一种拉莫三嗪潜在基因毒性杂质的分析方法

摘要

本发明提供了一种LC‑MS柱前衍生方法检测拉莫三嗪成品及其中间体中微量潜在基因毒性杂质2,3‑二氯苯甲酰腈(I)含量的方法，本发明所提供的方法专属性强、耐用性好、灵敏度低、检测线性范围宽。

说明书

技术领域

本发明涉及化学分析领域，特别涉及一种拉莫三嗪潜在基因毒性杂质的分析方法。

背景技术

拉莫三嗪(Lamotrigine),主要用于治疗部分性癫痫，特别对用其他单药或联合用药不能控制的难治性部分性癫痫，其作用安全有效。对失神发作，或非典型失神发作，肌阵挛性发作约有50％的病人可以得到控制。同时，拉莫三嗪也适合作为辅助药物治疗顽固性癫痫中Lennox-Gastant综合征，以及继发性和特发性全身强直一阵挛性发作，其结构式如下：

在拉莫三嗪的合成工艺中，有1个活性中间体化合物2,3-二氯苯甲酰腈(I)，其结构中含有苯甲酰腈基团，属于潜在警示结构，其可能属于潜在基因毒性杂质，此类潜在基毒杂质每日摄入量限度为1.5微克/天，根据拉莫三嗪每日最大服用量700mg计，在拉莫三嗪成品中2,3-二氯苯甲酰腈限度指标为2.14ppm，其含量远低于常规有机杂质0.05％或 0.10％指标限度，使用常规的紫外检测器灵敏度无法达到要求，因此需要使用灵敏度更好的检测方法进行分析。

采用GC-MS或LC-MS方法对2,3-二氯苯甲酰腈在2ppm以内的限度进行直接检测，发现由于检测灵敏度不够，或是在高温下发生分解或聚合等原因，无法在2ppm限度内对该杂质进行准确定量。因此，为了更好地监控拉莫三嗪药物的产品质量，进一步保护患者的用药安全，需要建立一种检测拉莫三嗪药物中潜在基毒杂质2,3-二氯苯甲酰腈的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速高效检测拉莫三嗪或其中间体中微量潜在基因毒性杂质二氯苯甲酰腈杂质含量的方法。

本发明提供了一种检测拉莫三嗪或其中间体中微量二氯苯甲酰腈(I)的方法，包括以下步骤：

(1)取待检测拉莫三嗪或其中间体加入胺类衍生试剂进行衍生处理，并制成供试品溶液，

(2)采用液质联用(LC-MS)对所述步骤(1)中的供试品溶液进行检测分析，

其中，胺类衍生试剂是分子中含有一个仲胺或伯胺基团和一个容易离子化或质子化的氨基或芳香胺基的二氨基化合物。

进一步的所述二氨基化合物，其结构式如下：

其中

a)R

b)R

c)R

n

进一步所述胺类衍生试剂选自：哌嗪、N-甲基哌嗪、1-甲基咪唑啉(1-methylimidazolidine)、N,N-二甲基-1,2-乙二胺、N,N,N’-三甲基乙二胺、2-氨甲基吡啶、3-氨甲基吡啶、4-氨甲基吡啶；

进一步的所述步骤(2)的检测分析是在酸性环境下进行的；

所述步骤(2)液质联用(LC-MS)的色谱条件如下：

分析柱：反相键合硅胶色谱柱或正相键合硅胶色谱柱；

柱温：10～80℃；

流动相：由流动相A和流动相B组成；

稀释液选自：有机溶剂；

流速：0.1～10.0mL/min；

检测器选自质谱检测器(mass detector)；

流速：0.1～10.0mL/min；

其中，流动相A选自：水、有机酸水溶液、有机盐水溶液或有机酸和有机盐的混合水溶液，优选有机酸水溶液；流动相B选自：甲醇，异丙醇，四氢呋喃或乙腈；

进一步所述流动相A选自有机酸水溶液或有机酸和有机盐的混合水溶液；更进一步所述流动相A选自有机酸水溶液；

其中所述流动相A中有机酸选自：甲酸、乙酸、三氟乙酸或全氟丁酸；有机盐选自：甲酸铵、乙酸铵、三氟乙酸铵；

其中，所述稀释液中的有机溶剂进一步选自二氯甲烷、二甲亚砜、丙酮、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、甲醇、乙醇、乙腈中的一种或几种。

本发明提供的一种检测拉莫三嗪或其中间体中微量潜在基因毒性杂质二氯苯甲酰腈 (I)含量的方法，具体主要包括以下步骤：将待检测拉莫三嗪或其中间体用稀释液溶解并定容，配制成1mL体积中待测组分含量0.01～500mg的溶液；然后加入适量的胺类衍生试剂，于10～80℃下衍生反应0.1～48小时，衍生后溶液取样，在LC-MS检测正离子模式下，以二氯苯甲酰腈与衍生试剂反应产物[M+H]

本发明开发的拉莫三嗪样品中微量潜在基毒杂质二氯苯甲酰腈分析方法，采用检测前先用可离子化或质子化的胺类衍生试剂对二氯苯甲酰腈进行柱前衍生，然后在酸性检测条件下用LC-MS方法进行检测，可以使二氯苯甲酰腈的检测灵敏度达到0.2ppm以下。该方法抗干扰能力强，操作简单，并且灵敏度高，线性范围宽，可以快速有效地检测拉莫三嗪或其中间体样品中微量潜在基毒杂质二氯苯甲酰腈的含量，有利于有效的控制拉莫三嗪药品中潜在基毒杂质的残留，保护患者的用药安全。

附图说明

图1为实施例1中空白溶液谱图；

图2为实施例1中二氯苯甲酰腈检测的专属性溶液图谱；

图3为实施例1中二氯苯甲酰腈检测的LOD溶液图谱(0.2ppm)；

图4为实施例1中二氯苯甲酰腈检测的LOQ溶液图谱(0.6ppm)；

图5为实施例1中二氯苯甲酰腈检测的标准溶液图谱；

图6为实施例1中二氯苯甲酰腈检测的准确度溶液图谱；

图7为实施例1中待测拉莫三嗪成品中二氯苯甲酰腈检测图谱(10mg/ml)。

具体实施方式

实施例1

色谱条件

仪器：高效液相色谱仪配备质谱检测器

色谱柱：Waters XBridge Shield,RP18,150×4.6mm,3.5μm

流动相A：0.1％甲酸水溶液

流动相B：乙腈

流速：1.0mL/min

进样体积：5μL

柱温：25℃

运行时间：30min

质谱检测器参数如下：

稀释液：二氯甲烷

衍生试剂溶液：称取25mg无水哌嗪至25mL容量瓶中，接着用稀释液稀释至刻度，待测。(衍生试剂浓度：1.0mg/mL)

空白溶液：准确移取稀释液0.5mL、衍生化试剂0.5mL到1.5mL进样瓶，充分混匀，密封瓶盖，于40℃条件下衍生2小时，然后取出放冷至室温。

2,3-二氯苯甲酰腈储备溶液：称取21.4mg 2,3-二氯苯甲酰腈标准品，精密称定于100mL 容量瓶中，用稀释液溶解并稀释至刻度，混匀；准确移取上述溶液1.0mL到100mL容量瓶中，用稀释液稀释至刻度，混匀，准确移取上述溶液1.0mL到50mL容量瓶中，用稀释液稀释到至刻度，混匀。(2,3-二氯苯甲酰腈浓度：42.8ng/mL)

灵敏度溶液：精密移取2,3-二氯苯甲酰腈储备溶液3.0mL至10mL容量瓶中，用稀释液定容至刻度，混匀，准确移取上述溶液0.5mL、衍生化试剂0.5mL到1.5mL进样瓶，充分混匀，密封瓶盖，于40℃条件下衍生2小时，然后取出放冷至室温。(2,3-二氯苯甲酰腈浓度：6.4ng/mL)

标准溶液：准确移取2,3-二氯苯甲酰腈储备溶液0.5mL、衍生化试剂0.5mL到1.5mL进样瓶，充分混匀，密封瓶盖，于40℃条件下衍生2小时，然后取出放冷至室温。(2,3- 二氯苯甲酰腈浓度：21.4ng/mL)

准确度溶液：准确移取2,3-二氯苯甲酰腈储备溶液0.5mL、衍生化试剂0.5mL到1.5mL 进样瓶，接着再加入40mg拉莫三嗪API，充分混匀，密封瓶盖，于40℃条件下衍生2小时，然后取出放冷至室温。

供试品溶液：称取40mg拉莫三嗪API供试品，精密称定于5mL离心管中，加入2.0mL稀释液，涡旋震荡处理60秒，，接着准确移取上述溶液0.5mL、衍生化试剂0.5mL到1.5mL 进样瓶，充分溶解混匀，密封瓶盖，于40℃加热2小时，然后取出放冷至室温。(浓度： 10mg/mL)

衍生反应结束后，把供试品溶液转移至液相进样小瓶中，在LC-MS检测正离子模式下，分别以2,3-二氯苯甲酰腈与衍生试剂哌嗪反应产物[M+H]

实施例2

色谱条件

仪器：高效液相色谱仪配备质谱检测器

色谱柱：ACE 3C18,150mm*4.6mm；3.0μm

流动相A：0.1％甲酸水溶液

流动相B：乙腈

流速：1.0mL/min

进样体积：5μL

柱温：35℃

运行时间：40min

质谱检测器参数如下：

稀释液：二氯甲烷

衍生试剂溶液：称取25mg N-甲基哌嗪至25mL容量瓶中，接着用稀释液稀释至刻度，待测。(衍生试剂浓度：1.0mg/mL)

空白溶液、2,3-二氯苯甲酰腈储备溶液(2,3-二氯苯甲酰腈浓度：42.8ng/mL)、灵敏度溶液(2,3-二氯苯甲酰腈浓度：6.4ng/mL)、标准溶液(2,3-二氯苯甲酰腈浓度：21.4ng/mL)及供试品溶液(浓度：10mg/mL)按照实施例1的方法制备。

衍生反应结束后，把供试品溶液转移至液相进样小瓶中，在LC-MS检测正离子模式下，分别以2,3-二氯苯甲酰腈与衍生试剂N-甲基哌嗪反应产物[M+H]

实施例3

色谱条件

仪器：高效液相色谱仪配备质谱检测器

色谱柱：ACE 3C18,150mm*4.6mm；3.0μm

流动相A：0.1％三氟乙酸水溶液

流动相B：甲醇

检测波长：210nm

流速：1.0mL/min

进样体积：5μL

柱温：35℃

运行时间：30min

质谱检测器参数如下：

稀释液：二氯甲烷

衍生试剂溶液：称取25mg无水哌嗪至25mL容量瓶中，接着用稀释液稀释至刻度，待测。(衍生试剂浓度：1.0mg/mL)

空白溶液、2,3-二氯苯甲酰腈储备溶液(2,3-二氯苯甲酰腈浓度：42.8ng/mL)、灵敏度溶液(2,3-二氯苯甲酰腈浓度：6.4ng/mL)、标准溶液(2,3-二氯苯甲酰腈浓度：21.4ng/mL)及供试品溶液(浓度：10mg/mL)按照实施例1的方法进行。

衍生反应结束后，把供试品溶液转移至液相进样小瓶中，在LC-MS检测正离子模式下，分别以2,3-二氯苯甲酰腈与衍生试剂无水哌嗪反应产物[M+H]

实施例4

色谱条件

仪器：高效液相色谱仪配备紫外检测器

色谱柱：Waters XBridge Shield,RP18,150×4.6mm,3.5μm

流动相A：0.1％三氟乙酸铵水溶液，用三氟乙酸调节pH＝3.0

流动相B：乙腈

检测波长：210nm

流速：1.0mL/min

进样体积：5μL

柱温：35℃

运行时间：35min

质谱检测器参数如下：

稀释液：丙酮-乙腈(1:1)

衍生试剂溶液：称取25mg N,N-二甲基-1,2-乙二胺至25mL容量瓶中，接着用稀释液稀释至刻度，待测。(衍生试剂浓度：1.0mg/mL)

2,3-二氯苯甲酰腈储备溶液(2,3-二氯苯甲酰腈浓度：42.8ng/mL)按照实施例1的方法制备。

空白溶液、灵敏度溶液(2,3-二氯苯甲酰腈浓度：6.4ng/mL)、标准溶液(2,3-二氯苯甲酰腈浓度：21.4ng/mL)及供试品溶液(浓度：10mg/mL)的制备：衍生反应温度为30℃，反应时间15小时，其余操作按照实施例1的方法进行。

衍生反应结束后，把供试品溶液转移至液相进样小瓶中，在LC-MS检测正离子模式下，分别以2,3-二氯苯甲酰腈与衍生试剂N,N-二甲基-1,2-乙二胺反应产物[M+H]

实施例5

仪器：高效液相色谱仪配备质谱检测器

色谱柱：ACE 3C18,150mm*4.6mm；3.0μm

流动相A：0.1％甲酸水溶液

流动相B：乙腈

流速：1.0mL/min

进样体积：5μL

柱温：35℃

运行时间：40min

质谱检测器参数如下：

稀释液：丙酮

衍生试剂溶液：称取25mg 1-甲基咪唑啉(1-methylimidazolidine)至25mL容量瓶中，接着用稀释液稀释至刻度，待测。(衍生试剂浓度：1.0mg/mL)

2,3-二氯苯甲酰腈储备溶液(2,3-二氯苯甲酰腈浓度：42.8ng/mL)按照实施例1的方法制备。

空白溶液、标准溶液(2,3-二氯苯甲酰腈浓度：21.4ng/mL)、灵敏度溶液(2,3-二氯苯甲酰腈浓度：6.4ng/mL)及供试品溶液(浓度：10mg/mL)的制备：衍生反应温度为50℃，反应时间1.5小时，其余操作按照实施例1的方法进行。衍生反应结束后，把供试品溶液转移至液相进样小瓶中，在LC-MS检测正离子模式下，分别以2,3-二氯苯甲酰腈与衍生试剂 1-甲基咪唑啉反应产物[M+H]

实施例6

仪器：高效液相色谱仪配备质谱检测器

色谱柱：ACE 3C18,150mm*4.6mm；3.0μm

流动相A：0.1％甲酸水溶液

流动相B：乙腈

流速：1.0mL/min

进样体积：5μL

柱温：35℃

运行时间：40min

质谱检测器参数如下：

稀释液：丙酮

衍生试剂溶液：称取25mg N,N,N’-三甲基乙二胺至25mL容量瓶中，接着用稀释液稀释至刻度，待测。(衍生试剂浓度：1.0mg/mL) 空白溶液、2,3-二氯苯甲酰腈储备溶液(2,3-二氯苯甲酰腈浓度：42.8ng/mL)、灵敏度溶液(2,3- 二氯苯甲酰腈浓度：6.4ng/mL)、标准溶液(2,3-二氯苯甲酰腈浓度：21.4ng/mL)及供试品溶液(浓度：10mg/mL)按照实施例1的方法进行。

衍生反应结束后，把供试品溶液转移至液相进样小瓶中，在LC-MS检测正离子模式下，分别以2,3-二氯苯甲酰腈与衍生试剂N,N,N’-三甲基乙二胺反应产物[M+H]

实施例7

仪器：高效液相色谱仪配备质谱检测器

色谱柱：YMC ODS-AQ,250mm*4.6mm；5.0μm

流动相A：0.1％甲酸水溶液

流动相B：异丙醇

流速：0.4mL/min

进样体积：5μL

柱温：35℃

运行时间：40min

质谱检测器参数如下：

稀释液：二氯甲烷

衍生试剂溶液：称取25mg 4-氨甲基吡啶至25mL容量瓶中，接着用稀释液稀释至刻度，待测。(衍生试剂浓度：1.0mg/mL)

2,3-二氯苯甲酰腈储备溶液(2,3-二氯苯甲酰腈浓度：42.8ng/mL)按照实施例1的方法制备。

空白溶液、标准溶液(2,3-二氯苯甲酰腈浓度：21.4ng/mL)、灵敏度溶液(2,3-二氯苯甲酰腈浓度：6.4ng/mL)及供试品溶液(浓度：10mg/mL)的制备：衍生反应温度为50℃，反应时间1.5小时，其余操作按照实施例1的方法进行。

衍生反应结束后，把供试品溶液转移至液相进样小瓶中，在LC-MS检测正离子模式下，分别以2,3-二氯苯甲酰腈与衍生试剂4-氨甲基吡啶反应产物[M+H]

上述仅对本发明的优选实施例做了详细说明，本发明不限于上述实施例，任何对本发明的变换和变型都归属本发明的保护范围。