一种同时检测多种癌症标记物的液晶生物传感器及其制备与检测方法

摘要

本发明涉及一种同时检测多种癌症标记物的液晶生物传感器及其制备与检测方法。本发明的液晶生物传感器包括多通道样品槽，以及不同癌症标记物编码DNA修饰的液晶生物传感界面；所述多通道样品槽包括单独通道和连通通道，连通通道位于单独通道的上方，使得不同单独通道之间的上半部分互相连通；所述不同癌症标记物编码DNA修饰的液晶生物传感界面构筑于多通道样品槽的不同单独通道中。本发明利用不同癌症标记物编码DNA修饰液晶生物传感器，实现了多种不同癌症标记物的同时检测和定量检测，而且还实现了对极端样品的准确检测，本发明的检测方法样品用量少，检测方便，快速高效，灵敏度高，成本低，无需使用大型仪器。

说明书

技术领域

本发明涉及一种同时检测多种癌症标记物的液晶生物传感器及其制备与检测方法，属于分析检测技术领域。

背景技术

随着科技水平的不断进步，生活水平的不断提高，人类寿命的不断延长，癌症已经逐步成为对人类生命健康威胁最大的疾病之一。高特异性、高灵敏度的检测癌症标记物在癌症的早期诊断、药物干预、预后治疗中发挥重要作用。在实际临床应用中，往往需要通过检测多种标记物以提高检测的准确性，排除假阳性结果。因此，开发多重检测技术可以降低样品消耗、节约操作成本、缩短检测时间，提高检测通量和可靠性。目前，同时检测多种生物标记物主要基于荧光分析、表面增强拉曼、酶联免疫、电化学分析等手段，这些检测方法通常存在着成本较高、操作步骤繁琐、需要专门的仪器及分子标记等问题。因此，亟需开发低成本、方便、快速、高效、灵敏度高、选择性好、无需标记的高性能多重检测生物传感器，以满足人们在“大健康”背景下医学检测多样化的需求。

液晶生物传感器是一种前沿的生物传感技术，其具有构造简单、成本低、能耗低、无需标记、样品用量少、灵敏度高等优点。由于其独特的优势，液晶生物传感器逐渐引起国内外研究者的广泛关注，在癌症标记物检测方面取得一定成果，具有广阔的市场化前景。但是由于液晶光学信号只有亮、暗两种形态，难以编码，能够满足同时检测多种物质的液晶传感器还尚未实现，严重制约了液晶生物传感器在临床癌症诊断方面的实际应用。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种同时检测多种癌症标记物的液晶生物传感器及其制备与检测方法，本发明设计了一种多通道样品槽，包括单独通道和连通通道，分别在单独通道中构筑不同癌症标记物编码DNA修饰的液晶生物传感界面，构建液晶生物传感器，在连通通道中加入待检测样品，通过分析每个单独通道中的光学信号实现多种癌症标记物的同时检测。

术语说明：

DMOAP：N,N-二甲基-N-[3-(三甲氧硅)丙基]氯化十八烷基铵，CAS:27668-52-6；

OTAB：十八烷基三甲基氯化铵；

室温：具有本领域技术人员公知的含义，一般是指25±2℃。

本发明的技术方案如下：

一种同时检测多种癌症标记物的液晶生物传感器，所述液晶生物传感器包括多通道样品槽，以及不同癌症标记物编码DNA修饰的液晶生物传感界面；所述多通道样品槽包括单独通道和连通通道，连通通道位于单独通道的上方，使得不同单独通道之间的上半部分互相连通；所述不同癌症标记物编码DNA修饰的液晶生物传感界面构筑于多通道样品槽的不同单独通道中。

根据本发明优选的，所述癌症标记物包括但不限于癌胚抗原、前列腺特异性抗原和甲胎蛋白，其中，癌胚抗原编码DNA的核苷酸序列为TAG CTA TAG GGG GT，前列腺特异性抗原编码DNA的核苷酸序列为TAC ATC TGG GAG AG，甲胎蛋白编码DNA的核苷酸序列为TAGATA TGG CAG GA。

本发明中，所述多通道样品槽的单独通道是将不同癌症标记物编码DNA修饰的液晶生物传感界面分隔开，将待检测样品加入连通通道可实现待检测样品在不同单独通道之间的流通。

上述同时检测多种癌症标记物的液晶生物传感器的制备方法，步骤如下：

(1)将玻璃片浸泡于洗液中，70～90℃浸泡30～60min，然后分别采用水、无水乙醇、甲醇各洗涤3～6次，氮气吹干，100～120℃干燥10～20h，室温置于质量浓度为0.1％-3％的DMOAP溶液中15～30min，三次蒸馏水洗涤3～6次，氮气吹干，100～110℃固化3～5h，冷却后即得玻璃基底；

(2)3D打印多通道样品槽，所述多通道样品槽包括单独通道和连通通道，连通通道位于单独通道的上方，使得不同单独通道之间的上半部分互相连通；

(3)将步骤(2)的多通道样品槽固定于步骤(1)的玻璃基底上，将铜网置于单独通道底部，在35～45℃下，将OTAB掺杂的4-氰基-4'-戊基联苯趁热注入铜网中，构筑液晶生物传感界面，液晶生物传感界面厚度与铜网厚度一致；

(4)将多种癌症标记物的编码DNA溶液分别注入步骤(3)处理后的多通道样品槽的不同的单独通道中进行液晶生物传感界面的修饰，室温静置10～20min，用Tris缓冲液洗去游离的编码DNA，即得同时检测多种癌症标记物的液晶生物传感器。

根据本发明优选的，步骤(1)中所述洗液是由质量浓度98％的浓硫酸和质量浓度30％的双氧水按体积比为7:3的比例配制而成。

根据本发明优选的，步骤(3)中所述OTAB掺杂的4-氰基-4'-戊基联苯的制备方法：将OTAB粉末溶于氯仿中配成0.1mM的OTAB的氯仿溶液，将OTAB的氯仿溶液和4-氰基-4'-戊基联苯按照体积比1:1混合，2500rpm涡旋1～5min充分混合，氮气吹干氯仿即得OTAB掺杂的4-氰基-4'-戊基联苯。

本发明中，步骤(3)为增强多通道样品槽与玻璃基底的密封性，采用少许凡士林涂抹于玻璃基底和多通道样品槽之间。

根据本发明优选的，步骤(4)中所述癌症标记物包括但不限于癌胚抗原、前列腺特异性抗原、甲胎蛋白，其中，癌胚抗原编码DNA的核苷酸序列为TAG CTA TAG GGG GT，前列腺特异性抗原编码DNA的核苷酸序列为TAC ATC TGG GAG AG，甲胎蛋白编码DNA的核苷酸序列为TAG ATA TGG CAG GA。

本发明中，步骤(4)编码DNA修饰后的液晶生物传感器对特定序列的DNA加入存在光学响应。

本发明中，步骤(4)编码DNA溶液修饰液晶生物传感界面使液晶生物传感界面的编码DNA达到饱和状态；本发明优选的，步骤(4)中所述编码DNA溶液的浓度≥0.1μM；进一步优选的，所述编码DNA溶液的浓度为0.1～100μM。

根据本发明优选的，步骤(4)中所述Tris缓冲液的pH为7～8。

根据本发明优选的，步骤(4)中所述编码DNA溶液所用溶剂为10mM Tris、20mMNaCl、pH＝7.3的缓冲液。

上述同时检测多种癌症标记物的液晶生物传感器的检测方法，包括步骤如下：

S1、捕获磁珠探针的制备：将磁珠分散液分别与不同癌症标记物适配体1溶液在37℃共孵育0.5～1h，弃去溶液，用磷酸盐缓冲液清洗磁珠3～5次，制得不同癌症标记物的捕获磁珠探针，将不同癌症标记物的捕获磁珠探针共同分散于磷酸盐缓冲液中，得捕获磁珠探针混合分散液；

S2、双链信号探针的制备：将不同癌症标记物适配体2溶液分别与对应的癌症标记物信号DNA溶液等物质的量混合，加热至95℃共孵育5～10min，随后缓慢退火至室温，制得不同癌症标记物的双链信号探针溶液，将不同癌症标记物的双链信号探针溶液混合，得双链信号探针混合溶液；

S3、将待检测样品与S1中捕获磁珠探针混合分散液混匀，在30～40℃下，共孵育30～60min，弃去溶液，用磷酸盐缓冲液清洗3～5次，将清洗后的捕获磁珠探针分散于S2中双链信号探针混合溶液中，在30～40℃下，共孵育30～60min，取上清液，加入液晶生物传感器的多通道样品槽的连通通道中，稳定10min观察液晶光学形貌，根据不同单独通道中液晶光学形貌的变化同时检测多种癌症标记物。

根据本发明优选的，步骤S1中所述癌症标记物适配体1包括但不限于癌胚抗原适配体1、前列腺特异性抗原适配体1和甲胎蛋白适配体1，其中，癌胚抗原适配体1的核苷酸序列是TAT CCA GCT TAT TCA ATT，前列腺特异性抗原适配体1的核苷酸序列是AAT TAA AGCTCG CCA TCA AAT AGC，甲胎蛋白适配体1的核苷酸序列是GTG ACG CTC CTA ACG CTG ACTCAG GTG CAG TTC TCG ACT CGG TCT TGA TGT GGG TCC TGT CCG TCC GAA CCA ATC。

根据本发明优选的，步骤S1中所述磁珠经链霉素亲和素修饰。

根据本发明优选的，步骤S1中所述癌症标记物适配体1经生物素修饰。

本发明中，步骤S1中磁珠分散液与癌症标记物适配体1溶液共孵育后，磁珠达到其饱和吸附量；本发明优选的，步骤S1中所述磁珠与癌症标记物适配体1的比例为1mg磁珠修饰400pmol癌症标记物适配体1。

根据本发明优选的，步骤S1中所述捕获磁珠探针混合分散液中不同癌症标记物的捕获磁珠探针的浓度一致，不同癌症标记物的捕获磁珠探针的总浓度≥0.1mg/mL；进一步优选的，不同癌症标记物的捕获磁珠探针的总浓度为0.1～10mg/mL。

本发明中，步骤S1中磁珠分散液、癌症标记物适配体1溶液的溶剂均为磷酸盐缓冲液。

根据本发明优选的，步骤S2中所述癌症标记物适配体2包括但不限于癌胚抗原适配体2、前列腺特异性抗原适配体2、和甲胎蛋白适配体2，其中，癌胚抗原适配体2的核苷酸序列是TAG CTA TAG GGG GTG AAG GGA TAC CC，前列腺特异性抗原适配体2的序列是TACATC TGG GAG AGC GGA AGC GUG CUG GGC CGU CAG GUC ACG GCA GCG AAG CUC UAG GCGCGG CCA GUU GCC AUA ACC CAG AGG UCG AUG GAU CCU，甲胎蛋白适配体2的序列是TAGATA TGG CAG GAA GAC AAA CAA GCT TGG CGG CGG GAA GGT GTT TAA ATT CCC GGG TCTGCG TGG TCT GTG GTG CTG T。

根据本发明新优选的，步骤S2中所述癌症标记物信号DNA包括但不限于癌胚抗原信号DNA、前列腺特异性抗原信号DNA和甲胎蛋白信号DNA，其中，癌胚抗原信号DNA的核苷酸序列是TTC ACC CCC TAT AGC TA，前列腺特异性抗原信号DNA的核苷酸序列是CCG CTC TCCCAG ATG TA，甲胎蛋白信号DNA的核苷酸序列是GTC TTC CTG CCA TAT CTA。

根据本发明优选的，步骤S2中所述双链信号探针混合溶液中不同癌症标记物的双链信号探针的浓度一致，不同癌症标记物的双链信号探针的浓度分别为10pM-1000pM。

根据本发明优选的，步骤S2中所述癌症标记物适配体2溶液和所述癌症标记物信号DNA溶液的溶剂为10mM Tris、130mM NaCl、10mM KCl、pH＝7.3的缓冲液。

本发明中，步骤S3将待检测样品与捕获磁珠探针混合分散液混匀，待检测样品中的癌症标记物被捕获磁珠探针全部捕获，被捕获磁珠探针捕获的癌症标记物在双链信号探针混合溶液中均有癌症标记物适配体2与之结合；本发明优选的，步骤S3中所述待检测样品与所述捕获磁珠探针混合分散液的体积比为1:(1～10)。

根据本发明优选的，所述磷酸盐缓冲液的组分为：2mM KH

根据本发明优选的，所述检测方法还包括：根据癌症标记物标准溶液及其液晶光学形貌的变化，建立工作曲线，实现对待检测样品中多种癌症标记物的定量检测。

本发明的技术特点如下：

本发明中，3D打印多通道样品槽，多通道样品槽包括单独通道和连通通道，连通通道位于单独通道的上方，消除单独通道之间的间隔，使不同单独通道之间的上半部分互相连通，再将多通道样品槽固定于玻璃基底上，在每个单独通道的底部构筑液晶生物传感界面，并将每个单独通道的液晶生物传感界面采用不同的癌症标记物的编码DNA进行修饰，构筑可以同时检测多种癌症标记物的液晶生物传感器。

将不同癌症标记物适配体1分别与磁珠进行共孵育，制备得到不同癌症标记物的捕获磁珠探针，然后共同分散于磷酸盐缓冲液中，得到捕获磁珠探针混合分散液；将不同癌症标记物适配体2分别与相应的癌症标记物信号DNA进行退火操作，制备得到不同癌症标记物的双链信号探针溶液，混合后得到双链信号探针混合溶液；将待检测样品与捕获磁珠探针混合分散液进行混合，利用适配体1与目标癌症标记物的特异性相互作用捕获待检测样品中的癌症标记物，实现癌症标记物与待检测样品中其他基质的分离与癌症标记物的富集；将捕获了癌症标记物的捕获磁珠探针分散到双链信号探针混合溶液中，同样利用适配体2与目标癌症标记物的特异性相互作用，将适配体2与信号DNA分离，因为适配体2与目标癌症标记物的结合力大于适配体2与互补的信号DNA的结合力，因此，通过置换作用释放游离的信号DNA；将游离的信号DNA溶液加入到由不同癌症标记物编码DNA修饰的液晶生物传感器的多通道样品槽的连通通道中，由于信号DNA和编码DNA序列互补，两者发生高特异性的杂交，利用DNA原位杂交技术，不同单独通道中的编码DNA与相应的信号DNA杂交，改变液晶的排列方式，实现液晶光学信号的变化，利用不同单独通道中光学信号的变化同时检测样品中多种癌症标记物。

有益效果：

1、本发明利用不同癌症标记物编码DNA修饰液晶生物传感器，实现了多种不同癌症标记物的同时检测和定量检测，而且还实现了对极端样品的准确检测，本发明的检测方法样品用量少，检测方便，快速高效，灵敏度高，成本低，无需使用大型仪器，有潜力应用于即时准确地检测癌症标记物。

2、本发明利用磁珠富集分离技术，简便的将目标癌症标记物和其他干扰基质分离，极大的提高了检测的特异性，能够在全血、血浆和血清等生物样品中实现检测。

3、本发明采用液体液晶界面，同时结合DNA界面杂交技术，灵敏度高，无需放大即可满足实际检测需求。

附图说明

图1为癌胚抗原、前列腺特异性抗原和甲胎蛋白检测原理示意图；

图2为实施例1多通道样品槽的三视图及剖面图；

图3为癌胚抗原、前列腺特异性抗原和甲胎蛋白的工作曲线；图中，a为癌胚抗原的工作曲线，b为前列腺特异性抗原的工作曲线，c为甲胎蛋白的工作曲线；

图4为实施例3中血液样品癌胚抗原、前列腺特异性抗原和甲胎蛋白的检测结果柱状图；图中，a为癌胚抗原的检测结果，b为前列腺特异性抗原的检测结果，c为甲胎蛋白的检测结果；纵坐标为血液中癌症标记物的含量；

图5为实施例4中溶血样品癌胚抗原的检测结果柱状图；a为溶血样品与正常血液样品的对比，b为溶血样品液晶生物传感器与商用ELISA试剂盒的对比。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。实施例中涉及的药品若无特殊说明均为普通市售产品。

实施例以癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原(PSA)和甲胎蛋白(AFP)三种癌症标记物为例，对本发明作进一步说明。

实施例中癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原(PSA)和甲胎蛋白(AFP)的检测原理如图1所示，将癌胚抗原适配体1、前列腺特异性抗原适配体1和甲胎蛋白适配体1与磁珠分别进行共孵育，制备癌胚抗原、前列腺特异性抗原和甲胎蛋白的捕获磁珠探针，将三种捕获磁珠探针同时分散于磷酸盐缓冲液中，得到捕获磁珠探针混合分散液；将癌胚抗原适配体2与癌胚抗原信号DNA、前列腺特异性抗原适配体2与前列腺特异性抗原信号DNA、甲胎蛋白适配体2与甲胎蛋白信号DNA分别进行退火操作，制备得到癌胚抗原、前列腺特异性抗原和甲胎蛋白的双链信号探针，将三种双链信号探针混合，得到双链信号探针混合溶液；将捕获磁珠探针混合分散液与待检测样品进行混合，利用适配体1与目标癌症标记物的特异性相互作用捕获待检测样品中的癌症标记物，实现癌症标记物与待检测样品中其他基质的分离与癌症标记物的富集；将捕获了癌症标记物的捕获磁珠探针分散到双链信号探针混合溶液中，同样利用适配体2与目标癌症标记物的特异性相互作用，将适配体2与信号DNA分离，因为适配体2与目标癌症标记物的结合力大于适配体2与互补的信号DNA的结合力，因此，通过置换作用释放游离的信号DNA；将游离的信号DNA加入到已经由癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原(PSA)和甲胎蛋白(AFP)的编码DNA修饰的液晶生物传感器的多通道样品槽的连通通道中，由于信号DNA和编码DNA序列互补，两者发生高特异性的杂交，利用DNA原位杂交技术，不同单独通道中的编码DNA与相应的信号DNA杂交，改变液晶的排列方式，实现液晶光学信号的变化，利用不同单独通道中光学信号的变化同时检测样品中的癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原(PSA)和甲胎蛋白(AFP)。

实施例1：液晶生物传感器的制备

一种同时检测多种癌症标记物的液晶生物传感器的制备方法，步骤如下：

(1)玻璃基底的制备：将载玻片浸泡于60mL由质量浓度98％的浓硫酸和质量浓度30％的双氧水按体积比为7:3的比例配制而成的洗液中，在75℃下，浸泡30min，然后分别采用水、无水乙醇、甲醇各洗涤3次，氮气吹干，在110℃下，干燥12h，室温置于质量浓度为0.5％的DMOAP溶液中15min，三次蒸馏水洗涤5次，氮气吹干，在105℃下，固化3h，冷却后即得玻璃基底；

(2)多通道样品槽的制备：3D打印多通道样品槽，多通道样品槽包括单独通道和连通通道，连通通道位于单独通道的上方，使得不同单独通道之间的上半部分互相连通，本实施例的多通道样品槽的视图如图2所示，多通道样品槽的长为2.8cm，宽为1cm，高为0.6cm，单独通道直径为0.6cm，包括3个并排的单独通道，两通道圆心距为0.9cm，连通通道高为0.2cm；

(3)将步骤(2)制备的多通道样品槽用燕尾夹固定于步骤(1)制备的玻璃基底上，为增强密闭性，在多通道样品槽与玻璃基底之间涂抹少许凡士林，将G75铜网置于单独通道底部，将1.5μL加热到35～45℃的OTAB掺杂的4-氰基-4'-戊基联苯趁热注入铜网中，然后用内径0.5mm的毛细管移除多余的OTAB掺杂的4-氰基-4'-戊基联苯，构筑液晶生物传感界面，液晶生物传感界面厚度与铜网厚度一致，为20μm；

上述OTAB掺杂的4-氰基-4'-戊基联苯的制备方法：将OTAB粉末溶于氯仿中配成0.1mM的OTAB的氯仿溶液，将OTAB的氯仿溶液和4-氰基-4'-戊基联苯按照体积比1:1混合，2500rpm涡旋3min充分混合，氮气吹干氯仿即得OTAB掺杂的4-氰基-4'-戊基联苯；

(4)将癌胚抗原、前列腺特异性抗原和甲胎蛋白的编码DNA分别配成浓度为1μM的溶液，所用溶剂为10mM Tris、20mM NaCl、pH＝7.5的缓冲液，分别向癌胚抗原、前列腺特异性抗原和甲胎蛋白的单独通道中注入相对应的编码DNA溶液，进行液晶生物传感界面的修饰，室温静置10min，随后用Tris缓冲液(pH 7～8)交换通道中的编码DNA溶液，交换十次洗去游离的编码DNA，即得同时检测癌胚抗原、前列腺特异性抗原和甲胎蛋白的液晶生物传感器；

其中，癌胚抗原编码DNA的核苷酸序列为TAG CTA TAG GGG GT，前列腺特异性抗原编码DNA的核苷酸序列为TAC ATC TGG GAG AG，甲胎蛋白编码DNA的核苷酸序列为TAG ATATGG CAG GA。

实施例2：同时检测多种癌症标记物的方法

一种同时检测癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原(PSA)和甲胎蛋白(AFP)的方法，步骤如下：

S1、捕获磁珠探针的制备：将10μL 0.1mg/mL链霉素亲和素修饰的磁珠分散液分别与10μL 0.4μM生物素修饰的癌胚抗原适配体1溶液、前列腺特异性抗原适配体1溶液和甲胎蛋白适配体1溶液在37℃下共孵育0.5h，随后利用市售磁力分离架将磁珠与溶液分离，弃去溶液，用磷酸盐缓冲液清洗磁珠3次，制得三种捕获磁珠探针，随后将三种捕获磁珠探针(各1μg)同时分散到30μL磷酸盐缓冲液中，摇匀，即得捕获磁珠探针混合分散液，捕获磁珠探针混合分散液中捕获磁珠探针的总浓度为0.1mg/mL；

其中，癌胚抗原适配体1的核苷酸序列是TAT CCA GCT TAT TCA ATT，前列腺特异性抗原适配体1的核苷酸序列是AAT TAA AGC TCG CCA TCA AAT AGC，甲胎蛋白适配体1的核苷酸序列是GTG ACG CTC CTA ACG CTG ACT CAG GTG CAG TTC TCG ACT CGG TCT TGATGT GGG TCC TGT CCG TCC GAA CCA ATC；

磁珠分散液和适配体1溶液的溶剂均为磷酸盐缓冲液；

S2、双链信号探针的制备：将60pM的癌胚抗原适配体2溶液、前列腺特异性抗原适配体2溶液、和甲胎蛋白适配体2溶液分别与对应的60pM的癌胚抗原信号DNA溶液、前列腺特异性抗原信号DNA溶液、和甲胎蛋白信号DNA溶液等体积混合，加热至95℃并孵育5min，随后缓慢的退火至室温，制得三种双链信号探针溶液，随后将三种双链信号探针溶液(各自浓度均为30pM)等体积混合，摇匀，得双链信号探针混合溶液，双链信号探针混合溶液中三种双链信号探针的浓度分别为10pM；

其中，癌胚抗原适配体2的核苷酸序列是TAG CTA TAG GGG GTG AAG GGA TAC CC，癌胚抗原信号DNA的核苷酸序列是TTC ACC CCC TAT AGC TA；前列腺特异性抗原适配体2的核苷酸序列是TAC ATC TGG GAG AGC GGA AGC GUG CUG GGC CGU CAG GUC ACG GCA GCGAAG CUC UAG GCG CGG CCA GUU GCC AUA ACC CAG AGG UCG AUG GAU CCU，前列腺特异性抗原信号DNA的核苷酸序列是CCG CTC TCC CAG ATG TA；甲胎蛋白适配体2的核苷酸序列是TAG ATA TGG CAG GAA GAC AAA CAA GCT TGG CGG CGG GAA GGT GTT TAA ATT CCC GGGTCT GCG TGG TCT GTG GTG CTG T，甲胎蛋白信号DNA的核苷酸序列是GTC TTC CTG CCATAT CTA；

适配体2溶液和信号DNA溶液的溶剂均为10mM Tris、130mM NaCl、10mM KCl、pH＝7.5的缓冲液；

S3、将癌胚抗原、前列腺特异性抗原和甲胎蛋白的标准溶液等体积混合，混合的标准溶液中癌胚抗原的浓度范围为0.4～1.6ng/mL，前列腺特异性抗原的浓度为0.1～0.5ng/mL，甲胎蛋白的浓度为0.2～0.8ng/mL，将10μL混合的标准溶液与10μL S1制备的0.1mg/mL捕获磁珠探针混合分散液混合，在37℃下，共孵育30min，用磁力架分离磁珠，弃去溶液，用磷酸盐缓冲液清洗3次，将清洗后的捕获磁珠探针分散到100μL S2制备的10pM双链信号探针混合溶液中，在37℃下，共孵育30min，用磁力架分离磁珠，取上清液，加入到实施例1中制备的液晶生物传感器的多通道样品槽的连通通道中，在摇床中摇动10min后观察液晶光学形貌，根据不同单独通道中液晶光学形貌的变化同时检测多种癌症标记物；

实施例中涉及的磷酸盐缓冲液的组分为：2mM KH

数据处理：利用Photoshop软件计算明亮区域像素，同样利用Photoshop得到全部液晶区域像素，两者之比即为明亮区域占比，利用该方法，得到初始液晶形貌的明亮区域占比，再利用该方法得到加入样品后的液晶明亮区域占比，计算两者之差即为明亮区域变化，以标准物浓度为横坐标，以明亮区域变化为纵坐标做图，得到工作曲线，工作曲线如图3所示，随后检测已知浓度标准液，测定收率在92.1％到110.6％之间；

其中，癌胚抗原(CEA)的工作曲线为y＝44.02x-1.91，R

前列腺特异性抗原(PSA)的工作曲线为y＝155.33x-3.90，R

甲胎蛋白(AFP)的工作曲线为y＝102.85x-2.23，R

实施例3：检测血液中未知浓度的CEA、PSA和AFP

捕获磁珠探针、双链信号探针的制备同实施例2。

抽取血样后立即进行检测，本实施例中所用的样品为健康人的血样样品。

取2μL血液样品，用磷酸盐缓冲液稀释5倍，与10μL 0.1mg/mL的捕获磁珠探针混合分散液在37℃下，共孵育30min，用磁力架分离磁珠，弃去溶液，用磷酸盐缓冲液清洗3次，将清洗后的捕获磁珠探针分散到100μL 10pM的双链信号探针混合溶液中，在37℃下，共孵育30min，用磁力架分离磁珠，取上清液，加入到实施例1中制备的液晶生物传感器的多通道样品槽的连通通道中，在摇床中摇动10min后观察液晶光学形貌。

数据处理：利用Photoshop软件计算明亮区域变化，带入工作曲线，求得CEA、PSA和AFP的浓度，测得的癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原(PSA)和甲胎蛋白(AFP)浓度如图4所示，以商用的ELISA孔板用作检测参照(商用ELISA的操作按照说明书进行)，两者的相对偏差在-11.4％到13.8％之间。

实施例4：检测溶血样品中的癌胚抗原(CEA)

将实施例3中未能立即进行检测的血液保存于肝素管中，检测时将肝素管中的血样用力摇晃，得到溶血血样。

取2μL溶血血样，用磷酸盐缓冲液稀释5倍，与10μL 0.1mg/mL捕获磁珠探针混合分散液在37℃下，共孵育30min，用磁力架分离磁珠，弃去溶液，用磷酸盐缓冲液清洗3次，将清洗后的捕获磁珠探针分散到100μL 10pM双链信号探针混合溶液中，在37℃下，共孵育30min，用磁力架分离磁珠，取上清液，加入到实施例1中制备的液晶生物传感器的多通道样品槽的连通通道中，在摇床中摇动10min后观察液晶光学形貌。

数据处理：利用Photoshop软件计算明亮区域变化，带入工作曲线，求得CEA浓度，得到的癌胚抗原浓度如图5所示，商用的ELISA孔板用作检测参照(商用ELISA的操作按照说明书进行)。

溶血样品利用液晶生物传感器检测得到的CEA浓度数值，与同一批次正常血液样品测量值相对比，数值变化不大(图5a)，而传统ELISA方法所测得溶血样品中CEA的数值均偏高，5个样品中有4个已经超出cutoff值，呈现假阳性(图5b)，说明本发明中的检测方法在极端样品检测中的性能要优于传统ELISA方法。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权力要求所界定的保护范围为准。