三螺旋DNA分子开关探针及其在OTA比色快速检测中的应用

摘要

本发明公开了一种三螺旋DNA分子开关探针及其在OTA比色快速检测中的应用。三螺旋DNA分子开关探针主要由一条富含G碱基，形成平行的G‑四链体结构，可提高G‑quadruplex‑hemin的过氧化物酶活性的DNA链GP27和一条含有赭曲霉毒素A(OTA)适配体序列的DNA链AP9杂交组装形成，且杂交组装形成的三螺旋DNA分子开关探针应用在OTA比色快速检测中。本发明的三螺旋DNA分子开关探针能用于OTA的灵敏、快速比色检测，提高了检测的灵敏度，避免了使用DNA扩增或纳米材料放大检测信号，所用DNA链不需标记，检测过程无分离、清洗等步骤，在保持检测灵敏度的同时极大地简化了检测步骤，检测简单、快速，成本低廉，具有良好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于真菌毒素快速检测技术领域，具体涉及一种三螺旋DNA分子开关探针的设计、组装及其在赭曲霉毒素A(OTA)比色快速检测中的应用。

背景技术

赭曲霉毒素A(OTA)是由曲霉菌属和青霉菌属等有毒真菌产生的次级代谢产物。研究表明，OTA具有肾毒性、肝毒性，可导致DNA损伤以及抑制RNA 与蛋白质合成等危害，具有致畸、致癌、致突变作用，现已被世界卫生组织癌症研究所列为2B类致癌物质。农产品在采收、储藏、运输和加工过程中皆易受赭曲霉污染而产生赭曲霉毒素，易发生污染的农产品(食品)包括谷物类、豆类、坚果、香料、咖啡豆、可可、葡萄酒、啤酒等。2013年，国内的一次调查中发现，77份红葡萄酒中OTA检测率高达57％，最高值为5.65μg/kg。2010年，中国医学科学院的一项研究表明，57种中药材中的30种中药材检出了OTA。 2019年，Hajok等对波兰西里西亚市场上可获得的473种食品样本进行了检测，结果表明，22％的样品被OTA污染，其中葡萄干中OTA含量最高，达到34.0 μg/kg，超标3.5倍。这些研究表明，OTA毒性高、分布广、易高发，因此建立简单、快速、低成本、高灵敏的检测方法是实现OTA污染监控，以最大程度降低OTA对人与动物健康影响的有效技术手段之一。目前，OTA的常用检测方法为高效液相色谱-荧光/质谱检测方法，具有灵敏度高、重现性好的特点。然而，这些方法依赖于昂贵的分析检测仪器和专业技术人员，不利于大量样品的即时筛查检测(point-of-care testing，POCT)，限制了其应用和推广。基于抗体的免疫分析，如：酶联免疫法和免疫试纸条，检测通量高、速度快，也常被应用于 OTA的检测，但OTA免疫原性低，抗体研制难度大、耗时、昂贵，且易产生假阳性。因此，开发快速、灵敏、易于操作、成本低廉的OTA检测方法仍然非常迫切。

长期以来，DNA一直被视为存储和传递生命遗传信息的物质得到大量研究。然而，从材料学的角度出发，可发现DNA与其他合成聚合物相比，具有一些独特的物理、化学性质，包括序列可编辑，可分子识别、结合以及催化化学反应。除了广为人知的经典双螺旋结构，DNA通过分子内的氢键、碱基堆叠、静电相互作用以及金属离子配位作用等，可折叠形成多种结构，如：DNA三螺旋结构(triple helix)、G-四链体结构(G-quadruplex)、适配体(aptamer)等特定三维立体结构。物质的结构决定其性质。DNA形成特定结构后，会展现出独特的性质，具有识别、结合、催化等功能。例如，由特定富G碱基序列形成的G-四链体结构可与氯化血红素(hemin)结合形成具有类过氧化物酶活性的DNA酶 (G-quadruplex-hemin,DNAzyme)。利用这种DNA酶的过氧化物酶活性，可催化产生并扩增检测信号，提高检测的灵敏度。而DNA适配体可形成稳定的结构，可类似于抗体一样地特异性识别、结合目标物。与抗体相比，DNA适配体有些明显的优势，如：化学稳定性良好、生产成本低廉、批次间差异小等。

近年来，随着各种纳米材料与DNA扩增技术的发展，研究人员利用DNA 酶、适配体并结合DNA扩增技术和纳米材料放大检测信号，为OTA的快速、灵敏检测提供了新的方法。然而，纳米材料的制备、修饰和DNA的标记、扩增使得检测操作步骤繁多、复杂，成本升高，实用性降低。

发明内容

为解决上述问题，本发明设计了新的G-四链体结构形成序列以提高DNA 酶的过氧化物酶活性，同时设计适配体序列，组装形成三螺旋DNA分子开关探针，开发了OTA的灵敏、快速比色检测技术。该技术不需使用DNA扩增或纳米材料放大检测信号，因此所用DNA链不需标记，检测过程无分离、清洗等步骤，在保持检测灵敏度的同时极大地简化了检测步骤，检测成本低廉，具有良好的应用前景。

本发明采用的技术方案如下：

一、一种三螺旋DNA分子开关探针

所述三螺旋DNA分子开关探针主要由一条可提高G-quadruplex-hemin的过氧化物酶活性的DNA链GP27和一条含有赭曲霉毒素A(OTA)适配体序列的 DNA链AP9杂交组装形成。

所述的一条可提高G-quadruplex-hemin的过氧化物酶活性的DNA链GP27 富含G碱基，形成平行的G-四链体(G-quadruplex)结构，碱基序列为： 5′-GGTGGTGGTGGTTGTGGAGGAGGAGGA-3′，如SEQ ID No.1。该DNA链 GP27的3′末端带有一个腺嘌呤碱基A碱基，该A碱基极大地增强了 G-quadruplex-hemin的过氧化物酶活性，使得检测信号被放大，不需使用DNA 扩增或纳米材料放大检测信号，因此所用DNA链不需标记，检测过程无分离、清洗等步骤，在保持检测灵敏度的同时极大地简化了检测步骤。

所述的一条含有OTA适配体序列的DNA链AP9，中间具有能选择性地识别并结合OTA的36个碱基序列，前后两端的臂端序列均为由6个胞嘧啶C碱基和3个胸腺嘧啶T碱基构成的序列，碱基序列为： 5′-TCCTCCTCCGATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACACCT CCTCCT-3′，如SEQ ID No.2。

所述的三螺旋DNA分子开关探针具有茎环结构，由DNA链AP9前臂端的 TCCTCCTCC碱基序列、DNA链AP9后臂端的CCTCCTCCT碱基序列分别与 DNA链GP27靠近3′端的AGGAGGAGG碱基序列通过Watson-Crick和 Hoogsteen碱基配对组装而成；组装所得的三螺旋DNA分子开关探针具有茎环结构，DNA链AP9中间的36个碱基序列 GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA形成三螺旋DNA分子开关探针的环部，用于识别并结合待测目标物OTA，DNA链AP9前臂端的 TCCTCCTCC碱基序列和DNA链AP9后臂端的CCTCCTCCT碱基序列分别与 DNA链GP27的靠近3′端的AGGAGGAGG碱基序列通过Watson-Crick和 Hoogsteen碱基配对形成三螺旋DNA分子开关探针的茎部，锁定DNA链GP27。

过短或过长的臂端序列都会降低检测的灵敏度。臂端序列过短时，三螺旋 DNA分子开关探针不稳定，易解开，释放出DNA链GP27，进而产生较高背景信号，会降低信噪比；臂端序列过长时，三螺旋DNA分子开关探针过于稳定，待测目标物OTA难以与三螺旋DNA分子开关探针结合，难以打开三螺旋DNA 分子开关探针，很难甚至无法产生检测信号。

二、一种三螺旋DNA分子开关探针的制备方法

具体包括以下过程：

取DNA链GP27与DNA链AP9于pH为6.2的PBS缓冲溶液中混匀，常温杂交30分钟，经组装获得检测待测目标物OTA的三螺旋DNA分子开关探针，并在常温下保存。

所述的DNA链AP9与DNA链GP27的物质的量之比等于1.8:1。原理上讲， DNA链AP9与DNA链GP27的浓度比例为1:1时即刚好全部组装成三螺旋DNA 分子开关探针，完全锁定DNA链GP27。但是，DNA链AP9与DNA链GP27 组装成三螺旋DNA分子开关探针本质上是一个可逆的化学反应，从化学反应平衡原理角度分析，增加DNA链AP9的量有利于促进DNA链AP9与DNA链GP27的结合与组装，使DNA链GP27更完全地被结合，减少游离态的DNA链 GP27，从而降低背景信号，进而提高了探针检测待测目标物时的信噪比，产生了更高的灵敏度。

三、一种基于上述三螺旋DNA分子开关探针的OTA快速检测方法

具体包括以下步骤：

在PBS缓冲溶液中，将三螺旋DNA分子开关探针溶液与含有待测目标物 OTA的样品溶液混匀得到反应液，于25℃反应30分钟；之后向反应液中加入 HEPES缓冲溶液和氯化血红素(Hemin)混匀得到检测反应溶液，并在常温下反应30分钟；最后向检测反应溶液中加入2,2-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐ABTS

检测反应溶液在418nm处的吸光度值增加率随待测目标物OTA从0.01至 1.5mg/kg的浓度呈正线性相关。

1)反应缓冲液中OTA含量的快速检测方法如下：

在PBS缓冲液中，将由DNA链AP9与DNA链GP27组装而成的三螺旋 DNA分子开关探针与OTA在25℃孵育30分钟，OTA与DNA链AP9中的适配体序列结合，使得三螺旋DNA分子开关探针打开，释放出DNA链GP27；然后加入HEPES缓冲溶液和Hemin，DNA链GP27形成G-四链体结构并与Hemin 形成具有类过氧化物酶活性的DNA酶；最后加入ABTS

2)实际样品花生油中OTA的快速检测方法如下：

从本地超市购得花生油样品，经高效液相色谱检测无OTA，因此向其中添加3档不同浓度的OTA，做添加回收试验，以验证三螺旋DNA分子开关探针检测实际样品中OTA的准确性和稳定性。添加样品按照国家标准(GB 5009.96-2016)方法进行预处理，即：提取、分离、过滤。之后使用三螺旋DNA 分子开关探针检测，计算回收率及相对标准偏差，并与高效液相色谱检测法的检测结果进行比对。

四、所述的三螺旋DNA分子开关探针在OTA比色快速检测中的应用。

本发明设计了新的G-四链体结构形成序列增强DNA酶的过氧化物酶活性，使DNA酶催化H

本发明的有益效果是：

1)本发明设计了可形成G-四链体结构的富G碱基序列GP26，并通过在其 3′端仅仅简单地增加一个A碱基(即：GP27)极大地提高了其形成的DNA酶的催化活性，从而提高检测的灵敏度；

2)经过巧妙设计，GP27与AP9两条DNA链通过Watson-Crick和Hoogsteen 碱基配对组装形成了三螺旋DNA分子开关探针。检测OTA时，只需将探针与 OTA在缓冲液中混匀并在室温反应30分钟即可进行后续显色反应，完成检测。检测探针的制备以及检测信号的转导，不需要DNA扩增、也不需要任何纳米材料放大检测信号，无分离、清洗等步骤，成本低廉，非常简单的“混匀-检测”的操作步骤即可完成OTA的快速检测；

3)基于本发明的三螺旋DNA分子开关探针对OTA进行快速检测，在60 分钟内即可完成，速度远快于高效液相色谱检测法，检测的线性范围为0.01至 1.5mg/kg，检测限为0.004mg/kg，低于欧盟规定的最大残留限量(初级谷物类： 0.005mg/kg，可溶性咖啡0.01mg/kg)；

4)基于本发明的三螺旋DNA分子开关探针对OTA进行快速检测，由于适配体具有良好的特异性，检测探针只对目标物OTA有响应，当样品中存在AFB1、 AFB2、AFG1、OTB等真菌毒素时也不会干扰OTA的检测；

5)本发明设计、组装的三螺旋DNA分子开关探针具有可拓展性，将其中 AP9的适配体序列改为其他待测物的适配体序列，并经适当优化后，可组装得到能特异性响应不同待测目标物的三螺旋DNA分子开关探针。

总述，本发明的三螺旋DNA分子开关探针能用于OTA的灵敏、快速比色检测，提高了检测的灵敏度，避免了使用DNA扩增或纳米材料放大检测信号，检测过程无标记、分离、清洗等步骤，在保持检测灵敏度的同时极大地简化了检测步骤，检测简单、快速，成本低廉，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为三螺旋DNA分子开关探针的组装及其用于OTA快速检测的示意图；

图2为AP9与GP27组装形成三螺旋DNA分子开关探针时的碱基配对示意图；

图3为DNA酶催化活性的增强以及三螺旋DNA分子开关探针对待测目标物OTA的响应。3(A)为A碱基增强DNA酶催化活性的表征；3(B)为A 碱基增强DNA酶催化活性，加快检测信号产生速率；3(C)为采用紫外可见吸收光谱验证三螺旋DNA分子开关探针的组装及其对OTA的响应；3(D)为采用圆二色谱表征、验证三螺旋DNA分子开关探针的组装及其对OTA的响应；

图4为比色检测OTA时样品溶液的比色图。C为正对照，只含有GP27，不含三螺旋DNA分子开关探针、不含OTA；S1至S7为含有三螺旋DNA分子开关探针和不同浓度OTA的样品，其中OTA的浓度由0逐渐增加至2mg/kg；

图5为使用三螺旋DNA分子开关探针比色快速检测OTA的吸收光谱响应结果及特异性检测结果。5(A)为三螺旋DNA分子开关探针比色快速检测OTA 的紫外可见吸收光谱响应图，样品检测反应溶液颜色随着OTA浓度的增大由浅绿变为深绿，在418nm处的吸光度随之增加；5(B)为样品检测反应溶液在 418nm处的吸光度值增加百分率随着OTA浓度的增大而增大；5(C)为OTA 的浓度在0.01至1.5mg/kg时，样品检测反应溶液在418nm处的吸光度值增加百分率与OTA浓度的对数值的线性回归方程拟合图；5(D)为三螺旋DNA分子开关探针比色快速检测OTA的特异性。

具体实施方式

为了更好地说明本发明的目的、技术方案及优点，下面将结合附图和具体实施实例对本发明作进一步说明。应当理解，本文所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

一、一种三螺旋DNA分子开关探针

三螺旋DNA分子开关探针主要由一条可提高G-quadruplex-hemin的过氧化物酶活性的DNA链GP27和一条含有赭曲霉毒素A(OTA)适配体序列的DNA链 AP9杂交组装形成。

一条可提高G-quadruplex-hemin的过氧化物酶活性的DNA链GP27富含G 碱基，形成平行的G-四链体(G-quadruplex)结构，碱基序列为： 5′-GGTGGTGGTGGTTGTGGAGGAGGAGGA-3′，如SEQ ID No.1。

如图3所示，DNA链GP27的3′末端带有一个腺嘌呤碱基A碱基，该A 碱基极大地增强了G-quadruplex-hemin的过氧化物酶活性，使得检测信号被放大，不需使用DNA扩增或纳米材料放大检测信号，因此所用DNA链不需标记，检测过程无分离、清洗等步骤，在保持检测灵敏度的同时极大地简化了检测步骤。图3(A)为A碱基增强DNA酶催化活性的表征；图3(B)为A碱基增强DNA 酶催化活性，加快检测信号产生速率；图3(C)为采用紫外可见吸收光谱验证三螺旋DNA分子开关探针的组装及其对OTA的响应；图3(D)为采用圆二色谱表征、验证三螺旋DNA分子开关探针的组装及其对OTA的响应；

一条含有OTA适配体序列的DNA链AP9，中间具有能选择性地识别并结合OTA的36个碱基序列，前后两端的臂端序列均为由6个胞嘧啶C碱基和3 个胸腺嘧啶T碱基构成的序列，碱基序列为：5′-TCCTCCTCCGATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACACCT CCTCCT-3′，如SEQ ID No.2。

如图2所示，三螺旋DNA分子开关探针具有茎环结构，由DNA链AP9前臂端的TCCTCCTCC碱基序列、DNA链AP9后臂端的CCTCCTCCT碱基序列分别与DNA链GP27靠近3′端的AGGAGGAGG碱基序列通过Watson-Crick和 Hoogsteen碱基配对组装而成；组装所得的三螺旋DNA分子开关探针具有茎环结构，DNA链AP9中间的36个碱基序列GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA形成三螺旋DNA分子开关探针的环部，用于识别并结合待测目标物OTA，DNA链AP9前臂端的 TCCTCCTCC碱基序列和DNA链AP9后臂端的CCTCCTCCT碱基序列分别与DNA链GP27的靠近3′端的AGGAGGAGG碱基序列通过Watson-Crick和 Hoogsteen碱基配对形成三螺旋DNA分子开关探针的茎部，锁定DNA链GP27。

过短或过长的臂端序列都会降低检测的灵敏度。臂端序列过短时，三螺旋DNA分子开关探针不稳定，易解开，释放出DNA链GP27，进而产生较高背景信号，会降低信噪比；臂端序列过长时，三螺旋DNA分子开关探针过于稳定，待测目标物OTA难以与三螺旋DNA分子开关探针结合，难以打开三螺旋DNA 分子开关探针，很难甚至无法产生检测信号。

二、一种三螺旋DNA分子开关探针的制备方法

具体包括以下过程：

取DNA链GP27与DNA链AP9于pH为6.2的PBS缓冲溶液中混匀，常温杂交30分钟，经组装获得检测待测目标物OTA的三螺旋DNA分子开关探针，并在常温下保存。

DNA链AP9与DNA链GP27的物质的量之比等于1.8:1。原理上讲，DNA 链AP9与DNA链GP27的浓度比例为1:1时即刚好全部组装成三螺旋DNA分子开关探针，完全锁定DNA链GP27。但是，DNA链AP9与DNA链GP27组装成三螺旋DNA分子开关探针本质上是一个可逆的化学反应，从化学反应平衡原理角度分析，增加DNA链AP9的量有利于促进DNA链AP9与DNA链GP27的结合与组装，使DNA链GP27更完全地被结合，减少游离态的DNA链GP27，从而降低背景信号，进而提高了探针检测待测目标物时的信噪比，产生了更高的灵敏度。

三、一种基于上述三螺旋DNA分子开关探针的OTA快速检测方法

具体包括以下步骤：

在PBS缓冲溶液中，将三螺旋DNA分子开关探针溶液与含有待测目标物OTA的样品溶液混匀得到反应液，于25℃反应30分钟；之后向反应液中加入 HEPES缓冲溶液和Hemin混匀得到检测反应溶液，并在常温下反应30分钟；最后向检测反应溶液中加入ABTS

如图5(A)所示，检测反应溶液在418nm处的吸光度值增加率随待测目标物OTA从0.01至1.5mg/kg的浓度呈正线性相关。

1)反应缓冲液中OTA含量的快速检测方法如下：

在PBS缓冲液中，将由DNA链AP9与DNA链GP27组装而成的三螺旋 DNA分子开关探针与OTA在25℃孵育30分钟，OTA与DNA链AP9中的适配体序列结合，使得三螺旋DNA分子开关探针打开，释放出DNA链GP27；然后加入HEPES缓冲溶液和Hemin，DNA链GP27形成G-四链体结构并与Hemin 形成具有类过氧化物酶活性的DNA酶；最后加入ABTS

2)实际样品花生油中OTA的快速检测方法如下：

从本地超市购得花生油样品，经高效液相色谱检测无OTA，因此向其中添加3档不同浓度的OTA，做添加回收试验，以验证三螺旋DNA分子开关探针检测实际样品中OTA的准确性和稳定性。添加样品按照国家标准(GB 5009.96-2016)方法进行预处理，即：提取、分离、过滤。之后使用三螺旋DNA 分子开关探针检测，计算回收率及相对标准偏差，并与高效液相色谱检测法的检测结果进行比对。

四、所述的三螺旋DNA分子开关探针在OTA比色快速检测中的应用。

本发明设计了新的G-四链体结构形成序列增强DNA酶的过氧化物酶活性，使DNA酶催化H

本发明的优选实施例如下：

实施例1

如图1所示，利用DNA链GP27与DNA链AP9组装用于比色快速检测待测目标物OTA的三螺旋DNA分子开关探针。

取4μL浓度为10μM的DNA链GP27与7.2μL浓度为10μM的DNA链 AP9于pH为6.2的1×PBS缓冲溶液(20mM PBS、20mM NaCl、2.5mM MgCl

实施例2

利用三螺旋DNA分子开关探针快速检测水溶液中的OTA。

S1：取100μL实施例1中组装好的三螺旋DNA分子开关探针溶液，向其中加入4μL一定浓度的OTA标准溶液(溶剂为甲醇)，混匀，于25℃反应 30分钟。

S2：向样品中加入20μL 10×HEPES缓冲溶液(250mM HEPES、200mM KCl、 2000mMNaCl、0.05％Triton X-100，pH 5.3)、4μL浓度为10μM的Hemin 以及超纯水32μL(使每个样品体积达到160μL)，混匀，在室温下反应30分钟。

S3：向样品中加入20μL浓度为20mM的ABTS

S4：使用不同浓度的OTA标准溶液(溶剂为甲醇)重复步骤S1至S3，样品中OTA的终浓度依次为0.002、0.01、0.05、0.1、0.3、0.5、1、1.5、2、3、4 mg/kg，每个浓度做平行样品3个。

S5：以OTA的浓度为横坐标，吸光度值的增加率Increasing Rate％＝((A-A

图4为比色检测OTA时样品溶液的比色图。C为正对照，只含有GP27，不含三螺旋DNA分子开关探针、不含OTA；S1至S7为含有三螺旋DNA分子开关探针和不同浓度OTA的样品，其中OTA的浓度由0逐渐增加至2mg/kg。

检测结果：

如图5(B)所示，随着OTA的终浓度由0.002增加至4mg/kg(由低至高，依次为0.002、0.01、0.05、0.1、0.3、0.5、1、1.5、2、3、4mg/kg)，样品溶液在418nm处的吸光度值逐渐增加。

如图5(C)所示，将样品溶液在418nm处的吸光度值增加率与OTA的浓度(0.01至1.5mg/kg)拟合，得线性回归方程IR＝0.484C+0.131，C表示OTA 的浓度，线性相关系数r

实施例3

检测花生油中的OTA

S1：参照国家标准方法(GB 5009.96-2016)对花生油进行预处理，称取花生油5g置于离心管中，加入1g氯化钠及25mL甲醇提取液(V

S2：取100μL实施例1中组装好的三螺旋DNA分子开关探针溶液，向其中加入4μL上述某一浓度的OTA样品溶液，混匀，于25℃反应30分钟。

S3：向样品中加入20μL浓度为250mM的HEPES、4μL浓度为10μM的 Hemin以及超纯水32μL(使每个样品体积达到160μL)，混匀，在室温下反应 30分钟。

S4：向样品中加入20μL浓度为20mM的ABTS

S5：计算样品溶液吸光度值的增加率，代入标准曲线的回归方程中，计算出各样品溶液中的OTA浓度、添加回收率及相对标准偏差。

S6：使用不同浓度的OTA溶液做添加回收，使3档添加浓度分别为0.01、 0.05和0.1mg/kg，每档浓度做平行样品3个。重复步骤S2至S4，计算检测结果。

添加回收试验检测结果如表1所示。

表1

以上所述实例仅为本发明在该实例上的结果，但本发明的具体实施不仅局限于本实例。凡是依照本发明原理与思路提出的效果相似的替代方案，都应当视为本发明的保护范围。

本发明所涉及的DNA序列如下：

SEQ ID No.1：

名称：DNA链GP27碱基序列

来源：人工序列(Artificial Sequence)

GGTGGTGGTGGTTGTGGAGGAGGAGGA

SEQ ID No.2：

名称：DNA链AP9碱基序列

来源：人工序列(Artificial Sequence)

TCCTCCTCCGATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACACC TCCTCCT。

序列表

<110> 浙江省农业科学院

<120> 三螺旋DNA分子开关探针及其在OTA比色快速检测中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggtggtggtg gttgtggagg aggagga 27

<210> 2

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcctcctccg atcgggtgtg ggtggcgtaa agggagcatc ggacacctcc tcct 54