的核酸质谱法得到了广泛的应用，尤其是飞行时间质谱在 SNP 分型检测市场上得到了广泛的应用，较成熟的方法包括：MassExtend assay，iPLEX assay， PinPoint assay，GOOD assay 等，他们有一个共同点，都是通过精确测量延伸产物的分子量，从而判断样品中耐药基因是否存在。

如Agena的iPlex技术如下：1）首先通过PCR扩增出含有SNP位点的一段DNA（SNP位点前后各50bp左右），2）用SAP酶去除掉PCR 体系中剩余的脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）和引物，3）加入一个6-15nt的DNA探针，其3’末端碱基紧挨SNP位点，采用四种ddNTP替代dNTP。这样，探针在SNP位点处仅延伸一个碱基，连接上的ddNTP与SNP位点的等位基因对应4）基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS) 检测延伸产物与未延伸引物间的分子量差异，确定该点处碱基。

单碱基引物延伸存在以下问题：1）SNP由于只存在单个碱基的差异，某些特殊SNP位点的检测可能存在分辨率不够的问题；2）操作复杂繁琐，容易形成污染；3）对SNP而言，只能针对变异位点进行检测，其他位点如果发生变异，无法检测；4）灵敏度不够，对肿瘤组织或者液体样本种存在的稀有变异无法检出。

发明内容

本发明的目的是提供一种与心血管疾病个性化用药相关基因多态性检测的复合扩增体系及其使用方法。该体系具有操作简单、特异性强、灵敏度高、通量高、可靠性强和成本低的明显领先市场上现有的单碱基延伸方法的显著优势。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1.包括11种基因17个突变位点的检测试剂，所述11种基因17个突变位点为VKORC1基因c.1173C>T和c.-1639G>A位点，CYP2C9基因c.430C>T和c.1075A>C位点；CYP2D6基因c.100C>T位点，ADRB1基因c.1165G>C位点，ACE基因I/D位点，AGTR1基因c.1166A>C位点，MTHFR基因C677T位点，SLCO1B1基因c.388A>G和c.521T>C位点，APOE基因c.388T>C和c.526C>T位点，CYP2C19基因c.681G>A、c.636G>A和c.-806C>T位点，ALDH2基因c.1510G>A位点；

2.优选的，所述11种基因17个突变位点的检测试剂含有SEQ ID NO.1与SEQ IDNO.2，SEQ ID NO.3与SEQ IDNO.4，SEQ ID NO.5与SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7与SEQ IDNO.8，SEQ ID NO.9与SEQ IDNO.10，SEQ ID NO.11与SEQ ID NO.12，SEQ ID NO.13与SEQ IDNO.14，SEQ ID NO.15与SEQID NO.16，SEQ ID NO.17与SEQ ID NO.18，SEQ ID NO.19与SEQID NO.20，SEQ ID NO.21与SEQ ID NO.22，SEQ ID NO.23与SEQ ID NO.24，SEQ ID NO.25与SEQ ID NO.26，SEQ IDNO.27与SEQ ID NO.28，SEQ ID NO.29与SEQ ID NO.30或SEQ IDNO.31，SEQ ID NO.32与SEQ ID NO.33，SEQ ID NO.34所示的引物对；

3.11种基因17个突变位点的检测试剂还包括常规野生型引物，所述常规野生型引物如SEQ IDNO.35～SEQ ID NO.51所示；

4.所述rooptag引物是由野生型抑制性rooptag上游引物，常规野生型引物特异性引物，tag引物以及常规下游引物组合，野生型抑制性rooptag上游引物是由3部分序列构成5端MGB修饰，并且和变异位点区域野生型有10-15bp互补，该互补区域覆盖SNP等变异位点，3端在SNP等变异位点上游3-5bp处，与5端序列存在这2-4bp的重叠，中间为tag区域，根据不同的检测靶标可以设计不同的tag，野生型抑制性rooptag上游引物只有在引物5端序列互补模板存在变异时，才会扩增模板，该引物只有在引物5端序列互补模板存在变异时，才会扩增模板，否则野生型抑制性rooptag上游引物不扩增；

5.本发明的目的之二在于提供所述试剂盒用于检测心血管疾病用药相关基因的方法，包括如下步骤：

所述试剂盒用于检测心血管疾病用药相关基因的方法，包括如下步骤：

1) 制备待测样本基因组DNA，所以样本为来源于人的血液、唾液、口腔拭子、粪便、发根、血斑、干血纸；

2) 以提取的基因组DNA为模板，SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.51所示引物混合一管后进行不对称多重PCR扩增，扩增产物无需SAP酶消化处理和单碱基延伸反应，反应结束后直接使用基质辅助激光解离吸附电离飞行时间质谱，最后Typer软件分析检测位点的基因型；

6.发明的有益效果在于：

1) 一步PCR即可完成，无需无需虾碱性磷酸酶（SAP）处理和单碱基延伸繁琐等步骤，大大减少检测时间，并且减少污染发生概率；

2) 通过rooptag引物上的多个碱基序列差异来SNP单碱基差异的信号，显著提高飞行时间质谱平台检测SNP尤其是重复序列干扰下的分辨率和准确性；

3) 检测灵敏度大大提高，不但可以检测常规的SNP变异，病原体核酸等，还可以检测肿瘤组织或者液体样本种的稀有变异；

4) 可以检测未知变异：不但可以检测已知SNP位点，还可以检测未知的SNP，微小缺失等变异。

具体实施方式

1.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定：

基于文献调研和专业数据库查询，最终选择了11个基因的17个变异位点：VKORC1(c.1173C>T、c.-1639G>A)，CYP2C9(c.430C＞T、c.1075A＞C)，CYP2C19(c.681G>A、c.636G>A、 c.-806C>T)，ALDH2(c.1510G＞A)，CYP2D6(c.100C>T)，ADRB1(c.1165G>C)，AGTR1(c.1166A>C)，ACE(289bp deletion)，MTHFR(c.665C>T)，APOE(c.388T＞C、c.526C>T)，SLCO1B1(c.388A>G、c.521T>C)。这些位点覆盖了对华法林、氯吡格雷、高血压治疗药物、硝酸甘油、他汀类五大类一线心血管用药基因的常见变异位点。

2.通过设计覆盖以上位点的rooptag多重PCR引物系列、野生型特异引物和下游引物，结合基质辅助激光解离吸附飞行时间质谱技术，进行位点的高效、准确、低成本、快速的检测。

设计的引物序列如下所示：

1) rooptag多重PCR引物系列和下游引物对：

基因位点 CYP2D6c.I00C>T 引物对 1

野生型抑制性Roop tag上游引物

MGB-GGCAGGTtgggtacgagctaccAAGGTTATGGCTGTAGTTGTGACGTTGGATGCCATTTGGTAGTGAGGCAGGT(SEQIDNO.1)

下游引物 ACGTTGGATGGCCATGTATAAATGCCCCTC(SEQ ID NO.2)

野生型特异性上游引物 ggttgggtacgagctacc tgggtacgagctac；

基因位点 MTHFRC677T 引物对 2

野生型抑制性Roop tag上游引物

MGB-AATGTGaggtgtctgcgggagcAAGGTTATGGCTGTAGTTGTGACGTTGGATGTCACAAAGCGGAAGAATGTG(SEQIDNO.3)

下游引物 ACGTTGGATGCTTTGAGGCTGACCTGAAGC(SEQ ID NO. 4)

野生型特异性上游引物 gtgaggtgtctgcgggagc aggtgtctgcgggag；

基因位点 CYP2C9c.430C>T 引物对 3

野生型抑制性Roop tag上游引物

MGB-GATGGgaggagtattgaggaccAAGGTTATGGCTGTAGTTGTGACGTTGGATGCTGCGGAATTTTGGGATGG(SEQIDNO.5)

下游引物 ACGTTGGATGCAGTGATATGGAGTAGGGTC(SEQIDNO.6)

野生型特异性上游引物 GGTCgaggagtattgaggacc gaggagtattgaggac；

基因位点 AGTRIc.l166A>C 引物对 4

野生型抑制性Roop tag上游引物

MGB-TACCAAtccacgcccaaatgagcaAAGGTTATGGCTGTAGTTGTGACGTTGGATGCTGCAGCACTCCACTACCAA(SEQIDNO.7)

下游引物 ACGTTGGATGTCAGAGCTTTAGAAAAGTCG(SEQID NO.8)

野生型特异性上游引物 TACCAAtccacgcccaaatgagca tccacgcccaaatgagc；

基因位点 VKORCIc.1173C>T 引物对 5

野生型抑制性Roop tag上游引物

MGB-CTGACGgccaggaaaccatcgaccAAGGTTATGGCTGTAGTTGTGACGTTGGATGAGTGACATGGAATCCTGACG(SEQ IDNO.9)

下游引物 ACGTTGGATGACCTGGGCTATCCTCTGTTC(SEQIDNO.10)

野生型特异性上游引物 GACGgccaggaaaccatcgacc gccaggaaaccatcgac；

基因位点 ADRBIc.1165G>C 引物对 6

野生型抑制性Roop tag上游引物

MGB-CGCGTGctcgcgcagcagagcagtcgAAGGTTATGGCTGTAGTTGTGACGTTGGATGGGTCTCCGTGGGTCGCGTG(SEQIDNO.11)

下游引物 ACGTTGGATGAACCCCATCATCTACTGCCG(SEQIDNO.12)

野生型特异性上游引物 tgctcgcgcagcagagcagtcg ctcgcgcagcagagcagtc；

基因位点 APOEc.388T>C 引物对 7

野生型抑制性Roop tag上游引物

MGB-TGCAGGcgtgatgacctgcagaagtAAGGTTATGGCTGTAGTTGTGACGTTGGATGCTGTCCAAGGAGCTGCAGG(SEQID NO.13)

下游引物 ACGTTGGATGGAGCATGGCCTGCACCTCG(SEQID NO.14)

野生型特异性上游引物 gaccgtgatgacctgcagaagt gcgaccgtgatgacctgcagaag；

基因位点 CYP2C9c.1075A>C 引物对 8

野生型抑制性Roop tag上游引物

MGB-CCACATctaacgaggtccagagatacaAAGGTTATGGCTGTAGTTGTGACGTTGGATGATGCAAGACAGGAGCCACAT(SEQID NO.15)

下游引物 ACGTTGGATGTGTCACAGGTCACTGCATGG(SEQ ID NO.16)

野生型特异性上游引物 cactaacgaggtccagagataca ctaacgaggtccagagatac；

基因位点 VKORCIc.1639G>A 引物对 9

野生型抑制性Roop tag上游引物

MGB-TCTTAAccctcgtgagccaccgcaccgAAGGTTATGGCTGTAGTTGTGACGTTGGATGGTTGGCCAGGCTTGTCTTAA(SEQ ID NO.17)

下游引物 ACGTTGGATGGTCAAGCAAGAGAAGACCTG(SEQ ID NO.18)

野生型特异性上游引物 TAAccctcgtgagccaccgcaccg ccctcgtgagccaccgcacc；

基因位点 CYP2C19c.681G>A 引物对 10

野生型抑制性Roop tag上游引物

MGB-GGTTGccagtaatttgttatgggttccgAAGGTTATGGCTGTAGTTGTGACGTTGGATGCAATAAAGTCCCGAGGGTTG(SEQ ID NO 19)

下游引物 ACGTTGGATGGATATGCAATAATTTTCCCAC(SEQ ID NO.20)

野生型特异性上游引物 agtaatttgttatgggttccg ccagtaatttgttatgggttcc；

基因位点 CYP2C19c.636G>A 引物对 11

野生型抑制性Roop tag上游引物

MGB-TGTAAGacacttggccttacctggatgAAGGTTATGGCTGTAGTTGTGACGTTGGATGGACTGTAAGTGGTTTCTCAG(SEQ IDNO.21)

下游引物 ACGTTGGATGAACATCAGGATTGTAAGCAC(SEQ ID NO.22)

野生型特异性上游引物 acacttggccttacctggatg acacttggccttacctggat；

基因位点 CYP2C19c.806C>T 引物对 12

野生型抑制性Roop tag上游引物

MGB-CAAACGccgtgtcttctgttctcaaagcAAGGTTATGGCTGTAGTTGTGACGTTGGATGAACAAAGITTTAGCAAACG(SEQIDNO.23)

下游引物 ACGTTGGATGGGAIITGAGCTGAGGTCTTC(SEQ ID NO.24)

野生型特异性上游引物 cgtgtcttctgttctcaaagc ccgtgtcttctgttctcaaag；

基因位点 SLCO1B1c.388A>G 引物对 13

野生型抑制性Roop tag上游引物

MGB-ATAAGGgatgttgaattttctgatgaatAAGGTTATGGCTGTAGTTGTGACGTTGGATGATTAAACAAGTGGATAAGG(SEQID NO.25)

下游引物 ACGTTGGATGGATGTTCTTACAGTTACAGG(SEQ ID NO.26)

野生型特异性上游引物 gatgttgaattttctgatgaata gatgttgaattttctgatgaat；

基因位点 APOEc.526C>T 引物对 14

野生型抑制性Roop tag上游引物

MGB-CGTAAGgcgaccgtgatgacctgcagaagcAAGGTTATGGCTGTAGTTGTGACGTTGGATGACCTGCGCAAGCTGCGTAAG(SEQID NO.27)

下游引物 ACGTTGGATGGCCCCGGCCIGGTACACTG(SEQ ID NO.28)

野生型特异性上游引物 gaccgtgatgacctgcagaagc gcgaccgtgatgacctgcagaag；

基因位点 SLCOIB1c.521T>C 引物对 15

野生型抑制性Roop tag上游引物

MGB-TGTGGcttggtcatacatgtggatatatgtAAGGTTATGGCTGTAGTTGTGACGTTGGATGAATCTGGGTCATACATGTGG(SEQID NO.29)

下游引物 ACGTTGGATGTATGGGAGTCTCCCCTATTC(SEQ ID NO.30)

野生型特异性上游引物 tggtcatacatgtggatatatgtcttggtcatacatgtggatatatg；

基因位点 ACE I/D 引物对 16

野生型抑制性Roop tag上游引物

MGB-CCATCAgctgcctatacagtcacttttaAAGGTTATGGCTGTAGTTGTGACGTTGATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT(SEQIDNO.31)

下游引物 ACGTTGGACTGGAGACCACTCCCATCCTTT(SEQ ID NO.32)

野生型特异性上游引物 gctgcctatacagtcactttta gctgcctatacagtcactttt；

基因位点 ALDH2c.1510G>A 引物对 17

野生型抑制性Roop tag上游引物

MGB-ccacactcacagttttcacttctgaagAAGGTTATGGCTGTAGTTGTGacgttggatgctgagtccccggcaggtcctgaa(SEQIDNO.33)

下游引物 acgttggatgttggtggctacaagatgtcg(SEQ ID NO.34)

野生型特异性上游引物 cactcacagttttcacttctgaag ccacactcacagttttcactt。

2)野生型特异引物：

基因位点 CYP2D6c.I00C>T 引物对 1

野生型特异性上游引物 ggttgggtacgagctacc(SEQIDNO.35)；

基因位点 MTHFRC677T 引物对 2

野生型特异性上游引物 gtgaggtgtctgcgggagc(SEQIDNO.36)；

基因位点 CYP2C9c.430C>T 引物对 3

野生型特异性上游引物 GGTCgaggagtattgaggacc(SEQIDNO.37)；

基因位点 AGTRIc.l166A>C 引物对 4

野生型特异性上游引物 TACCAAtccacgcccaaatgagca(SEQIDNO.38)；

基因位点 VKORCIc.1173C>T 引物对 5

野生型特异性上游引物 GACGgccaggaaaccatcgacc(SEQIDNO.39)；

基因位点 ADRBIc.1165G>C 引物对 6

野生型特异性上游引物 tgctcgcgcagcagagcagtcg(SEQIDNO.40)；

基因位点 APOEc.388T>C 引物对 7

野生型特异性上游引物 gaccgtgatgacctgcagaagt(SEQIDNO.41)；

基因位点 CYP2C9c.1075A>C 引物对 8

野生型特异性上游引物 cactaacgaggtccagagataca(SEQIDNO.42)；

基因位点 VKORCIc.1639G>A 引物对 9

野生型特异性上游引物 TAAccctcgtgagccaccgcaccg(SEQIDNO.43)；

基因位点 CYP2C19c.681G>A 引物对 10

野生型特异性上游引物 agtaatttgttatgggttccg(SEQIDNO.44)；

基因位点 CYP2C19c.636G>A 引物对 11

野生型特异性上游引物 acacttggccttacctggatg(SEQIDNO.45)；

基因位点 CYP2C19c.806C>T 引物对 12

野生型特异性上游引物 cgtgtcttctgttctcaaagc(SEQIDNO.46)；

基因位点 SLCO1B1c.388A>G 引物对 13

野生型特异性上游引物 gatgttgaattttctgatgaata(SEQIDNO.47)；

基因位点 APOEc.526C>T 引物对 14

野生型特异性上游引物 gaccgtgatgacctgcagaagc(SEQIDNO.48)；

基因位点 SLCOIB1c.521T>C 引物对 15

野生型特异性上游引物 tggtcatacatgtggatatatgt(SEQIDNO.49)；

基因位点 ACE I/D 引物对 16

野生型特异性上游引物 gctgcctatacagtcactttta(SEQIDNO.50)；

基因位点 ALDH2c.1510G>A 引物对 17

野生型特异性上游引物 cactcacagttttcacttctgaag(SEQIDNO.51)。

3.本实施例中所用到的试剂：易迈吉生物基因组DNA小提试剂盒(GD001-03)。

4.本实施例提供的核酸组合物可以通过常规的化学合成方式合成得到。

5.本实施例提供了使用实施例1提供的核酸组合物基于核酸质谱技术检测心血管疾病用药相关基因的方法，包括如下步骤：

(1)样本制备

标本采集：根据实际情况不同，可采集不同的样本类型，可以是粪便、全血、拭子、口腔脱落细胞、干血片和唾液等含有完整细胞的样本组织；

基因组DNA的提取：提取后DNA的吸光度OD260/280在1.6-1.9之间，然后将样本稀释至20ng/μL，以用于下一步PCR反应；

(2)引物稀释

rooptag多重PCR引物干粉用超纯水溶解制备成500μM贮存液，混合使每一条扩增引物的终浓度为2-5μM；

野生特异性多重PCR引物干粉用超纯水溶解制备成500μM贮存液，混合使每一条扩增引物的终浓度为0.5-2μM；

下游PCR引物干粉用超纯水溶解制备成500μM贮存液，混合使每一条扩增引物的终浓度为1-2μM；

(3)检测

配制如下表1：

表1 ：

附图说明

图1是PCR多重反应体系配置表；

PCR扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸60s，15个循环；95℃变性30s，68℃退火30s， 15-20个循环；72℃后延伸5min；

(4)产物脱盐纯化

样本板的每孔加入25μL的HPLC水，短暂离心后加入树脂，进行去离子交换处理。涡旋震荡和离心；

(5)产物点样、质谱检测

根据对应关系，将纯化产物点在芯片上，再将芯片放入质谱仪，待真空度达到后，就可以进行样本飞行检测。飞行结束后，在机器自带的Typer软件分析数据。