一种采用混合菌种发酵制备的风味腐乳及其制备方法

摘要

本发明涉及一种采用混合菌种发酵制备的风味腐乳的制备方法，采用大豆为原料制成的豆腐白坯，喷洒总状毛霉孢子悬浮液至豆腐白坯表面进行前发酵，前发酵的培养温度为18‑25℃；搓毛腌制，喷洒植物乳杆菌发酵液至豆腐坯上，装瓶、灌汤后进行密封后发酵至产品成熟。在发酵阶段通过添加入多种混种进行发酵，能在保持牟定腐乳原有风味和口感的基础上，制备出一种低盐分、高营养，且发酵期较短，可较长时间保存的风味腐乳。

说明书

技术领域

本发明属于豆制发酵腌制品技术领域，具体涉及一种采用混合菌种发酵制备的风味腐乳及其制备方法。

背景技术

腐乳是一种传统的大豆发酵制品，由于其质地细腻，醇香可口，味道鲜美且营养丰富，因而受到国内外消费者的喜爱。特别是我国西南地区云南生产的牟定腐乳，其作为中国国家地理标志产品远销海内外，在牟定腐乳传统生产方法中，出于防腐腌制的目的，通常需要加入过多的食盐，所以，腐乳普遍盐分含量较高，制约了腐乳的消费人群和消费量；同时因为传统生产中发酵多采用单菌纯菌种发酵，发酵时间需要在90~120天左右，如果发酵时间过短则腐乳块硬度和弹性不够，粘附性较差，口感质地无法到达细腻，面呈淡红色等问题。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种在发酵阶段通过添加入多种混种进行发酵，能在保持牟定腐乳原有风味和口感的基础上，制备出一种低盐分、高营养，且发酵期较短，可较长时间保存的腐乳。

具体技术方案是，一种采用混合菌种发酵制备的风味腐乳的制备方法，其特征在于，采用大豆为原料制成的豆腐白坯，喷洒总状毛霉孢子悬浮液至豆腐白坯表面进行前发酵，前发酵的培养温度为18-25℃；搓毛腌制，喷洒植物乳杆菌发酵液至豆腐坯上，装瓶、灌汤后进行密封后发酵至产品成熟。

所述总状毛霉于2018年01月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为∶CGMCCNo.15265，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

所述植物乳杆菌于2018年07月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为∶CGMCCNo.16112，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

进一步，所述豆腐白坯的制备方法为将浸泡好的大豆用砂轮磨磨细，浆渣分离后，加温点卤后切块成豆腐白坯。

进一步，前发酵春秋季发酵时间为55-60h，冬季为55-65h，pH值为3-4，至白坯上长出浓密的长约1-1.5 厘米的白毛。

进一步，所述pH值为3.5。

进一步，所述搓毛腌制为用手抚抹毛坯上毛霉菌丝，使其包裹在豆腐坯上，块块搓开不连合,将搓开的毛坯整齐的码放在塑料盒中，一层豆腐撒一层盐腌制110-120小时。

进一步，所述后发酵采用发酵室室温在25-35℃，发酵60-80天。

进一步，所述总状毛霉孢子悬浮液的浓度为10

进一步，所述植物乳杆菌发酵液浓度为10

进一步，所述总状毛霉孢子悬浮液与所述植物乳杆菌发酵液的喷洒比例为1:0.03-0.1mL。

本发明的第二个技术方案在于提供一种利用上述方法所制备的风味腐乳。

本发明的有益效果：在发酵阶段通过添加入多种混种进行发酵，能在保持牟定腐乳原有风味和口感的基础上，制备出一种低盐分、高营养，且发酵期较短，可较长时间保存的风味腐乳。

生物材料保藏信息：

总状毛霉（Mucor racemosus）于2018年01月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为∶CGMCCNo.15265，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）于2018年07月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为∶CGMCCNo.16112，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

附图说明

图1是本发明的对比实施例中单菌总状毛霉CGMCCNo.15265的前发酵蛋白酶活性分布图。

图2是实施例2送检报告检测数据。

图3是实施例3送检报告检测数据。

具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明采用的的符合《GB 4789.2-2010 食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》、《GB 478915-2010 食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数》对腐乳毛坯的霉菌进行采集、培育，所获的菌种均已在申请日前保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为∶CGMCCNo.16112、保藏编号为∶CGMCCNo.15265，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

通过校企联合以云南牟定天台羊泉、牟定润丰源、牟定华峰、牟定天和等十三家腐乳生产公司采集到的腐乳样品为材料，采用传统生物学筛选，结合形态学、分子生物学鉴定、生理生化鉴定等方法对分离菌种进行鉴定，从腐乳传统生产环境中分离纯化得到多株适合腐乳生产的优质菌株，已保藏了多株可用于腐乳生产的毛霉菌株和植物乳杆菌至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）和中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏。

总状毛霉CGMCCNo.15265可以有效保证腐乳的蛋白酶活力，保证黄度和红度逐渐升高，硬度和弹性不断减小，而粘附性随着发酵的进行不断增大，质地细腻，在保证牟定腐乳风味的基础上，有效缩短发酵时间；植物乳杆菌CGMCCNo.16112则可以有效降低了氨氮和亚硝酸盐的增长，使PH值稳定不升高，同时起到生物型的防腐剂的作用。

对比实施例1：

以单因素试验为基础，采用Design-Erpert8.0中的响应面试验方法中的Optimal方法，以发酵时间和乳酸酸化pH值为考察因素，对行单菌总状毛霉CGMCCNo.15265的前酵工进行试验设计和分析如表1（单菌总状毛霉CGMCCNo.15265的前发酵条件响应面试验方案和结果）和表2（单菌总状毛霉CGMCCNo.15265的前发酵条件回归模型方差分析表）所示：

表1，单菌总状毛霉CGMCCNo.15265的前发酵条件响应面试验方案和结果

利用Design-Erpert8.0软件对数据进行拟合分析，以蛋白酶活力为因变量，以发酵时间A和pH值B为因变量得到的回归方程为：

Y=33.85-4.10A+24.92B+6.88AB-14.07A2-22.69B2。

回归方程及偏回归系数方差分析结果见表2；

表2，单菌总状毛霉CGMCCNo.15265的前发酵条件回归模型方差分析表

注：P<0.0001，差异高度显著(**)；P<0.05，差异显著(*)；P>0.05，差异不显著。

由单菌总状毛霉CGMCCNo.15265的前发酵条件的回归方程及偏回归系数方差分析表可得出，所选择的模型不同处理间差异具有高度显著性（P<0.0001），即可以说明用回归方程来体现各个变量因子和响应值之间的关系，其自变量和因变量之间的线性关系显著，该试验方法可信。失拟项0.2438>0.05，表明回归方程的试验拟合较好，实验过程中出现的误差较小；而校正系数R

由此可以分析结果得出单菌总状毛霉CGMCCNo.15265最佳发酵发酵条件为发酵时间54.88h，pH值为3.55，此时蛋白酶活力40.69µg/mL。

为验证试验结果的可靠性，采用单菌总状毛霉CGMCCNo.15265进行发酵试验。

采用大豆为原料制成的豆腐白坯，豆腐白坯的制备方法为将浸泡好的大豆用砂轮磨磨细，浆渣分离后，加温点卤后切块成豆腐白坯。

喷洒浓度为10

搓毛腌制手抚抹毛坯上毛霉菌丝，使其包裹在豆腐坯上，块块搓开不连合,将搓开的毛坯整齐的码放在塑料盒中，一层豆腐撒一层盐腌制110-120小时。

装瓶、灌汤后进行密封后发酵至产品成熟，发酵采用发酵室室温在25-35℃，酵60-80天。

如图1所示，在前发酵阶段，总状毛霉CGMCCNo.15265生长繁殖开始大量分泌蛋白酶，前半阶段中，随着时间的增加，腐乳毛坯上的霉菌不断生长代谢繁殖，霉菌菌丝不断生长，菌丝群的代谢率处于旺盛期，因而蛋白酶活力不断增长；随着时间的继续增长，腐乳毛坯表面的菌丝开始变黑变黄，出现孢子，霉菌菌丝开始老化，因此前发酵阶段时间选择55-65h为较佳。

对腐乳前发酵过程中的乳酸菌数进行了测定，前发酵第24h时为5.25lg cfu/g，前发酵第48h时为6.23lg cfu/g，前发酵第50h时为7.56lg cfu/g，前发酵第55h时为8.12lgcfu/g，前发酵第60h时为7.82lg cfu/g，前发酵第65h时为7.75lg cfu/g，由此可以看出乳酸菌数在前发酵第55h时达到最高值，而后急剧下降。

这时因为当pH值不断升高时，相应的蛋白酶活力是先递增后减少。当pH为3.5时，蛋白酶活力达到最大。而当pH值继续增加时，酸度不断降低，乳酸对杂菌的抑制力也相应的降低，尽管酸度的降低也能促进总状毛霉CGMCCNo.15265的生长，但此时对杂菌抑制力的功能大于对总状毛霉CGMCCNo.15265生长的促进能力。因此，总状毛霉CGMCCNo.15265的乳酸化的pH值选择3.5左右，为此需要在后发酵过程中适量补充一定量乳酸，即起到pH值稳定不升高，有效降低了氨氮和亚硝酸盐的增长。

实施例1：

植物乳杆菌CGMCCNo.16112的菌种分离提纯鉴定方法：

以云南牟定天台羊泉腐乳生产公司（云南羊泉生物科技股份有限公司）采集到的腐乳样品为材料。


称取10g样品于90mL无菌水中，用玻棒捣碎并强力振荡5 min，即成为10

16S rDNA序列的PCR扩增∶取上述纯化的培养物，采用biosopin细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌基因组DNA，作为PCR扩增的模板，利用16S引物进行PCR扩增。PCR反应体系为50uL∶10xPCR Buffer5uL，基因组 DNA2uL（25nguL），dNTP（脱氧核苷三磷酸，deoxyNTP）0.6 uL（10mmoLL），10pumoL的Primer各2 uL，Taq DNA聚合酶0.6uL（2.5U/uL），ddH;O37.8L。PCR扩增程序∶94℃变性5min，94℃变性30s，50℃退火 30s，72℃延伸90s，30个循环，72℃延伸10min。

16S r DNA扩增产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳进行检验，电泳结果用琼脂糖凝胶成像仪拍照记录，产物送至华大基因公司测序，测序结果拼接后用BLAST程序在GENBANK数据库中进行比对，根据比对结果分析菌种的种属地位和形态特征。

植物乳杆菌CGMCCNo.16112发酵液的制备采用在MRS培养基（含有0.5%CaCO）中，于37℃恒温培养48 h后，转移至制坯中豆腐压块的过滤液中，于35-37℃扩大培养48h，即可获得植物乳杆菌CGMCCNo.16112发酵液。

实施例2：

采用大豆为原料制成的豆腐白坯，豆腐白坯的制备方法为将浸泡好的大豆用砂轮磨磨细，浆渣分离后，加温点卤后切块成豆腐白坯。

喷洒浓度为10

搓毛腌制手抚抹毛坯上毛霉菌丝，使其包裹在豆腐坯上，块块搓开不连合,将搓开的毛坯整齐的码放在塑料盒中，一层豆腐撒一层盐腌制110小时。

喷洒浓度为10

装瓶、灌汤后进行密封后发酵，后发酵采用发酵室室温在25℃，发酵60天。

实施例3：

采用大豆为原料制成的豆腐白坯，豆腐白坯的制备方法为将浸泡好的大豆用砂轮磨磨细，浆渣分离后，加温点卤后切块成豆腐白坯。

喷洒浓度为10

搓毛腌制手抚抹毛坯上毛霉菌丝，使其包裹在豆腐坯上，块块搓开不连合,将搓开的毛坯整齐的码放在塑料盒中，一层豆腐撒一层盐腌制120小时。

喷洒浓度为10

装瓶、灌汤后进行密封后发酵，后发酵采用发酵室室温35℃，发酵80天。

通过对腐乳的硬度进行检测获得，本发明实施例2和实施例3的腐乳在发酵的过程中，前酵阶段由于霉菌菌丝的包裹，使得腐乳毛坯的硬度增大；腌制过程中，腐乳坯的硬度增加幅度很大，这是由于食盐的加入导致水分的析出；但随着后发酵时间的推移，在各种酶的作用下使得腐乳坯内部结构发生变化，以及汤料的渗透使得腐乳的硬度不断减小，对比混合菌种发酵腐乳（实施例2、3）硬度的变化趋势发现，进入后发酵后混合霉菌发酵腐乳（实施例2、3）的硬度的下降速度要大于单菌发酵（对比实施例1）或传统发酵。

比较单菌发酵（对比实施例1）或传统发酵与混合菌种发酵（实施例2、3）过程弹性腐乳变化趋势发现，混合菌种发酵（实施例2、3）的减小速率比单菌种发酵（对比实施例1）或传统发酵减小的速度要快，这主要是因为混合发酵的蛋白酶活力一直能维持在较高，后酵过程中适量补充一定量乳酸（植物乳杆菌CGMCCNo.16112可以高产乳酸），起到维持pH值稳定不升高，且其他各类酶类也具有一定的积累。

通过将实施例2和实施例3的试产产品送检后发现，混合菌种发酵（实施例2、3）的水分含量均小于云南省地方标准DB53/T713-2015《地理标志产品牟定腐乳》的水分含量要求；总酸均小于云南省地方标准DB53/T 713-2015《地理标志产品牟定腐乳》的总酸要求；盐含量均远远小于云南省地方标准DB53/T 713-2015《地理标志产品牟定腐乳》的盐含量要求；氨基态氮均大于云南省地方标准DB53/T 713-2015 《地理标志产品牟定腐乳》的氨基态氮要求；水溶性蛋白均远大于云南省地方标准DB53/T 713-2015《地理标志产品牟定腐乳》的水溶性蛋白要求；色泽、口感、形状均达到云南省地方标准DB53/T 713-2015《地理标志产品牟定腐乳》的色泽、口感、形状要求。

具体检查数据如图2和图3所示，图2为实施例2的送检报告（第2页，第1页有关信息如下所示），报告由楚雄州质量技术监督综合检测中心（云南省酒类产品质量监督检测中心）检测，判断标准为云南省地方标准DB53/T 713-2015《地理标志产品牟定腐乳》，报告编号Y15J20192397，送检日期2019年10月8日，送检样品规格210g/瓶，送检数量8瓶；

图3为实施例3的送检报告（第2页，第1页有关信息如下所示），报告由楚雄州质量技术监督综合检测中心（云南省酒类产品质量监督检测中心）检测，判断标准为云南省地方标准DB53/T 713-2015《地理标志产品牟定腐乳》，报告编号Y15J20192398，送检日期2019年10月8日，送检样品规格200g/瓶，送检数量8瓶。

以上通过具体的和优选的实施例详细的描述了本发明，但本领域技术人员应该明白，本发明并不局限于以上所述实施例，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。