一种光倒刺鲃的鉴定方法及其应用

摘要

本发明公开了一种光倒刺鲃的鉴定方法及其应用，本发明以光倒刺鲃线粒体16S rRNA基因作为DNA条形码标记基因，涉及引物以用于鉴定光倒刺鲃。基于该引物的鉴定方法具有步骤少、方法简单、需要样品量少、DNA条形码便于保存、方便比对等优势，可以弥补传统形态学分类法的局限，对光倒刺鲃进行准确、迅速的鉴定。同时，也说明该光倒刺鲃DNA条形码序列可以作为光倒刺鲃DNA的标准检测序列，可对光倒刺鲃高效和准确地进行分类。

说明书

技术领域

本发明属于物种鉴定技术领域，具体涉及一种光倒刺鲃的鉴定方法及其应用。

背景技术

分类学是生物学的基础，而物种鉴定一直是生物领域研究的至关重要基础步骤。然而，面对丰富的自然生物圈，传统形态学分类法在物种鉴定中出现了越来越多的局限性，面对表型可塑性、发育阶段差异与性别差异等现象都容易导致物种的错误鉴定；另外，在实际操作中，标本量较少或样本保存不完整等问题，也会导致错误鉴定。

DNA条形码是一种具有足够变异、易于扩增并能代表该物种的相对较短的DNA片段。其通过将待定的DNA序列与数据库中标准序列进行比对，以实现该未知物种的快速鉴定。

光倒刺鲃(Spinibarbus hollandi)，隶属于鲤形目(Cypriniformes)，鲤科(Cyprinidae)，鲃亚科(Barbinae)，倒刺鲃属(Spimibarbus)。主要分布于中国的长江以南各个水系，是一种具有较高营养和药用价值的名优经济鱼类。光倒刺鲃性活泼，喜栖息于溪流水中，具有较强的生理和行为可塑性，其可能出现形态特征的适应性变异，这给光倒刺鲃的形态学鉴定带来了一定的困难。

在现有的技术中，尚未有有效的光倒刺鲃DNA条形码标准检测序列和鉴定方法，因此，继续开发一种能高效鉴定光倒刺鲃的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供引物组；

本发明的另一目的在于提供一种检测试剂；

本发明的另一目的在于提供一种检测试剂盒；

本发明的另一目的在于提供一种光倒刺鲃的检测方法；

本发明的另一目的在于提供上述引物或上述检测试剂盒在鱼类物种鉴定和筛查中的应用。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供：

引物组，该引物组靶向光倒刺鲃线粒体16S rRNA序列。

16S rRNA基因可以作为一种有效的DNA条形码标记基因，其具有拷贝数多、进化速率较快、无组织特异性、重组率较低等优点，可应用于遗传多样性评估、系统进化和种类鉴定等领域。

进一步地，上述引物组的核苷酸序列为：

上游引物F：5'-TTACACCGAGAAGACGTCCA-3'(SEQ ID NO.1)；

下游引物R：5'-GGGCAGGCCTTCTTGTTACT-3'(SEQ ID NO.2)。

本发明的第二个方面，提供：

一种检测试剂，该检测试剂含有上述引物。

上述检测试剂中含有靶向光倒刺鲃线粒体16S rRNA序列的引物，在对品分布在珠江水系的三大支流、长江水系的湘江与赣江支流的5种不同形貌的光倒刺鲃进行鉴定中，检测准确，能有效减少地理差异对样品的影响，可以保障DNA条形码标准检测序列在不同光倒刺鲃群体内适用性和可靠性。

本发明的第三个方面，提供：

一种检测试剂盒，该检测试剂盒含有上述检测试剂。

上述检测试剂盒中含有靶向光倒刺鲃线粒体16S rRNA序列的引物，在对分布在珠江水系的三大支流、长江水系的湘江与赣江支流的5种不同形貌的光倒刺鲃进行鉴定，检测准确，能有效减少地理差异对样品的影响，可以保障DNA条形码标准检测序列在不同光倒刺鲃群体内适用性和可靠性。

进一步地，上述检测试剂盒还含有阳性对照和PCR检测试剂。

更进一步地，上述PCR检测试剂包括2×Taq PCR Master Mix。当然，本领域技术人员可以根据实际情况，合理采用其他本领域常规检测试剂进行替换。

本发明的第四个方面，提供：

一种光倒刺鲃的检测方法，包括以下步骤：

(1)用上述的引物组扩增待测样品DNA，得到扩增产物；

(2)将扩增产物与如SEQ ID NO.3所示序列进行比对，判断待测样品是否为光倒刺鲃。

其中，SEQ ID NO.3所示序列为：

5'-GCCTAACAGCTAGCTTAACCACCCAATAACTAAACAATATAAATAAAATAAAATAAACCCACACCAAAAACTAAACCATTCTTTTACCTGAGTATGGGAGACAGAAAAGGTTCTACTTAAAGCAATAGAGGCAGTACCGCAAGGGAAAGCTGAAAGAGAAATGAAACAATTCACATAAGCATTAAAAAGCAAAGATTAAATCTTGTACCTTTTGCATCATGATTTAGTCAGTACACCCAAGCAAAGAGACCTTTAGTTTGAAACCCCGAAACCAAGTGAGCTACCCCGAGACAGCCTATTAAGGGCCAACCCGTCTCTGTAGCAAAAGAGTGGGAAGAGCTCCGGGTAGAAGTGACAAGCCTACCGAACTTGGTGATAGCTGGTTGCCTAAGAAATGAATAGAAGTTCAGCCTCGTGCCCTCTCTAATCAAGACATACAAACAAGACGCTTAAGAGAGACACACGAGAGTTAGTTAAAGGGGGTACAGCCCCTTTAACAAAGGACACAACCTTTCCAGGAGGATAAGGATCATAATACATAAAACATACTGTTCTAGTGGGCCTAAAAGCAGCCACCTAAACAGAAAGCGTTAAAGCTCAGACAGAAAGAAGTTTATTATTCTGATAAAAAATCTTACTCCCCTAAATACTATTAGGCCAACCCATGCCTACATGGGAAAGACTATGCTAAAATG-3'(SEQ ID NO.3)。

进一步地，上述检测方法的判断标准为：

若扩增产物与如SEQ ID NO.3所示序列的相似度大于等于98％，则待测样品为光倒刺鲃。

进一步地，上述步骤(1)中所述扩增体系为：

反应程序为：94℃预变形3min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，循环35次；72℃终延伸5min。

本发明的第五个方面，提供：

上述引物或上述检测试剂盒在鱼类物种鉴定和筛查中的应用。

进一步地，上述鱼类包括光倒刺鲃。

本发明的有益效果是：

1.本发明通过光倒刺鲃DNA条形码序列作为光倒刺鲃DNA的标准检测序列，对光倒刺鲃样品进行鉴定和分类，操作简单易行。

2.本发明能克服光倒刺鲃的形态特征的适应性变异，消除因表型差异和样品不完整等问题导致的误差，能准确鉴定且快速的完成光倒刺鲃的鉴定。

具体实施方式

为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。

所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。

引物设计

基于光倒刺鲃线粒体16S rRNA(16S ribosomal RNA，16S核糖体RNA)基因，设计得到用于检测光倒刺鲃的引物组，通过筛选得到下述引物组，所述引物组的核苷酸序列如下：

上游引物F：5'-TTACACCGAGAAGACGTCCA-3'(SEQ ID NO.1)；

下游引物R：5'-GGGCAGGCCTTCTTGTTACT-3'(SEQ ID NO.2)。

其中，所使用的光倒刺鲃线粒体16S rRNA基因序列(即光倒刺鲃DNA条形码序列)为：

5'-GCCTAACAGCTAGCTTAACCACCCAATAACTAAACAATATAAATAAAATAAAATAAACCCACACCAAAAACTAAACCATTCTTTTACCTGAGTATGGGAGACAGAAAAGGTTCTACTTAAAGCAATAGAGGCAGTACCGCAAGGGAAAGCTGAAAGAGAAATGAAACAATTCACATAAGCATTAAAAAGCAAAGATTAAATCTTGTACCTTTTGCATCATGATTTAGTCAGTACACCCAAGCAAAGAGACCTTTAGTTTGAAACCCCGAAACCAAGTGAGCTACCCCGAGACAGCCTATTAAGGGCCAACCCGTCTCTGTAGCAAAAGAGTGGGAAGAGCTCCGGGTAGAAGTGACAAGCCTACCGAACTTGGTGATAGCTGGTTGCCTAAGAAATGAATAGAAGTTCAGCCTCGTGCCCTCTCTAATCAAGACATACAAACAAGACGCTTAAGAGAGACACACGAGAGTTAGTTAAAGGGGGTACAGCCCCTTTAACAAAGGACACAACCTTTCCAGGAGGATAAGGATCATAATACATAAAACATACTGTTCTAGTGGGCCTAAAAGCAGCCACCTAAACAGAAAGCGTTAAAGCTCAGACAGAAAGAAGTTTATTATTCTGATAAAAAATCTTACTCCCCTAAATACTATTAGGCCAACCCATGCCTACATGGGAAAGACTATGCTAAAATG-3'(SEQ ID NO.3)。

检测效果验证实验

实施例1

选取北江水系中浈江支流的光倒刺鲃样本进行验证。

(1)提取基因组DNA。

采用生工生物工程(上海)股份有限公司的柱式动物基因组DNA抽提试剂盒进行基因组DNA的提取。操作方法参考试剂盒说明书进行。

(2)PCR扩增。

使用上述引物通过聚合酶链式反应(PCR)扩增步骤(1)得到的基因组DNA，PCR反应体系总体积为25μL，具体组分如下：

表1 PCR反应体系

其中，2×Taq PCR Master Mix(购于生工生物工程股份有限公司)内含0.1U TaqDNAPolymerase/mL、500mmol/L dNTP each、50mmol/L Tris-HCl(pH 8.7)、20mmol/L KCl、4mmol/LMgCl

PCR反应程序如表2所示。

表2 PCR反应程序

(3)琼脂糖凝胶电泳检测和序列测定.

PCR扩增产物用1％琼脂糖电泳检验目的片段后，由生工生物工程(上海)股份有限公司进行纯化并正向测序。

测序并校正后的序列为：

5’-GCCTAACAGCTAGCTTAACCACCCAATAACTAAACAATATAAATAAAATAAAATAAACCCACACCAAAAACTAAACCATTCTTTTACCTGAGTATGGGAGACAGAAAAGGTTCTACTTAAAGCAATAGAGGCAGTACCGCAAGGGAAAGCTGAAAGAGAAATGAAACAATTCACATAAGCATTAAAAAGCAAAGATTAAATCTTGTACCTTTTGCATCATGATTTAGCCAGTACACCCAAGCAAAGAGACCTTTAGTTTGAAACCCCGAAACCAAGTGAGCTACCCCGAGACAGCCTATTAAGGGCCAACCCGTCTCTGTGGCAAAAGAGTGGGAAGAGCTCCGGGTAGAAGTGACAAGCCTACCGAACTTGGTGATAGCTGGTTGCCTAAGAAATGAATAGAAGTTCAGCCTCGTGCCCTCTCTAATCAAGACATACAAACAAGACGCTTAAGAGAGACACACGAGAGTTAGTTAAAGGGGGTACAGCCCCTTTAACAAAGGACACAACCTTTCCAGGAGGATAAGGATCATAATACATAAAACATACTGTTCTAGTGGGCCTAAAAGCAGCCACCTAAACAGAAAGCGTTAAAGCTCAGACAGAAAGAAGTTTATTATTCTGATAAAAAATCTTACTCCCCTAAATACTATTAGGCCAACCCATGCCTACATGGGAAAGACTATGCTAAAATG-3’(SEQ ID NO.4)。

经过对比，该序列与光倒刺鲃DNA条形码序列相似性度为99.71％，可以判断该物种为光倒刺鲃。

实施例2

选取东江水系中增江支流的光倒刺鲃样本进行验证。

鉴定方法如实施例1所示。

测序并校正后的序列为：

5’-GCCTAACAGCTAGCTTAACCACCCAATAACTAAACAATATAAATAAAATAAAATAAACCCACACCAAAAACTAAACCATTCTTTTACCTGAGTATGGGAGACAGAAAAGGTTCTACTTAAAGCAATAGAGGCAGTACCGCAAGGGAAAGCTGAAAGAGAAATGAAACAATTCACATAAGCATTAAAAAGCAAAGATCAAATCTTGTACCTTTTGCATCATGATTTAGCCAGTACACCCAAGCAAAGAGACCTTTAGTTTGAAACCCCGAAACCAAGTGAGCTACCCCGAGACAGCCTATTAAGGGCCAACCCGTCTCTGTGGCAAAAGAGTGGGAAGAGCTCCGGGTAGAAGTAACAAGCCTACCGAACTTGGTGATAGCTGGTTGCCTAAGAAATGAATAGAAGTTCAGCCTCGTGCCCTCTCCAATCAAAACATACAAACAAGACGCTTAAGAGAGACACACGAGAGTTAGTTAAAGGGGGTACAGCCCCTTTAACAAAGGACACAACCTTTCCAGGAGGATAAGGATCATAATACATAAAACATGCTGTTCTAGTGGGCCTAAAAGCAGCCACCTAAACAGAAAGCGTTAAAGCTCAGACAGAAAGAAGTTTATTATTCTGATAAAAAATCTTACTCCCCTAAATACTATTAGGCCAACCCATGCCTACATGGGAAAGACTATGCTAAAATG-3’(SEQ ID NO.5)。

经过对比，该序列与光倒刺鲃DNA条形码序列相似性度为98.99％，可以判断该物种为光倒刺鲃。

实施例3

选取西江水系中柳江支流的光倒刺鲃样本进行验证。

鉴定方法如实施例1所示。

测序并校正后的序列为：

5’-GCCTAACAGCTAGCTTAACCACCCAATAACTAAACAATATAAATAAAATAAAATAAACCCACACCAAAAACTAAACCATTCTTTTACCTGAGTATGGGAGACAGAAAAGGTTCTACTTAAAGCAATAGAGGCAGTACCGCAAGGGAAAGCTGAAAGAGAAATGAAACAATTCACATAAGCATTAAAAAGCAAAGATTAAATCTTGTACCTTTTGCATCATGATTTAGTCAGTACACCCAAGCAAAGAGACCTTTAGTTTGAAACCCCGAAACCAAGTGAGCTACCCCGAGACAGCCTATTAAGGGCCAACCCGTCTCTGTGGCAAAAGAGTGGGAAGAGCTCCGGGTAGAAGTGACAAGCCTACCGAACTTGGTGATAGCTGGTTGCCTAAGAAATGAATAGAAGTTCAGCCTCGTGCCCTCTCCAATCAAAACATACAAACAAGACGCTTAAGAGAGACACACGAGAGTTAGTTAAAGGGGGTACAGCCCCTTTAACAAAGGACACAACCTTTCCAGGAGGATAAGGATCATAATACATAAAACATACTGTTCTAGTGGGCCTAAAAGCAGCCACCTAAACAGAAAGCGTTAAAGCTCAGACAGAAAGAAGTTTATTATTCTGATAAAAAATCTTACTCCCCTAAATACTATTAGGCCAACCCATGCCTACATGGGAAAGACTATGCTAAAATG-3’(SEQ ID NO.6)。

经过对比，该序列与光倒刺鲃DNA条形码序列相似性度为99.57％，可以判断该物种为光倒刺鲃。

实施例4

选取长江水系赣江支流的的光倒刺鲃样本进行验证。

鉴定方法如实施例1所示。

测序并校正后的序列为：

5’-GCCTAACAGCTAGCTTAACCACCCAATAACTAAACAATATAAATAAAATAAAATAAACCCGCACCAAAAACTAAACCATTCTTTTACCTGAGTATGGGAGACAGAAAAGGTTCTACTTAAAGCAATAGAGGCAGTACCGCAAGGGAAAGCTGAAAGAGAAATGAAACAATTCACATAAGCATTAAAAAGCAAAGATTAAATCTTGTACCTTTTGCATCATGATTTAGCCAGTACACCCAAGCAAAGAGACCTTTAGTTTGAAACCCCGAAACCAAGTGAGCTACCCCGAGACAGCCTATTAAGGGCCAACCCGTCTCTGTGGCAAAAGAGTGGGAAGAGCTCCGGGTAGAAGTGACAAGCCTACCGAACTTGGTGATAGCTGGTTGCCTAAGAAATGAATAGAAGTTCAGCCTCGTGCCCTCTCTAATCAAAACATACAAACAAGACGCTTAAGAGAGACACACGAGAGTTAGTTAAAGGGGGTACAGCCCCTTTAACAAAGGACACAACCTTTCCAGGAGGATAAGGATCATAATACATAAAACATACTGTTCTAGTGGGCCTAAAAGCAGCCACCTAAACAGAAAGCGTTAAAGCTCAGACAGAAAGAAGTTTATTATTCTGATAAAAAATCTTACTCCCCTAAATACTATTAGGCCAACCCATGCCTACATGGGAAAGACTATGCTAAAATG-3’(SEQ ID NO.7)。

经过对比，该序列与光倒刺鲃DNA条形码序列相似性度为99.42％，可以判断该物种为光倒刺鲃。

实施例5

选取长江水系湘江支流的光倒刺鲃样本进行验证。

鉴定方法如实施例1所示。

测序并校正后的序列为：

5’-GCCTAACAGCTAGCTTAACCACCCAATAACTAAACAATATAAATAAAATAAAATAAACCCGCACCAAAAACTAAACCATTCTTTTACCTGAGTATGGGAGACAGAAAAGGTTCTACTTAAAGCAATAGAGGCAGTACCGCAAGGGAAAGCTGAAAGAGAAATGAAACAATTCACATAAGCATTAAAAAGCAAAGATTAAATCTTGTACCTTTTGCATCATGATTTAGCCAGTACACCCAAGCAAAGAGACCTTTAGTTTGAAACCCCGAAACCAAGTGAGCTACCCCGAGACAGCCTATTAAGGGCCAACCCGTCTCTGTGGCAAAAGAGTGGGAAGAGCTCCGGGTAGAAGTGACAAGCCTACCGAACTTGGTGATAGCTGGTTGCCTAAGAAATGAATAGAAGTTCAGCCTCGTGCCCTCTCTAATCAAAACATACAAACAAGACGCTTAAGAGAGACACACGATAGTTAGTTAAAGGGGGTACAGCCCCTTTAACAAAGGACACAACCTTTCCAGGAGGATAAGGATCATAATACATAAAACATGCTGTTCTAGTGGGCCTAAAAGCAGCCACCTAAACAGAAAGCGTTAAAGCTCAGACAGAAAGAAGTTTATTATTCTGATAAAAAATCTTACTCCCCTAAATACTATTAGGCCAACCCATGCCTACATGGGAAAGACTATGCTAAAATG-3’(SEQ ID NO.8)。

经过对比，该序列与光倒刺鲃DNA条形码序列相似性度为99.14％，可以判断该物种为光倒刺鲃。

综上所述，5个实施例中的光倒刺鲃样品分别分布于珠江水系的三大支流和长江水系的湘江与赣江支流，具有显著的统计学差异性，而本发明实施例中的鉴定方法有效减少了地理差异对样品的影响，保障DNA条形码标准检测序列在不同区域光倒刺鲃群体内的适用性和可靠性。而且，5种光倒刺鲃样品所测的序列与光倒刺鲃DNA条形码标准检测序列的核苷酸序列的同源性在98％以上，可判断这些样品都是光倒刺鲃。在PCR扩增过程中，5个实施例的PCR反应体系和PCR反应程序均相同，避免了实验过程带入的不可控变量，保证DNA条形码鉴定的准确性。

通过上述实施例的验证，也说明了本发明实施例中的光倒刺鲃DNA条形码序列可以作为光倒刺鲃DNA的标准检测序列，可对光倒刺鲃高效和准确地进行分类。利用该DNA条形码序列对光倒刺鲃样品进行鉴定时，具有步骤少、方法简单、需要样品量少、DNA条形码便于保存、方便比对等优势，可以弥补传统形态学分类法的局限，对光倒刺鲃进行准确、迅速的鉴定。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州大学

<120> 一种光倒刺鲃的鉴定方法及其应用

<130>

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttacaccgag aagacgtcca 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

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<210> 3

<211> 695

<212> DNA

<213> 人工序列

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<211> 695

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<213> Spinibarbus hollandi

<400> 4

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<213> Spinibarbus hollandi

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