一种基于复合蛋白酶酶解技术的微藻高效联产方法及产物

摘要

本发明提供一种基于复合蛋白酶酶解技术的微藻高效联产方法及产物，包括以下步骤：将碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶或胰蛋白酶混合配制复合蛋白酶液，将微藻处理为微藻藻粉；将复合蛋白酶液加入含有微藻藻粉的藻液并均匀混合，运用复合蛋白酶酶解技术对微藻进行预处理；酶解结束后，使用高速离心将预处理后的微藻自藻液中分离，将固相产物干燥作为热解反应的原料，收集含有多肽的上清液；将干燥后的固相产物微藻与废弃植物油混合，进行共催化热解，收集热解中产生的凝结气体并冷凝，得到液相产物为微藻生物油，氮含量较低，燃料性质优越，而富含小分子多肽的上清液可作为制药业、食品生产业的原料使用，从而实现基于复合蛋白酶酶解技术的微藻高效联产。

说明书

技术领域

本发明属于生物质资源化利用领域，尤其涉及一种基于复合蛋白酶酶解技术的微藻高效联产方法及产物。

背景技术

微藻作为藻类植物的一种，由于其脂质含量较高，生命周期较短，不占用农、林业用地且可以高效固氮，成为了制备替代生物柴油的优质原料。但是，微藻内含有大量的蛋白质，其含量可达14.00-65.20％，从而导致微藻热化学转化产品中较高的N含量。微藻热化学转化产品中N元素以吡啶、吲哚、吡咯、嘧啶、胺、酰胺等杂环化合物或非杂环胺类化合物的形式存在，生物油中含氮化合物较高时会导致作为替代燃料燃烧时氮氧化物(NO

发明内容

针对上述技术问题，本发明提出一种于复合蛋白酶酶解技术的微藻高效联产方法及产物，目的在于通过复合蛋白酶酶解技术将以碱性蛋白酶为主酶，以胰蛋白酶或木瓜蛋白酶作为辅酶，按照一定的酶活比配制而成的复合蛋白酶用以对以微藻的微藻的酶解预处理，基于蛋白酶能够通过破坏蛋白质大分子中肽键从而水解蛋白质大分子获得小分子多肽产物的原理，水解微藻细胞中的蛋白质分子并通过高速离心技术分离富含小分子多肽，获得氮含量较低的固体微藻藻渣。继而通过生物质共催化热解技术，使用CaO催化剂，以废弃植物油为共热解物质，以低氮微藻藻渣为原料，获得氮含量较低，燃料性质优越的生物油，而富含小分子多肽的酶解上清液可根据其氨基酸组分作为制药业、食品生产业的原料使用，从而实现基于复合蛋白酶酶解技术的微藻高效联产。

为了降低微藻脱氮的成本，同时保证较高的脱氮效率与低氮固体藻渣产率，本发明应用蛋白酶对微藻进行酶解从而降低微藻氮含量，本发明选用碱性蛋白酶、胰蛋白酶与木瓜蛋白酶作为用于酶解微藻以获得低氮微藻藻渣原料的蛋白酶，以进一步提高蛋白质回收率与多肽产率，以碱性蛋白酶为主酶，以胰蛋白酶或木瓜蛋白酶作为辅酶，且按照主酶与辅酶按照2:1或3:1的酶活比配制而成的复合蛋白酶，用于微藻原料的复合蛋白酶酶解工艺以获得用于热化学转化的低氮微藻原料。

微藻藻粉在复合蛋白酶解后得到的产物为低氮固体藻渣与富集有小分子多肽与部分未水解微藻蛋白质的上清液，低氮固体藻渣在作为优质生物质原料进行共催化热解以获得高品质生物油，可用于优质生物替代燃料的生产，经蛋白酶酶解微藻制备得到的上清液中所含的多肽具有非常高的营养价值，蛋白酶解所得的富含多肽的上清液可作为保健食品、药品的优质生产原料。

为了促进低氮微藻热解中链烷烃类物质的选择性，使生物油成品在物化性质方面与优质商用燃料更为接近，增加其作为替代燃料的可行性，本发明使用CaO催化剂作为低氮微藻催化热解中所用的催化剂，并使用废弃植物油为共热解物质完成低氮微藻酶解后固体产物的催化共热解提质，可以进一步促进废弃植物油中所富含的各类脂肪酸分子的脱羧反应，显著提高生物油产品中链烷烃与醇类物质的含量，并增加低沸点芳族化合物的含量。

本发明所述基于复合蛋白酶酶解技术的微藻高效联产方法，包括如下步骤：选取碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶三种典型蛋白酶，根据三种蛋白酶的特性与对微藻类植物蛋白质的酶解强度，按一定的配比复配成复合蛋白酶用于微藻内蛋白质的酶解与脱氮。微藻酶解后获得的低氮固体相产物可通过催化热解技术转化为氮含量较低、燃料特性优越的生物油产品，而上清液中富集的微藻多肽可根据其氨基酸的实际组成用于制备功能性或保健性食品。本发明将碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶三种蛋白酶按一定配比复配而成的复合蛋白酶运用于微藻的脱氮预处理，在高效脱除微藻中氮含量的同时降低了微藻在脱氮方面的能耗，并将酶预处理后获得的低氮固体相产物通过与废弃植物油进行共催化热解制得氮含量较低、燃料特性优越的生物油。此外，蛋白酶解后上清液中的多肽还可根据其氨基酸成分作为制备功能性或保健性食品的原料使用。整个工艺流程步骤少，循环利用率高，能量消耗少，清洁程度高，具有较高的成本利益与环保效益。

本发明通过以下技术方案实现的：一种基于复合蛋白酶酶解技术的微藻高效联产方法，包括如下步骤：

步骤S1、将碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶或胰蛋白酶混合配制复合蛋白酶液，将微藻处理为微藻藻粉；

步骤S2、将所述复合蛋白酶液加入含有所述微藻藻粉的藻液并均匀混合，运用复合蛋白酶酶解技术对微藻进行预处理；

步骤S3、酶解结束后，使用高速离心将预处理后的微藻自藻液中分离，将固相产物干燥作为热解反应的原料，收集含有多肽的上清液；

步骤S4、将干燥后的固相产物微藻与废弃植物油混合，进行共催化热解，收集热解中产生的凝结气体并冷凝，得到液相产物即为微藻生物油。

上述方案中，所述步骤S1中所述微藻种类为小球藻、斜生栅藻或螺旋藻。

上述方案中，所述复合蛋白酶是以碱性蛋白酶为主酶，木瓜蛋白酶或胰蛋白酶作为辅酶，主酶与辅酶按照2:1或3:1的酶活比配制而成的复合蛋白酶。

上述方案中，所述步骤S1中微藻处理为100目细度的微藻藻粉。

上述方案中，所述步骤S2中运用复合蛋白酶酶解技术对微藻进行酶解预处理具体为：

酶解时间为5-7h，酶解pH值为7.0-9.0，酶解温度为45-55℃，藻液中微藻的质量分数为4-6％，复合蛋白酶使用量为2000-3000U/g底物，酶解底物为微藻藻粉。

上述方案中，所述步骤S3中酶解结束后，调节酶解液pH至4.0，置于沸水浴中10min灭酶，利用高速离心机分离固相产物与液相产物，离心转速为5500r/min，离心时间为15min。

上述方案中，所述步骤S3中对收集的含有多肽的上清液进行氨基酸分析，确定上清液中氨基酸成分后在-20℃条件下避光保存。

上述方案中，所述步骤S4中固相产物与废弃植物油的质量混合比为1:3-1:5；所述催化剂选用CaO催化剂，催化剂添加量为固相产物与废弃植物油总质量的25％。

上述方案中，所述步骤S4中催化热解的反应条件为：热解温度设定为500-600℃，升温速率为10-100℃/s，气相滞留时间为0.5-10s；将混合后的固相产物、废弃植物油与CaO催化剂放入热解反应器中，开始升温，升温期间以0.8L/min的速率吹入氮气，达到设定温度后氮气速率改为0.2L/min。

一种根据所述基于复合蛋白酶酶解技术的微藻高效联产方法制备得到的微藻生物油和含有多肽的上清液。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明使用以碱性蛋白酶为主酶，以胰蛋白酶或木瓜蛋白酶作为辅酶，主酶与辅酶按照2:1或3:1的酶活比配制而成的复合蛋白酶，根据蛋白酶能够通过断裂肽键以分解大分子蛋白质形成小分子多肽的原理，基于复合蛋白酶酶解技术对以微藻为代表的微藻进行酶解预处理，而后将蛋白质酶解后得到的小分子多肽借助高速离心技术分离，从而降低微藻中的氮含量，并通过催化热解将低氮微藻转化为燃料性质优越的生物油，与催化剂脱氮法、低温水解脱氮法相比整体过程绿色环保，环境污染极低，且经济成本较低。在微藻的蛋白酶酶解工艺结束后，根据食品中氨基酸成分检测方法对获得的富含小分子多肽的上清液进行氨基酸成分分析，根据微藻多肽的种类与各组分含量将微藻多肽作为制药业、食品制造业的生产原料使用，实现微藻内蛋白质的高值化利用，提高微藻内组分的整体利用率。将微藻蛋白酶酶解后得到的固相产物在使用CaO催化剂、应用废弃植物油为共催化物进行共催化热解提质。其一可以利用CaO催化剂可以同脱羧反应等路径提高生物油产品中链烷烃的生成，尤其是主要成分为各类脂肪酸的废弃植物油的加入可以进一步促进链烷烃的生成，提升生物油产品在燃料方面的品质，使微藻酶解后的固相产物以至微藻实现进一步高效提质。其二废弃植物油的加入可以有效提高共催化热解后生物油产品的产率，在提高生物油产品质量的同时提高优质生物油产品的产量。最后，使用目前产量巨大且处理难度与成本较高的废弃植物油作为共热解物，具有一定的环保价值与生态价值。综上，本发明运用复合蛋白酶酶解技术对小球藻、斜生栅藻、螺旋藻等进行预处理，将酶解后的微藻藻渣运用高速离心技术分离后作为生物质原料与废弃植物油按1:3-1:5比例混合，在CaO催化剂的作用下通过生物质共催化热解技术转化为燃料性质优良的生物油，并将进行氨基酸成分分析后的富含小分子多肽微藻酶解上清液作为食品业、制药业等行业的生产原料使用，实现微藻的高效多联产。系统整体步骤较少，循环利用率高，污染低，整体能耗较少，原料整体利用率高，具有较高的成本利益与环保价值。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明所述一种基于复合蛋白酶酶解技术的微藻高效联产方法，包括如下步骤：

步骤S1、将碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶或胰蛋白酶按照一定的酶活比配制复合蛋白酶液，将微藻干燥处理为藻粉，而后使用振筛机进行筛分获得100目细度的微藻藻粉，在鼓风干燥箱中干燥至恒重后备用；

步骤S2、将按照一定酶活比配制所得的复合蛋白酶液加入含有微藻的藻液并均匀混合，运用复合蛋白酶酶解技术对微藻进行预处理；

步骤S3、酶解结束后，使用高速离心机将预处理后的微藻自藻液中分离，将固相产物放置于鼓风箱内干燥24h备用，作为生物质热解的原料；收集上清液后对其进行氨基酸成分分析，而后在-20℃条件下避光保存；

步骤S4、将干燥后的固相产物微藻与预先处理好的废弃植物油按一定质量比混合，使用热解反应器进行共催化热解，收集热解中产生的凝结气体并使用冷凝器进行冷凝，冷凝后获得的液相产物即为微藻生物油。

优选的，所述微藻种类为小球藻(Chlorella vulgaris)、斜生栅藻(Scenedesmusobliquus)、螺旋藻(Spirulina)。

优选的，所述复合蛋白酶，是指以碱性蛋白酶为主酶，木瓜蛋白酶或胰蛋白酶作为辅酶，主酶与辅酶按照2:1或3:1的酶活比配制而成的复合蛋白酶。

优选的，所述对收集的上清液中多肽进行成分分析，是指根据GB 5009.124-2016:食品中氨基酸的测定中给出的检测方法检测，在确定上清液中氨基酸成分后在-20℃条件下避光保存，根据氨基酸成分进一步分离其中的多肽成分作为食品、药品、化妆品等的生产原料使用。

优选的，所述对微藻进行酶解预处理，酶解工艺为酶解时间为5-7h，酶解pH值为7.0-9.0，酶解温度为45-55℃，藻液中微藻的质量分数为4-6％，复合蛋白酶使用量为2000-3000U/g底物，所述复合蛋白质酶解技术中酶解底物为微藻藻粉。酶解结束后，调节酶解液pH至4.0，置于沸水浴中10min灭酶。利用高速离心机分离固相产物与液相产物，离心转速为5500r/min，离心时间为15min。

优选的，所述废弃植物油是指经过学校、工厂等单位餐厅多次使用，已不符合食用植物油要求的废弃植物油或食品用或工业用植物油生产厂家库存的已超出最长使用期限的废弃植物油。所使用的废弃植物油的种类包括棕榈油、大豆油、菜籽油等。

优选的，催化热解工艺为热解温度设定为500-600℃，升温速率为10-100℃/s，气相滞留时间为0.5-10s，固相产物与废弃植物油的质量混合比为1:3-1:5，每次热解称取5g固相产物进行热解反应，催化剂选用基于水合煅烧法制备的CaO催化剂，催化剂添加量为固相产物与废弃植物油总质量的25％，催化方式为原位催化。将按比例混合后的固相产物、废弃植物油与CaO催化剂放入热解反应器中，开始升温。升温期间以0.8L/min的速率吹入氮气以提供一个惰性气体氛围，达到设定温度后氮气速率改为0.2L/min。保温1h，冷却至室温，收集产物。

实施例1

(1)复合蛋白酶的配制与小球藻原料的制备

碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶购自北京索莱宝科技有限公司，酶活力由所购蛋白酶的商品标签获得，其中碱性蛋白酶酶活力为200000U/g，木瓜蛋白酶酶活力为100000U/g。将碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶按照2:1的酶活力比配制成复合蛋白酶，在2-6℃条件下避光干燥储存。将小球藻干燥制成小球藻粉，使用振筛机筛分至100目细度，于鼓风干燥箱中在105℃条件下干燥24h备用。

(2)小球藻的酶解预处理

取8g已研磨至100目的小球藻粉于500ml的烧杯中，向其中加入192ml的去离子水，按照2000U/g底物的蛋白酶添加量加入酶活力为16000U的复合蛋白酶，pH值调节至7.0，使用恒温水浴加热装置使混合液在45℃下恒温孵育5小时。达到规定时间后，调节藻液pH值至4.0，置于沸水浴中10min灭活。使用高速离心机将混合物在5500r/min的转速下离心15min，分离上清液于固体相产物。上清液在-20℃条件下避光保存，并取少量样品根据食品中氨基酸的测定法进行氨基酸的定量分析。固体相产物放入鼓风干燥箱于105℃干燥24h备用。固体相产物低氮固体藻渣产率可达到50％以上，脱氮可脱除30-35％。

(3)小球藻的热解转化

取5g酶预处理后的小球藻固体相产物与15g处理后的废弃植物油均匀混合，酶解后小球藻固相产物与废弃植物油质量比为1:3，而后加入5g CaO催化剂，催化剂使用量为废弃植物油与小球藻固体相产物质量之和的25％，均匀混合后置于热解反应器中。设定热解反应温度为500℃，升温速率设定为100℃/s，气相滞留时间为5s，达到设定温度后保温1h热解在氮气气氛保护下进行，升温期间氮气流速设定为0.8L/min，保温期间氮气流速设定为0.2L/min。热解反应器降至室温后，首先收集冷凝后的液体作为小球藻生物油，不可凝气体收集于集气袋内为小球藻生物气，最后打开热解反应器收集剩余固相产物为小球藻生物炭。小球藻生物油于棕色试剂瓶内密封后于2-6℃条件下避光干燥处保存。

实施例2

(1)复合蛋白酶的配制与斜生栅藻原料的制备

碱性蛋白酶与胰蛋白酶购自北京索莱宝科技有限公司，酶活力由所购蛋白酶的商品标签获得，其中碱性蛋白酶酶活力为200000U/g，胰蛋白酶酶活力为250000U/g。将碱性蛋白酶与胰蛋白酶按照3:1的酶活力比配制成复合蛋白酶，在2-6℃条件下避光干燥储存。将斜生栅藻干燥制成斜生栅藻藻粉，使用振筛机筛分至100目细度，于鼓风干燥箱中在105℃条件下干燥24h备用。

(2)斜生栅藻的酶解预处理

取10g已研磨至100目的斜生栅藻藻粉于500ml的烧杯中，向其中加入190ml的去离子水，按照2500U/g底物的蛋白酶添加量加入酶活力为25000U的复合蛋白酶，pH值调节至8.0，使用恒温水浴加热装置使混合液在50℃下恒温孵育6小时。达到规定时间后，调节藻液pH值至4.0，置于沸水浴中10min灭活。使用高速离心机将混合物在5500r/min的转速下离心15min，分离上清液于固体相产物。上清液在-20℃条件下避光保存，并取少量样品根据食品中氨基酸的测定法进行氨基酸的定量分析。固体相产物放入鼓风干燥箱于105℃干燥24h备用。

(3)斜生栅藻的热解转化

取5g酶预处理后的斜生栅藻固体相产物与20g处理后的废弃植物油均匀混合，酶解后斜生栅藻固相产物与废弃植物油质量比为1:4，而后加入6.25g CaO催化剂，催化剂使用量为废弃植物油与斜生栅藻固体相产物质量之和的25％，均匀混合后放置于热解反应器中。设定热解反应温度为550℃，升温速率设定为50℃/s，气相滞留时间为10s，达到设定温度后保温1h热解在氮气气氛保护下进行，升温期间氮气流速设定为0.8L/min，保温期间氮气流速设定为0.2L/min。热解反应器降至室温后，首先收集冷凝后的液体作为斜生栅藻生物油，不可凝气体收集于集气袋内为斜生栅藻生物气，最后打开热解反应器收集剩余固相产物为斜生栅藻生物炭。斜生栅藻生物油于棕色试剂瓶内密封后于2-6℃条件下避光干燥处保存。

实施例3

(1)复合蛋白酶的配制与螺旋藻原料的制备

碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶购自北京索莱宝科技有限公司，酶活力由所购蛋白酶的商品标签获得，其中碱性蛋白酶酶活力为200000U/g,木瓜蛋白酶酶活力为250000U/g。将碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶按照3:1的酶活力比配制成复合蛋白酶，在2-6℃条件下避光干燥储存。将螺旋藻干燥制成螺旋藻粉，使用振筛机筛分至100目细度，于鼓风干燥箱中在105℃条件下干燥24h备用。

(2)螺旋藻的酶解预处理

取12g已研磨至100目的螺旋藻藻粉于500ml的烧杯中，向其中加入188ml的去离子水，按照3000U/g底物的蛋白酶添加量加入酶活力为36000U的复合蛋白酶，pH值调节至9.0，使用恒温水浴加热装置使混合液在55℃下恒温孵育7小时。达到规定时间后，调节藻液pH值至4.0，置于沸水浴中10min灭活。使用高速离心机将混合物在5500r/min的转速下离心15min，分离上清液于固体相产物。上清液在-20℃条件下避光保存，并取少量样品根据食品中氨基酸的测定法进行氨基酸的定量分析。固体相产物放入鼓风干燥箱于105℃干燥24h备用。

(3)螺旋藻的热解转化

取5g酶预处理后的螺旋藻固体相产物与25g处理后的废弃植物油均匀混合，酶解后螺旋藻固相产物与废弃植物油质量比为1:5，而后加入7.5g CaO催化剂，催化剂使用量为废弃植物油与螺旋藻固体相产物质量之和的25％，均匀混合后放置于热解反应器中。设定热解反应温度为600℃，升温速率设定为100℃/s，气相滞留时间为5s，达到设定温度后保温1h热解在氮气气氛保护下进行，升温期间氮气流速设定为0.8L/min，保温期间氮气流速设定为0.2L/min。热解反应器降至室温后，首先收集冷凝后的液体作为螺旋藻生物油，不可凝气体收集于集气袋内为螺旋藻生物气，最后打开热解反应器收集剩余固相产物为螺旋藻生物炭。螺旋藻生物油于棕色试剂瓶内密封后于2-6℃条件下避光干燥处保存。

应当理解，虽然本说明书是按照各个实施例描述的，但并非每个实施例仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施例的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施例或变更均应包含在本发明的保护范围之内。