一种同时测定牛奶中13种氨基甲酸酯类农药残留量的方法

摘要

本发明公开了一种同时测定牛奶中13种氨基甲酸酯类农药残留量的方法，包括如下步骤：(1)1.0mg/mL标准储备溶液配制；(2)10.0μg/mL标准中间液配制；(3)标准工作液配制；(4)样品处理；(5)取制备样液进行高效液相色谱‑串联四极杆质谱仪检测，按照外标曲线法计算样液中13种氨基甲酸酯类农药残留的含量，即得牛奶中13种氨基甲酸酯类农药。本发明优点是：大大缩短前处理时间，减少有机溶剂使用量，简单易操作，可用于大批量样品检测，提高检测人员效率。

说明书

技术领域

本发明涉及一种同时测定牛奶中13种氨基甲酸酯类农药残留量的方法，属于农药残留检测技术领域。

背景技术

氨基甲酸酯类农药(N-methylcarhamates，NMCs)是一类高效、广谱型杀虫剂，具有分解快、代谢迅速、残留期短的特性，在青贮饲料种植中得到了广泛应用。然而，由于缺乏对此类农药使用的有效监管，为提高饲料产量盲目大量使用氨基甲酸酯类农药，导致农药残留量超标。动物在长期食用含有氨基甲酸酯类农药的饲料后，会在体内大量富集，而该类农药本身具有遗传毒性和细胞毒性，因此导致人畜中毒现象时有发生。牛奶是一种营养丰富的乳制品，是国民重要的营养来源，保障其质量安全具有重大意义。因此，建立一种快速、高效、简便测定牛奶中多种氨基甲酸酯类农药残留量的方法，对该行业的安全监控意义重大。

目前，农药残留检测的前处理方法和检测方法很多，传统前处理方法主要有基质固相分散法(MSPD)、液-液萃取法(LLE)、凝胶渗透色谱法(GPC)、固相萃取法(SPE)等，这些方法均有制备步骤繁琐，消耗时间长，易造成目标分析物损失等缺点。常用仪器检测法有高效液相色谱法、柱后衍生化荧光检测法、气相色谱法、气相色谱质谱联用法等，这些方法试剂用量大，需要浓缩，或需要进行衍生，操作烦琐，不利于大批量检测。现有的国家标准、进出口行业标准测定氨基甲酸酯类农残，方法较稳定，但很多检测方法需要柱后衍生或用SPE小柱，操作繁琐，检测时间较长，对检测人员操作要求较高。目前对于采用QuEChERS技术测定牛奶中13种氨基甲酸酯类农药的高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)法还尚未见报道。因此建立一种快捷、准确、简便的方法成为测定氨基甲酸酯类农残的一个迫切要求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够利用高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)测定氨基甲酸酯类农药残留的方法，以快速、准确、简便地测定牛奶中13种氨基甲酸酯类农药的残留量。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种同时测定牛奶中13种氨基甲酸酯类农药残留量的方法，包括如下步骤：

(1)1.0mg/mL标准储备溶液配制：分别准确称取一定量的各种氨基甲酸酯类农药标准物质，用甲醇配制成浓度为1.0mg/mL的标准储备溶液，-18℃保存；

(2)10.0μg/mL标准中间液配制：分别准确吸取适量的各氨基甲酸酯类农药标准储备溶液，用甲醇配制成浓度为10.0μg/mL的混合标准中间溶液，-18℃保存；

(3)标准工作液配制：吸取适量的混合标准中间溶液，用空白牛奶样品基质溶液配制成浓度为10、20、50、100、150、200ng/mL的混合标准工作液，0～4℃冰箱中保存，临用现配；

(4)样品处理：

提取：称取试样5g于50mL离心管中，加入15mL 1％乙酸乙腈以及5g无水硫酸钠，均质提取2min，加入2g氯化钠，振荡提取，于8000r/min离心5min，吸取上清液，残渣再用15mL1％乙酸乙腈重复提取1次，合并上清液，混匀；

QuEChERS净化：取5mL上述混合提取液加入1g无水硫酸镁、0.4g乙二胺-N-丙基硅烷和0.1g石墨化碳黑粉净化，涡旋混匀后8000r/min离心5min，取1mL上清液过0.22μm微孔滤膜，待测；

(5)取制备样液进行高效液相色谱-串联四极杆质谱仪检测，按照外标曲线法计算样液中13种氨基甲酸酯类农药残留的含量，即得牛奶中13种氨基甲酸酯类农药。

液相色谱条件为：色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus-C18(150mm×2.1mm，3.5μm)；流速：0.25mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL；流动相：A：0.1％甲酸水，B：0.1％甲酸甲醇梯度洗脱，具体参数见表1过0.22μm滤膜，超声脱气；

表1洗脱梯度

质谱条件为：离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测(MRM)；离子源温度：350℃；气体流速：6L/min；喷嘴电压：45psi；鞘气温度：350℃；鞘气流速：12L/min；

13种氨基甲酸酯类农药定性离子对、定量离子对、碎裂电压及碰撞能量等参数参见表2，带“*”的离子为定量离子。

表2质谱参数

定性定量方法为：以各氨基甲酸酯类农药的相对保留时间和各农药的监测离子对的丰度比为定性依据，各农药的保留时间见表2；用外标法定量，以各农药的峰面积或峰高计算其再样品中的残留量。

(6)残留量可以按以下公式计算：

式中R-样本中氨基甲酸酯类农药含量(ng/g)；

C

V

V

V

S

S

L

L

W-称样量(g)。

本发明与现有技术相比具有如下优势：

(1)大大缩短前处理时间，减少有机溶剂使用量，简单易操作，可用于大批量样品检测，提高检测人员效率。

(2)可节省检测样本，实现同时测定13种氨基甲酸酯类农药。

(3)采用高效液相色谱-串联质谱仪(HPLC-MS/MS)检测，流动相配制简单，无需衍生，操作方便，灵敏度高、回收率高、选择性较好、检出限低。

附图说明

图1为在本发明实施例的方法条件下，13种氨基甲酸酯类农药的标准工作液总离子流图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：

本发明实施例提供高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)法测定牛奶中13种氨基甲酸酯类农药残留量的方法，它采用如下条件：

一种同时测定牛奶中13种氨基甲酸酯类农药残留量的方法，包括如下步骤：

(1)样品处理：

提取：称取试样5g于50mL离心管中，加入15mL 1％乙酸乙腈以及5g无水硫酸钠，均质提取2min，加入2g氯化钠，振荡提取，于8000r/min离心5min，吸取上清液，残渣再用15mL1％乙酸乙腈重复提取1次，合并上清液，混匀；

QuEChERS净化：取5mL上述混合提取液加入1g无水硫酸镁、0.4g乙二胺-N-丙基硅烷和0.1g石墨化碳黑粉净化，涡旋混匀后8000r/min离心5min，取1mL上清液过0.22μm微孔滤膜，待测；

(2)测定：取待测样液进行高效液相色谱-串联四极杆质谱仪检测，按照外标曲线法计算样液中13种氨基甲酸酯类农药残留的含量，即得牛奶中13种氨基甲酸酯类农药。

液相色谱条件为：色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus-C18(150mm×2.1mm，3.5μm)；流速：0.25mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL；流动相：A：0.1％甲酸水，B：0.1％甲酸甲醇(梯度洗脱，具体参数见表1过0.22μm滤膜，超声脱气；

表1洗脱梯度

质谱条件为：离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测(MRM)；离子源温度：350℃；气体流速：6L/min；喷嘴电压：45psi；鞘气温度：350℃；鞘气流速：12L/min；

13种氨基甲酸酯类农药定性离子对、定量离子对、碎裂电压及碰撞能量等参数参见表2，带“*”的离子为定量离子。

表2质谱参数

定性定量方法为：以各氨基甲酸酯类农药的相对保留时间和各农药的监测离子对的丰度比为定性依据，各农药的保留时间见表2；用外标法定量，以各农药的峰面积或峰高计算其再样品中的残留量。

(3)采用本实施例方法进行的检测实验。采集市售牛奶121个样本，测定牛奶样本中氨基甲酸酯类农药，采用国标方法和本实施例方法进行的检测实验。国标方法检测均为阴性且加标回收率符合要求，用本实施例方法进行确证，确证结果显示与国标方法一致。实验证明，本实施例方法准确可靠。

实施例2：性能验证

(1)标准品色谱图：目标物13种氨基甲酸酯类农药分离度较好，峰型较对称，基本没有杂峰干扰，说明在此条件下目标物氨基甲酸酯类农药和杂质能够得到良好的分离，色谱图见图1。

(2)方法线性范围与检出限：在最佳色谱质谱条件下，对标准工作溶液进行测定，以峰面积为纵坐标Y，质量浓度为横坐标X，绘制线性回归方程，得到化合物的线性回归方程，结果见表3。结果表明：待测组分在10～200ng/mL范围内线性关系良好，能满足定量分析的需求。

表3 13种检测物线性回归方程

(3)方法的回收率和精密度。选取阴性样品，采用实验前处理方法处理后，于阴性样品中添加3种不同水平的标准溶液，每个添加水平重复测定6次，计算平均回收率和相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)，结果见表4。表明方法具有较高的准确度，能够满足检测要求。

表4 13种氨基甲酸酯类农药的加标回收率及相对标准偏差(n＝6)

结论：本发明所提供的采用QuEChERS技术结合高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)法测定牛奶中13种氨基甲酸酯类农药残留的方法，大大缩短前处理时间，减少有机溶剂使用量，简单易操作，可节省检测样本，实现同时测定13种氨基甲酸酯类农药，且流动相配制简单，无需衍生，操作方便，能够快速准确的测定牛奶中13种氨基甲酸酯类农药残留量。