一种乳酸左氧氟沙星氯化钠注射液中抗氧剂降解产物的检测方法

摘要

本发明提供一种乳酸左氧氟沙星氯化钠注射液中抗氧剂降解产物的检测方法。本发明采用固相萃取对乳酸左氧氟沙星氯化钠注射液进行处理，并在洗脱前增加特定浓度的醋酸溶液清洗固相萃取柱上的乳酸左氧氟沙星步骤，避免了乳酸左氧氟沙星对2,4‑二叔丁基苯酚、3,5‑二叔丁基‑4‑羟基苯丙酸检测的干扰，然后采用ACQUITY UPLC BEHC18，以体积比为70:30的乙腈‑水溶液为流动相，在280nm检测波长下进行检测，具有灵敏度高、定量准确、检测时间短的优点，可实现对乳酸左氧氟沙星氯化钠注射液中3,5‑二叔丁基‑4‑羟基苯丙酸和2,4‑二叔丁基苯酚的准确定量检测。

说明书

技术领域

本发明涉及药物检测技术领域，尤其涉及一种乳酸左氧氟沙星氯化钠注射液中抗氧剂降解产物的检测方法。

背景技术

乳酸左氧氟沙星是第三代喹诺酮类广谱抗菌药，其注射液在临床上用于治疗由敏感菌引起的感染，疗效确切，目前，乳酸左氧氟沙星注射剂已有注射液批准上市。塑料瓶包装输液产品比玻璃瓶包装输液产品具有质量轻、运输方便、瓶身不易破损、易于保证产品质量、采用易拉环设计开启瓶盖方便等特点，近年来在我国各级医疗机构广泛使用。另外，由于塑料瓶瓶身透光性弱于玻璃瓶，对乳酸左氧氟沙星这种对光敏感容易分解的产品来说更易于储藏，可进一步增加产品效期。

用于输液包装的高分子材料为了防止热氧化降解反应，通常加入抗氧剂来保持高分子材料的优良性能，延缓高分子材料的氧化过程。目前，我国用于输液材料中抗氧剂大多为酚类抗氧剂或亚磷酸类抗氧剂，其中使用最为广泛的是四-[β-(3,5-二叔丁基-4-羟基苯基)丙酸]季戊四醇酯(抗氧剂1010)、亚磷酸三(2，4-二叔丁基苯基)酯(抗氧剂168)、β-(3，5-二叔丁基-4-羟基苯基)丙酸正十八碳醇酯(抗氧剂1076)等。但是，由于输液包装材料与药液直接接触，抗氧剂1010、抗氧剂168或抗氧剂1076等在药液中可能会被氧化或水解，产生降解产物，降解物有可能迁移到药液中，造成制剂污染，引发安全性风险。目前，对抗氧剂的检测方法和迁移规律的研究较多，多采用高效液相色谱法，但是目前HPLC法不能对乳酸左氧氟沙星注射剂的抗氧剂的降解产物进行定量分析。因此，有必要研发一种可以检测抗氧剂降解产物的方法，以加强对乳酸左氧氟沙星注射剂的质量安全控制。

发明内容

针对现有技术中无法对乳酸左氧氟沙星注射液中可能含有的抗氧剂降解产物进行检测的技术问题，本发明提供一种乳酸左氧氟沙星氯化钠注射液中抗氧剂降解产物的检测方法。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：

一种乳酸左氧氟沙星氯化钠注射液中抗氧剂降解产物的检测方法，所述降解产物为2,4-二叔丁基苯酚和3,5-二叔丁基-4-羟基苯丙酸，所述检测方法为固相萃取-高相液相色谱联用法，包括如下步骤：

对照品溶液的配制：取2,4-二叔丁基苯酚和3,5-二叔丁基-4-羟基苯丙酸对照品混合，用溶剂配制成对照品溶液；

固相萃取：将乳酸左氧氟沙星氯化钠注射液过活化后的固相萃取柱，加入0.001-0.003mol/L醋酸溶液冲洗固相萃取柱，然后用甲醇和四氢呋喃依次洗脱，收集洗脱液，溶剂定容，作为供试品溶液；

取对照品溶液和供试品溶液进高效液相色谱仪进行检测。

本发明所述的抗氧剂主要是指抗氧剂1010、抗氧剂168、抗氧剂1076等，以及其他降解产物是2,4-二叔丁基苯酚和3,5-二叔丁基-4-羟基苯丙酸的抗氧剂。

在乳酸左氧氟沙星氯化钠注射液中可能同时存在乳酸左氧氟沙星和抗氧剂的降解产物2,4-二叔丁基苯酚、3,5-二叔丁基-4-羟基苯丙酸三种物质，在通过固相萃取柱富集抗氧剂降解产物时，三种物质都会被富集到固相萃取柱上，采用常规的洗脱步骤不能清洗掉富集在固相萃取柱上的乳酸左氧氟沙星，检测时乳酸左氧氟沙星会影响2,4-二叔丁基苯酚、3,5-二叔丁基-4-羟基苯丙酸的检测。

本发明提供的乳酸左氧氟沙星氯化钠注射液中抗氧剂降解产物的检测方法，在洗脱前增加特定浓度的醋酸溶液清洗固相萃取柱的步骤，充分把固相萃取柱上的乳酸左氧氟沙星去除，且不会洗脱下来2,4-二叔丁基苯酚、3,5-二叔丁基-4-羟基苯丙酸两种物质，从而使得在洗脱时固相萃取柱上仅存在2,4-二叔丁基苯酚、3,5-二叔丁基-4-羟基苯丙酸，从而达到准确定量检测的目的。

优选的，所述固相萃取柱的填料为N-乙烯吡咯烷酮和亲脂性的二乙烯基苯聚合物。

进一步优选的，所述固相萃取柱为Supel-Select HLB SPE固相萃取柱。

优选的色谱柱配合特定的清洗液和洗脱液，有利于实现乳酸左氧氟沙星和2,4-二叔丁基苯酚、3,5-二叔丁基-4-羟基苯丙酸两种物质的分离，从而有利于后续通过高效液相检测法对2,4-二叔丁基苯酚、3,5-二叔丁基-4-羟基苯丙酸两种物质进行准确定量检测。

优选的，所述乳酸左氧氟沙星氯化钠注射液的用量为10-100mL，所述醋酸溶液的用量为5mL。

优选的，所述醋酸溶液的浓度为0.002mol/L。

优选的醋酸溶液的用量有利于将固相萃取柱上富集的乳酸左氧氟沙星充分洗脱下来。

优选的，所述甲醇和四氢呋喃的总体积为10mL，其中甲醇和四氢呋喃的体积比为1:9-9:1。

进一步优选的，所述甲醇和四氢呋喃的总体积为10mL，其中甲醇和四氢呋喃的体积比为6:4。

优选的洗脱液用量，有利于将固相萃取柱上的2,4-二叔丁基苯酚、3,5-二叔丁基-4-羟基苯丙酸两种物质充分洗脱下来，从而有利于准确地对乳酸左氧氟沙星氯化钠注射液中2,4-二叔丁基苯酚、3,5-二叔丁基-4-羟基苯丙酸的含量进行准确定量。

优选的，收集洗脱液后溶剂定容为10mL。

可选的，所述固相萃取柱的活化方法为：取固相萃取柱使用前分别用甲醇10mL和水10mL依次冲洗，整个过程固相萃取柱应保持湿润状态。

优选的，高效液相色谱的检测条件为：

检测器：紫外检测器；

检测波长：280nm；

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18，2.1*100mm，1.7μm；

流动相：体积比为70:30的乙腈-水溶液；

流速：0.38-0.42mL/min；

洗脱方式为等度洗脱。

优选的，柱温为28-32℃，进样体积为3μL。

更优选的，流速为0.4mL/min，柱温为30℃。

优选的，对照品溶液中2,4-二叔丁基苯酚的浓度为6.7μg/mL，3,5-二叔丁基-4-羟基苯丙酸的浓度为0.8μg/mL。

本发明提供的高效液相检测方法经专属性、灵敏度等方法学研究及验证，发现本发明的方法灵敏、准确、重现性较好，能够用更为简便的方法实现对乳酸左氧氟沙星氯化钠注射液中抗氧剂降解产物2,4-二叔丁基苯酚、3,5-二叔丁基-4-羟基苯丙酸两种物质的同时定量检测，且方法简单，分离效果好，灵敏度高，为更好地控制乳酸左氧氟沙星氯化钠注射液产品质量提供了可靠保障，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例1中对照品溶液的高效液相色谱图；

图2为本发明实施例1中采用方法一检测供试品溶液的高效液相色谱图；

图3为本发明实施例1中采用方法二检测供试品溶液的高效液相色谱图；

图4本发明实施例1中采用方法三检测供试品溶液的高效液相色谱图；

图5为本发明实施例1中采用方法三检测样品加标溶液的高效液相色谱图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

对照品溶液的配制：取2,4-二叔丁基苯酚和3,5-二叔丁基-4-羟基苯丙酸对照品混合，用溶剂(体积比1:1的四氢呋喃和甲醇)配制成2,4-二叔丁基苯酚的浓度为6.7μg/mL，3,5-二叔丁基-4-羟基苯丙酸的浓度为0.8μg/mL的对照品溶液。

抗氧剂降解产物2,4-二叔丁基苯酚、3,5-二叔丁基-4-羟基苯丙酸两种物质的HPLC检测条件为：

检测器：紫外检测器；

检测波长：280nm；

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18，2.1*100mm，1.7μm；

流动相：体积比为70:30的乙腈-水溶液；

流速：0.4mL/min；

柱温：30℃；

进样量：3μL；

洗脱方式为等度洗脱。

取上述配制的对照品溶液，按照上述液相色谱条件进样检测，结果如图1所示，从图中可以看出，3,5-二叔丁基-4-羟基苯丙酸的出峰时间为1.262min，2,4-二叔丁基苯酚的出峰时间为2.599min，分离度较高，说明本发明提供的HPLC检测方法可以实现对2,4-二叔丁基苯酚、3,5-二叔丁基-4-羟基苯丙酸的准确定量检测。

方法优化：

为了排除乳酸左氧氟沙星对2,4-二叔丁基苯酚、3,5-二叔丁基-4-羟基苯丙酸的干扰，发明人尝试了多种方法，并选择了多种清洗液对固相萃取柱富集的乳酸左氧氟沙星进行去除。

方法一：

将乳酸左氧氟沙星氯化钠注射液50mL过已活化的固相萃取柱(Supel-Select HLBSPE，6mL)后，依次用6mL甲醇和4mL四氢呋喃依次洗脱，收集洗脱液，用溶剂(体积比1:1的四氢呋喃和甲醇)定容至10mL，过滤，作为供试品溶液。按照上述高效液相色谱条件进行检测，记录色谱图，如图2所示。从图中可以看出，在1.4min和3.6min左右存在明显的鼓包，严重干扰2,4-二叔丁基苯酚、3,5-二叔丁基-4-羟基苯丙酸的检测。

方法二：

将乳酸左氧氟沙星氯化钠注射液50mL过已活化的固相萃取柱(Supel-Select HLBSPE，6mL)后，加水50mL清洗，然后依次用6mL甲醇和4mL四氢呋喃依次洗脱，收集洗脱液，用溶剂(体积比1:1的四氢呋喃和甲醇)定容至10mL，过滤，作为供试品溶液。按照上述高效液相色谱条件进行检测，记录色谱图，如图3所示。从图中可以看出，在1.4-3.5min之间出现明显的鼓包，严重干扰2,4-二叔丁基苯酚、3,5-二叔丁基-4-羟基苯丙酸的检测。

方法三：

发明人意外地发现用0.001-0.003mol/L的醋酸溶液作为清洗剂，可以有效排除乳酸左氧氟沙星对2,4-二叔丁基苯酚、3,5-二叔丁基-4-羟基苯丙酸检测的干扰。

取乳酸左氧氟沙星氯化钠注射液50mL过已活化的固相萃取柱(Supel-Select HLBSPE，6mL)后，加0.002mol/L醋酸溶液5mL，然后依次用6mL甲醇和4mL四氢呋喃依次洗脱，收集洗脱液，用溶剂(体积比1:1的四氢呋喃和甲醇)定容至10mL，过滤，作为供试品溶液。

取乳酸左氧氟沙星氯化钠注射液50mL，精密量取上述配制的对照品溶液1mL加入乳酸左氧氟沙星氯化钠注射液中，混合均匀后过已活化的固相萃取柱(Supel-Select HLBSPE，6mL)后，加0.002mol/L醋酸溶液5mL，然后依次用6mL甲醇和4mL四氢呋喃依次洗脱，收集洗脱液，用溶剂(体积比1:1的四氢呋喃和甲醇)定容至10mL，过滤，作为样品加标溶液。

取上述配制的供试品溶液和样品加标溶液，按照上述高效液相色谱条件进行检测，记录色谱图，如图4-图5所示。其中，图4为供试品溶液的色谱图，图5为样品加标溶液的色谱图，从图4可以看出，供试品溶液中未检出乳酸左氧氟沙星、3,5-二叔丁基-4-羟基苯丙酸和2,4-二叔丁基苯酚。从图5中可以看出，样品加标溶液中，3,5-二叔丁基-4-羟基苯丙酸的出峰时间为1.256min，2,4-二叔丁基苯酚的出峰时间为2.533min，分离度较高，乳酸左氧氟沙星没有产生干扰峰。

计算2,4-二叔丁基苯酚、3,5-二叔丁基-4-羟基苯丙酸的回收率，结果如表1所示。

表1回收率确认结果

因此，确定供试品溶液的制备方法为：取乳酸左氧氟沙星氯化钠注射液50mL过固相萃取柱(Supel-Select HLB SPE，6mL)后，加0.002mol/L醋酸溶液5mL，然后依次用6mL甲醇和4mL四氢呋喃依次洗脱，收集洗脱液，用溶剂(体积比1:1的四氢呋喃和甲醇)定容至10mL，过滤，作为供试品溶液。

实施例2

对照品溶液的配制：取2,4-二叔丁基苯酚和3,5-二叔丁基-4-羟基苯丙酸对照品混合，用溶剂(体积比1:1的四氢呋喃和甲醇)配制成2,4-二叔丁基苯酚的浓度为6.7μg/mL，3,5-二叔丁基-4-羟基苯丙酸的浓度为0.8μg/mL的对照品溶液。

供试品溶液的配制：取乳酸左氧氟沙星氯化钠注射液50mL过固相萃取柱(Supel-Select HLB SPE，6mL)后，加0.002mol/L醋酸溶液5mL，然后依次用6mL甲醇和4mL四氢呋喃依次洗脱，收集洗脱液，用溶剂(体积比1:1的四氢呋喃和甲醇)定容至10mL，过滤，作为供试品溶液。

样品加标溶液的配制：取乳酸左氧氟沙星氯化钠注射液50mL，精密量取上述配制的对照品溶液1mL加入乳酸左氧氟沙星氯化钠注射液中，混合均匀后过固相萃取柱(Supel-Select HLB SPE，6mL)后，加0.002mol/L醋酸溶液5mL，然后依次用6mL甲醇和4mL四氢呋喃依次洗脱，收集洗脱液，用溶剂(体积比1:1的四氢呋喃和甲醇)定容至10mL，过滤，得加标样品溶液。

方法学验证：

2.1专属性

取上述对照品溶液、供试品溶液和样品加标溶液按照上述高效液相色谱条件进行检测，记录色谱图，结果如图1、图4-图5所示，其中，图1为对照品溶液的色谱图，图4为供试品溶液的色谱图，图5为样品加标溶液的色谱图。

从图1可以看出，3,5-二叔丁基-4-羟基苯丙酸的出峰时间为1.262min，2,4-二叔丁基苯酚的出峰时间为2.599min，分离度较高。供试品溶液中没有乳酸左氧氟沙星、3,5-二叔丁基-4-羟基苯丙酸、2,4-二叔丁基苯酚的色谱峰。样品加标溶液中，3,5-二叔丁基-4-羟基苯丙酸的出峰时间为1.256min，2,4-二叔丁基苯酚的出峰时间为2.533min，没有左氧氟沙星的色谱峰。说明本方法专属性良好。

2.2重复性

取6份乳酸左氧氟沙星氯化钠注射液，精密量取50mL，按照上述供试品溶液的制备方法配制6份供试品溶液，按照上述高效液相色谱条件进行检测，结果如表2所示。

表2重复性试验结果

试验结果表明，6份供试品溶液均未检出3,5-二叔丁基-4-羟基苯丙酸、2,4-二叔丁基苯酚，本方法重复性良好。

2.3准确度

取乳酸左氧氟沙星氯化钠注射液6份，精密量取50mL，按照上述供试品溶液的制备方法制备6份供试品溶液。精密量取上述对照品溶液1mL，分别加入6个10mL容量瓶中，分别用供试品溶液定容，得回收率溶液。

取上述6份回收率溶液按照上述高效液相色谱的条件进行检测，记录色谱图，计算回收率，结果如表3-表4所示。

表3 3,5-二叔丁基-4-羟基苯丙酸的回收率试验结果

表4 2,4-二叔丁基苯酚的回收率试验结果

试验结果表明，6份供试品溶液中3,5-二叔丁基-4-羟基苯丙酸的平均回收率为103.58％，RSD为1.86％，2,4-二叔丁基苯酚的平均回收率为99.52％，RSD为0.54％，说明本法准确度较好。

2.4线性范围

精密量取3,5-二叔丁基-4-羟基苯丙酸和2,4-二叔丁基苯酚对照品适量，混合均匀，溶剂定容，分别配制一系列浓度的线性溶液。分别精密量取3μL，按照上述高效液相色谱条件进样检测，记录色谱图，测定峰面积，结果见表5-表6。

表5 3,5-二叔丁基-4-羟基苯丙酸线性试验结果

表6 2,4-二叔丁基苯酚线性试验结果

以上结果表明，3,5-二叔丁基-4-羟基苯丙酸在浓度为0.078～117.718μg/ml范围内线性良好，2,4-二叔丁基苯酚在浓度为0.099～118.681μg/ml范围内线性良好。

2.5检测限和定量限

取上述配制的对照品溶液，用稀释法分别测其定量限(S/N≥10)、检测限(S/N≥3)，结果见表7。

表7检测限和定量限试验结果

试验结果表明，3,5-二叔丁基-4-羟基苯丙酸和2,4-二叔丁基苯酚的检测限浓度分别是0.031μg/mL、0.040μg/mL；定量限浓度分别是0.078μg/mL、0.099μg/mL，定量限溶液重复进样6次，3,5-二叔丁基-4-羟基苯丙酸的RSD仅为1.34％，2,4-二叔丁基苯酚的RSD仅为2.47％，说明本方法灵敏度高。

2.6耐用性

取上述配制的对照品溶液，按照上述高效液相色谱条件进行检测，色谱条件分别考察流速±0.2mL/min，柱温±2℃条件下，分离度的影响，结果如表8-表9所示。

表8流速耐用性试验结果

表9柱温耐用性试验结果

试验结果表明，检测条件在一定范围内变化(流速±0.2mL/min，柱温±2℃)，3,5-二叔丁基-4-羟基苯丙酸和2,4-二叔丁基苯酚仍较高，方法耐用性良好。

实施例3

清洗方法回收率确认：

对照品溶液的配制：取2,4-二叔丁基苯酚和3,5-二叔丁基-4-羟基苯丙酸对照品混合，用溶剂(体积比1:1的四氢呋喃和甲醇)配制成2,4-二叔丁基苯酚的浓度为6.7μg/mL，3,5-二叔丁基-4-羟基苯丙酸的浓度为0.8μg/mL的对照品溶液。

供试品溶液的配制：取乳酸左氧氟沙星氯化钠注射液50mL过已活化的固相萃取柱(Supel-Select HLB SPE，6mL)后，加0.002mol/L醋酸溶液5mL，然后依次用6mL甲醇和4mL四氢呋喃依次洗脱，收集洗脱液，用溶剂(体积比1:1的四氢呋喃和甲醇)定容至10mL，得储备液，备用。

精密量取上述配制的对照品溶液1mL，加入10mL容量瓶中，用上述储备液定容，过滤，作为供试品溶液。

取上述对照品溶液和供试品溶液，按照上述高效液相色谱条件进样检测，记录峰面积，计算回收率，结果如表10所示。

表10回收率确认结果

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。