一种基于水稻稻瘟病抗性基因Pita编码区SNP突变的PARMS标记与应用

摘要

本发明公开了一种基于水稻稻瘟病抗性基因Pita编码区SNP突变的PARMS标记与应用，本发明利用一代测序检测Pita在高抗稻瘟病材料Y244和感病品种日本晴中差异，发现在该基因编码区17bp位点发生G→T突变。在设计的正向引物中引入这两个碱基的差异，并在此基础上增加两条不同荧光标记通用引物，开发基于PARMS技术的水稻稻瘟病抗性基因Pita的荧光功能分子标记，便于Pita基因在水稻抗性分子育种上应用。

说明书

【技术领域】

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种基于水稻稻瘟病抗性基因Pita编码区SNP突变的PARMS标记与应用。

【背景技术】

稻瘟病是由稻瘟菌引起的一种水稻毁灭性真菌病害，严重影响世界水稻种植区的产量与品质，从而威胁全球粮食安全，而水稻是人类赖以生存的主要粮食作物之一，它是超过一半世界人口的主粮。稻瘟病是世界水稻生产上最具毁灭性的真菌病害之一，至今已有80余个国家报道有稻瘟病的发生，其中以亚洲和非洲发病最为严重。据估计，每年因稻瘟病损失的水稻足以养活6000万人。

化学防治作为一种主要、传统的病虫害防治手段，长期使用既污染环境，也增加经济成本。培育抗病水稻品种是最有效、最经济的策略。分子育种实践表明，分析水稻重要农艺性状基因的基因结构变异，开发目标基因功能标记，可实现基因的直接选择和有效聚合，大幅度提高育种效率，缩短育种时间。现已有相关的研究，例如中国专利CN201610064583一种高效检测水稻抗性基因Pita的特异性引物、分子标记及其检测方法，所述特异性引物是由前引物(6640F)和后引物(7415R)组成，前后引物所包含的两个可变核苷酸位点在大样本群体中的连锁比率达到99.31％，表明该引物对在水稻中具有广泛的适用性，设计的引物配合筛选出的专用PCR反应体系和反应条件，极大地增加了扩增的准确性和特异性，有效地解决了前人所使用的引物在检测过程中的假阳性问题，利用本发明设计的特异性引物及其分子标记检测水稻Pita基因的抗/感病类型时，只需要进行一次PCR扩增，此方法具有简单、快捷、经济节约的优点，适合在大样本中快速筛选、分析具抗病基因型的个体和品种。又例如中国专利CN201610517576水稻抗稻瘟病基因Pita特异性分子标记引物及应用，通过将携带不同Pita等位基因的水稻品种测序及序列比对在Pita编码区内含子鉴定到一个Pita特异性位点并开发了一套鉴定该目标位点的分子标记引物，分别为：SF：GCAGGTTATAAGCTAGCTAT；SR：GCCAAATAGCCAATTCATA；RF：CAAGAGAGAGTATTTGCTTAGGAGT；RR：CCTATATCTCTTTAAAATATGTTTGGC，利用该引物对水稻种质资源DNA进行PCR扩增，可快速判断待测试水稻Pita的基因型，从而将携带抗性等位基因的材料应用于生产，方法简便快速、成本低廉，可广泛应用于分子标记辅助选择育种或者水稻种质资源Pita基因型鉴定。

目前常用的分子标记RFLP，RAPD，CAPS，AFLP，SSR，ISSR，STS，SRAP和IRAP可用于目标基因的连锁分析、检测，但是这些标记检测耗时长、操作繁琐、效率低、自动化程度低并且使用有毒物质等缺点，不适用于大规模的基因型分析。过去也开发了大量与抗稻瘟病基因连锁的分子标记，如RFLP标记、SSLP标记、RAPD标记，用分子标记定位一个未知的抗稻瘟病基因、STS标记和SNP标记等，但这些标记仅是紧密连锁的标记，而且需要依赖构建相应F2群体才能使用，从而影响了标记的利用效率。

单核苷酸多态性SNP，是指在基因组水平上引起的单个碱基的变异，其在群体中的发生频率不小于1％。SNP可以发生在基因组的任何位置，作为新一代分子标记，具有数量多、分布均匀、多态性丰富、精度高等优点。PARMS技术，即五引物扩增受阻突变体系，是最新开发出的基于荧光检测的SNP基因分型方法，该技术利用五条引物(一对通用荧光引物、一对等位基因特异引物和一条反向共用引物)对SNP或短Indel位点进行等位基因特异性扩增，通过荧光扫描进行基因分型，具有操作简便、耗时短、成本低的优势。基于PARMS技术开发的荧光分子标记，检测样品只通过一次PCR扩增，不需要电泳检测，而直接在原板上用荧光扫描仪获取扩增数据，经过软件分析，快速获得相应基因型结果。因此，为了提高选择的效率，有必要发展新型的分子标记。

【发明内容】

针对现有技术中防治水稻稻瘟病的标记检测耗时长、操作繁琐、效率低、自动化程度低并且使用有毒物质、不适用于大规模的基因型分析的缺点，本发明提供了一种基于水稻稻瘟病抗性基因Pita编码区SNP突变的PARMS标记与应用，本发明利用一代测序检测Pita在高抗稻瘟病材料Y244和感病品种日本晴中差异，发现在该基因编码区17bp位点发生G→T突变。在设计的正向引物中引入这两个碱基的差异，并在此基础上增加两条不同荧光标记通用引物，开发基于PARMS技术的水稻稻瘟病抗性基因Pita的荧光功能分子标记，便于Pita基因在水稻抗性分子育种上应用。

本发明所述的一种基于水稻稻瘟病抗性基因Pita编码区SNP突变的PARMS标记与应用，是基于水稻稻瘟病抗性基因Pita编码区SNP突变的PARMS标记与应用，包括如下步骤：

1)水稻材料稻瘟病抗性鉴定：以日本晴为对照，在苗期人工接种鉴定多份水稻材料的稻瘟病抗性，筛选出抗稻瘟病生理小种ZB1和ZB9的材料Y224；

2)Pita基因结构分析：提取Y224和日本晴新鲜叶片的DNA，分段扩增，纯化后送生物公司测序，利用软件Vector NTI 11分析Pita基因在两个水稻材料中的差异，发现在该基因编码区17bp位点发生G→T突变；

3)Pita基因功能标记的设计与合成：根据Pita编码区555位点G→A突变，设计了1个PARMS分子标记PARMS-Pita，该标记由3条Pita基因的特异引物构成，在设计的正向引物中引入两个碱基的差异：

正向引物Pita-Ra：TGACACCCTGCGATGCAA

正向引物Pita-Rg：TGACACCCTGCGATGCAC

反向引物Pita-F：CAGCAACTAACGAGGCATAATCT；

另外包含两条通用引物，分别与两条正向引物中有下划线的部分一致，两条通用引物尾部加有不同的荧光标记：

#1：GAAGGTGACCAAGTTCATGCT；

#2：GAAGGTCGGAGTCAACGGATT；

4)PARMS-Pita的使用：标记的3条根据Pita基因序列设计的引物及两条通用荧光引物同时加入到PCR反应体系进行扩增，Pita等位基因序列根据SNP差异与正向引物Pita-Fg匹配而扩增获得FAM荧光信号值，与正向引物Pita-Fa匹配而扩增获得HEX荧光信号值，如果水稻样品在该位点为杂合状态，则两种正向引物同时扩增；

5)Pita基因的PCR扩增与基因分型：鉴定聚合多个抗性基因的多份水稻材料的稻瘟病抗性后，利用PARMS-Pita对稻瘟病基因Pita分型，将所设计的3条引物Pita-Fg、Pita-Fa和Pita-R及#1、#2两条通用引物同时加入到PCR反应体系中，上述PCR反应体系为10μL：5μL 2×PARMS master mix，0.15μL10 mM Pita-Fg标记引物，0.15μL10 mM Pita-Fa标记引物，0.4μL10 mM Pita-R通用反向引物，1μL模板DNA，3.3μL ddH

PCR产物在包含FAM、HEX和ROX三种荧光检测通道的酶标仪中进行快速检测，读取荧光强度信号值，然后将荧光信号值文件通过SNP decoder(http://www.snpway.com/snpdecoder01/)软件分析，获得每个样品扩增的FAM和HEX荧光信号强度，并对每个信号点用图形方式输出，最后根据荧光信号强度，自动进行基因分型，获得基因型结果；

根据荧光信号值进行分析，荧光扫描获得FAM荧光信号(蓝色)的是抗稻瘟病Pita等位基因(T)类型材料，描获得HEX荧光信号(绿色)的是感稻瘟病Pita(G)类型材料，灰色为阴性对照；

6)PARMS-Pita有效性评估：对聚合多个抗性基因的水稻材料进行分析，确定表型、基因型。

本发明中：

步骤1)所述的多份，是200-250份。

步骤2)所述的提取Y224和日本晴新鲜叶片的DNA，是采用CTAB法提取Y224和日本晴新鲜叶片的DNA。

步骤5)所述的鉴定聚合多个抗性基因的多份水稻材料，是鉴定聚合多个抗性基因的70-80份水稻材料。

步骤5)所述的PCR反应体系中的PCR反应程序是：95℃，5min；然后10个循环95℃，20s，65℃(-0.8℃/循环)，1min；然后32个循环95℃，20s，57℃，1min。

步骤6)所述的表型为中感或感稻瘟病、抗或高抗稻瘟病；所述的基因型鉴定结果为GG型、TT型或TTGG型。

和现有技术相比，本发明具有如下优点：

1、本发明所述的一种基于水稻稻瘟病抗性基因Pita编码区SNP突变的PARMS标记与应用，只需一次PCR扩增，操作过程简易，便于掌握，不需要凝胶电泳分离DNA片段，避免接触有毒化学物质。

2、本发明所述的一种基于水稻稻瘟病抗性基因Pita编码区SNP突变的PARMS标记与应用，多态性极好，基因分型清楚，软件读取数据便捷，不易出错，而且PARMS-Pita检测结果准备可靠。

【附图说明】

图1是本发明实施例1中Pita基因在Y224和日本晴两个水稻材料中的序列比对的图。

图2是本发明实施例1中Pita基因在Y224和日本晴两个水稻材料中的荧光图。

【具体实施方式】

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

实施例1：

一种基于水稻稻瘟病抗性基因Pita编码区SNP突变的PARMS标记与应用，包括如下步骤：

1)水稻材料稻瘟病抗性鉴定：以日本晴为对照，在苗期人工接种鉴定226份水稻材料的稻瘟病抗性，筛选出抗稻瘟病生理小种ZB1和ZB9的材料Y224；

2)Pita基因结构分析：采用CTAB法提取Y224和日本晴新鲜叶片的DNA，分段扩增，纯化后送生物公司测序，利用软件Vector NTI 11分析Pita基因在两个水稻材料中的差异，发现在该基因编码区17bp位点发生G→T突变(参见附图1)；

3)Pita基因功能标记的设计与合成：根据Pita编码区555位点G→A突变，设计了1个PARMS分子标记PARMS-Pita，该标记由3条Pita基因的特异引物构成，在设计的正向引物中引入两个碱基的差异：

正向引物Pita-Ra：TGACACCCTGCGATGCAA

正向引物Pita-Rg：TGACACCCTGCGATGCAC

反向引物Pita-F：CAGCAACTAACGAGGCATAATCT；

另外包含两条通用引物，分别与两条正向引物中有下划线的部分一致，两条通用引物尾部加有不同的荧光标记：

#1：GAAGGTGACCAAGTTCATGCT；

#2：GAAGGTCGGAGTCAACGGATT；

4)PARMS-Pita的使用：标记的3条根据Pita基因序列设计的引物及两条通用荧光引物同时加入到PCR反应体系进行扩增，Pita等位基因序列根据SNP差异与正向引物Pita-Fg匹配而扩增获得FAM荧光信号值，与正向引物Pita-Fa匹配而扩增获得HEX荧光信号值，如果水稻样品在该位点为杂合状态，则两种正向引物同时扩增；

5)Pita基因的PCR扩增与基因分型：鉴定聚合多个抗性基因的多份水稻材料的稻瘟病抗性后，利用PARMS-Pita对稻瘟病基因Pita分型，将所设计的3条引物Pita-Fg、Pita-Fa和Pita-R及#1、#2两条通用引物同时加入到PCR反应体系中，上述PCR反应体系为10μL：5μL 2×PARMS master mix，0.15μL10 mM Pita-Fg标记引物，0.15μL10 mM Pita-Fa标记引物，0.4μL10 mM Pita-R通用反向引物，1μL模板DNA，3.3μL ddH

PCR产物在包含FAM、HEX和ROX三种荧光检测通道的酶标仪中进行快速检测，读取荧光强度信号值，然后将荧光信号值文件通过SNP decoder(http://www.snpway.com/snpdecoder01/)软件分析，获得每个样品扩增的FAM和HEX荧光信号强度，并对每个信号点用图形方式输出，最后根据荧光信号强度，自动进行基因分型，获得基因型结果；

根据荧光信号值进行分析，荧光扫描获得FAM荧光信号(蓝色)的是抗稻瘟病Pita等位基因(T)类型材料，描获得HEX荧光信号(绿色)的是感稻瘟病Pita(G)类型材料，灰色为阴性对照；

6)PARMS-Pita有效性评估：对聚合多个抗性基因的水稻材料进行分析，确定表型、基因型，在68分材料中，有24份表型为中感或感稻瘟病，基因型鉴定结果为GG型；42份材料为抗或高抗稻瘟病，基因型TT型，2份材料为TTGG型，该标记的有效性为100％，可用于水稻抗稻瘟病分子育种。

计算各品系稻瘟病平均抗性级别，公式如下：

平均抗级＝∑(各抗级株数×对应抗性级别)/总株数。

平均抗性级别分为：

1.0-1.9为高抗(HR)，

2.0-3.9为抗(R)，

4.0-5.9为中抗(MR)，

6.0-7.9为中感(MS)，

8.0-9.0为高感(HS)。

实施例2：

一种基于水稻稻瘟病抗性基因Pita编码区SNP突变的PARMS标记与应用，包括如下步骤：

1)水稻材料稻瘟病抗性鉴定：以日本晴为对照，在苗期人工接种鉴定200份水稻材料的稻瘟病抗性，筛选出抗稻瘟病生理小种ZB1和ZB9的材料Y224；

2)Pita基因结构分析：采用CTAB法提取Y224和日本晴新鲜叶片的DNA，分段扩增，纯化后送生物公司测序，利用软件Vector NTI 11分析Pita基因在两个水稻材料中的差异，发现在该基因编码区17bp位点发生G→T突变(参见附图1)；

3)Pita基因功能标记的设计与合成：根据Pita编码区555位点G→A突变，设计了1个PARMS分子标记PARMS-Pita，该标记由3条Pita基因的特异引物构成，在设计的正向引物中引入两个碱基的差异：

正向引物Pita-Ra：TGACACCCTGCGATGCAA

正向引物Pita-Rg：TGACACCCTGCGATGCAC

反向引物Pita-F：CAGCAACTAACGAGGCATAATCT；

另外包含两条通用引物，分别与两条正向引物中有下划线的部分一致，两条通用引物尾部加有不同的荧光标记：

#1：GAAGGTGACCAAGTTCATGCT；

#2：GAAGGTCGGAGTCAACGGATT；

4)PARMS-Pita的使用：标记的3条根据Pita基因序列设计的引物及两条通用荧光引物同时加入到PCR反应体系进行扩增，Pita等位基因序列根据SNP差异与正向引物Pita-Fg匹配而扩增获得FAM荧光信号值，与正向引物Pita-Fa匹配而扩增获得HEX荧光信号值，如果水稻样品在该位点为杂合状态，则两种正向引物同时扩增；

5)Pita基因的PCR扩增与基因分型：鉴定聚合多个抗性基因的70份水稻材料的稻瘟病抗性后，利用PARMS-Pita对稻瘟病基因Pita分型，将所设计的3条引物Pita-Fg、Pita-Fa和Pita-R及#1、#2两条通用引物同时加入到PCR反应体系中，上述PCR反应体系为10μL：5μL 2×PARMS master mix，0.15μL10 mM Pita-Fg标记引物，0.15μL10 mM Pita-Fa标记引物，0.4μL10 mM Pita-R通用反向引物，1μL模板DNA，3.3μL ddH

PCR产物在包含FAM、HEX和ROX三种荧光检测通道的酶标仪中进行快速检测，读取荧光强度信号值，然后将荧光信号值文件通过SNP decoder(http://www.snpway.com/snpdecoder01/)软件分析，获得每个样品扩增的FAM和HEX荧光信号强度，并对每个信号点用图形方式输出，最后根据荧光信号强度，自动进行基因分型，获得基因型结果；

根据荧光信号值进行分析，荧光扫描获得FAM荧光信号(蓝色)的是抗稻瘟病Pita等位基因(T)类型材料，描获得HEX荧光信号(绿色)的是感稻瘟病Pita(G)类型材料，灰色为阴性对照；

6)PARMS-Pita有效性评估：对聚合多个抗性基因的水稻材料进行分析，确定表型、基因型，在68分材料中，有24份表型为中感或感稻瘟病，基因型鉴定结果为GG型；42份材料为抗或高抗稻瘟病，基因型TT型，2份材料为TTGG型，该标记的有效性为100％，可用于水稻抗稻瘟病分子育种。

实施例3：

一种基于水稻稻瘟病抗性基因Pita编码区SNP突变的PARMS标记与应用，包括如下步骤：

1)水稻材料稻瘟病抗性鉴定：以日本晴为对照，在苗期人工接种鉴定250份水稻材料的稻瘟病抗性，筛选出抗稻瘟病生理小种ZB1和ZB9的材料Y224；

2)Pita基因结构分析：采用CTAB法提取Y224和日本晴新鲜叶片的DNA，分段扩增，纯化后送生物公司测序，利用软件Vector NTI 11分析Pita基因在两个水稻材料中的差异，发现在该基因编码区17bp位点发生G→T突变(参见附图1)；

3)Pita基因功能标记的设计与合成：根据Pita编码区555位点G→A突变，设计了1个PARMS分子标记PARMS-Pita，该标记由3条Pita基因的特异引物构成，在设计的正向引物中引入两个碱基的差异：

正向引物Pita-Ra：TGACACCCTGCGATGCAA

正向引物Pita-Rg：TGACACCCTGCGATGCAC

反向引物Pita-F：CAGCAACTAACGAGGCATAATCT；

另外包含两条通用引物，分别与两条正向引物中有下划线的部分一致，两条通用引物尾部加有不同的荧光标记：

#1：GAAGGTGACCAAGTTCATGCT；

#2：GAAGGTCGGAGTCAACGGATT；

4)PARMS-Pita的使用：标记的3条根据Pita基因序列设计的引物及两条通用荧光引物同时加入到PCR反应体系进行扩增，Pita等位基因序列根据SNP差异与正向引物Pita-Fg匹配而扩增获得FAM荧光信号值，与正向引物Pita-Fa匹配而扩增获得HEX荧光信号值，如果水稻样品在该位点为杂合状态，则两种正向引物同时扩增；

5)Pita基因的PCR扩增与基因分型：鉴定聚合多个抗性基因的80份水稻材料的稻瘟病抗性后，利用PARMS-Pita对稻瘟病基因Pita分型，将所设计的3条引物Pita-Fg、Pita-Fa和Pita-R及#1、#2两条通用引物同时加入到PCR反应体系中，上述PCR反应体系为10μL：5μL 2×PARMS master mix，0.15μL10 mM Pita-Fg标记引物，0.15μL10 mM Pita-Fa标记引物，0.4μL10 mM Pita-R通用反向引物，1μL模板DNA，3.3μL ddH

PCR产物在包含FAM、HEX和ROX三种荧光检测通道的酶标仪中进行快速检测，读取荧光强度信号值，然后将荧光信号值文件通过SNP decoder(http://www.snpway.com/snpdecoder01/)软件分析，获得每个样品扩增的FAM和HEX荧光信号强度，并对每个信号点用图形方式输出，最后根据荧光信号强度，自动进行基因分型，获得基因型结果；

根据荧光信号值进行分析，荧光扫描获得FAM荧光信号(蓝色)的是抗稻瘟病Pita等位基因(T)类型材料，描获得HEX荧光信号(绿色)的是感稻瘟病Pita(G)类型材料，灰色为阴性对照；

6)PARMS-Pita有效性评估：对聚合多个抗性基因的水稻材料进行分析，确定表型、基因型，在68分材料中，有24份表型为中感或感稻瘟病，基因型鉴定结果为GG型；42份材料为抗或高抗稻瘟病，基因型TT型，2份材料为TTGG型，该标记的有效性为100％，可用于水稻抗稻瘟病分子育种。

总结：

1、现有技术中，常规的DNA标记检测方法主要有聚丙烯酰胺电泳和琼脂糖凝胶电泳，这些检测方法具有耗时长、操作繁琐、效率低、自动化程度低并且使用有毒物质等缺点；毛细管电泳存在由于进样量少，因而制备能力差；由于毛细管直径小，使光路太短，用一些检测方法(如紫外吸收光谱法)时，灵敏度较低；电渗会因样品组成而变化，进而影响分离重现性等局限性。通过实施例1-3，说明本发明一种基于水稻稻瘟病抗性基因Pita编码区SNP突变的PARMS标记与应用，只需一次PCR扩增，操作过程简易，便于掌握，不需要凝胶电泳分离DNA片段，避免接触有毒化学物质。

2、本发明所述的一种基于水稻稻瘟病抗性基因Pita编码区SNP突变的PARMS标记与应用，多态性极好，基因分型清楚，软件读取数据便捷，不易出错，而且PARMS-Pita检测结果准备可靠。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。

序列表

<110> 广西壮族自治区农业科学院

<120> 一种基于水稻稻瘟病抗性基因Pita编码区SNP突变的PARMS标记与应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgacaccctg cgatgcaaga aggtgaccaa gttcatgct 39

<210> 2

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgacaccctg cgatgcacga aggtcggagt caacggatt 39

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cagcaactaa cgaggcataa tct 23

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gaaggtgacc aagttcatgc t 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaaggtcgga gtcaacggat t 21