基于卵巢或阴道脱细胞基质的3D打印复合生物墨水的制备方法及应用

摘要

本发明公开了一种基于卵巢或阴道脱细胞基质的3D打印复合生物墨水的制备方法及应用。制备方法包括以下步骤：a、将预先制备的卵巢或阴道脱细胞基质粉末加入到胃蛋白酶溶液中进行消化；b、在所得的脱细胞基质溶液中滴加碱液，使其pH为7.0‑7.3；c、制备明胶和海藻酸钠的混合胶溶液；d、将步骤c所得的混合胶溶液加入到经步骤b处理的脱细胞基质溶液中，混合均匀后即得到所述复合生物墨水。本发明将脱细胞基质溶液与混合胶溶液经特定比例混合后得到出丝顺畅稳定、打印物成型稳定，且有较好的生物相容性的复合生物墨水。通过实验证明，本发明的复合生物墨水打印的组织材料与天然组织基质更接近，更有利于细胞生长和组织修复。

说明书

技术领域

本发明涉及生物墨水技术领域，具体地说是涉及一种基于卵巢或阴道脱细胞基质的3D打印复合生物墨水的制备方法及应用。

背景技术

卵巢癌、卵巢早衰、多囊卵巢综合征均可造成女性卵子发生发育和排卵障碍致不孕不育，严重影响女性的生殖健康。人工卵巢是未来有希望的生育力保护技术之一。人工卵巢旨在模拟卵巢的两个代表性功能：产生卵子和释放类固醇激素。从解剖学上或理想状态，人工卵巢应该包含从冷冻保存的卵巢组织或其他卵巢组织中分离出来的卵泡，同时还需要一个合适的输送支架，该支架具有生物相容性、最小的炎症反应、生成新生血管且植入后可降解等特性，从而不会干扰卵泡的生长和迁移。按照支架材料的来源，组织工程支架材料主要有天然高分子材料和合成高分子材料。天然高分子材料是指以由重复单元连接成的线型长链为基本结构的高分子量化合物，是存在于动物、植物及生物体内的高分子物质。该材料来源广泛，价格较低，具有良好的生物相容性、生物降解性和亲水性，而且无毒无害。但是有些材料的机械强度和加工性能较差，难以加工成支架且存在降解速度过快的问题。目前，使用较多的天然高分子材料包括胶原、胶原蛋白、海藻酸盐、明胶、琼脂糖、壳聚糖、甲壳素、纤维素、透明质酸等。合成高分子材料如聚乳酸、聚乙烯醇、聚丁酸等，是指用结构和相对分子质量已知的单体为原料，经过一定的聚合反应得到的聚合物。该材料最大优点之一是可以根据临床应用的具体要求定制力学性能，还可以大批量且均匀地制造，并且具有较长的保质期。但是其降解产物可能引起一些免疫排斥反应，对生物体产生不利影响，且不包含细胞粘附所必需的分子，需要加入生物活性因子来刺激这一功能。选择哪种基质用于离体卵泡和细胞的移植是生物工程人造卵巢开发中最具挑战性和最关键的因素之一。

目前，无论是天然高分子材料和合成高分子材料，均已被用于创建人造卵巢原型。但研究表明，天然高分子材料是构成人造卵巢的首选基质。脱细胞的细胞外基质，由于其保留了天然细胞外基质的生理成分、低免疫原性等许多优点，已经被初步用于构建人造卵巢的研究。2015年，Laronda等人首次成功地从脱细胞的牛和人卵巢组织中构建了支架，其支持去卵巢小鼠的卵泡生长和卵巢功能的恢复。2017年，另一项研究将巴马小型猪的卵巢去细胞，然后结合体外和体内研究评估脱细胞卵巢细胞外基质的超微结构和生物相容性。2019年，Pors等人优化了人类卵巢组织的脱细胞方案，并通过将小鼠和人窦前卵泡和其他卵巢细胞重新接种，在体外和体内测试脱细胞支架的生物功能，研究表明脱细胞人卵巢组织能支持人卵泡存活和小鼠卵泡生长。尽管去细胞卵巢组织基质取得了这些有希望的结果，但要在基质的天然孔隙中找到适合不同大小卵泡的精确匹配是非常有挑战性的，严重影响卵泡的种植数量和成活率。一种替代方案是将该基质转化为温敏性水凝胶。这种方法可以完美地包裹分离的卵泡和其他卵巢细胞，同时保留脱细胞的卵巢组织成分。Chiti等人将牛脱细胞卵巢细胞外基质转化为水凝胶并对其进行了表征，证明分离的小鼠窦前卵泡可以成功地在这种基质中存活。

多种先天及后天因素均可导致阴道组织缺失，如先天性无阴道（MRKH综合征）、两性畸形、创伤、肿瘤术后等。患者承受着躯体痛苦和巨大的精神心理压力。传统的阴道重建术利用非阴道组织再造的阴道在功能上有一定的局限性，在形态学及组织学方面与正常阴道差别也较大，还可能发生新阴道的挛缩、坏死、脱垂、肠梗阻及恶变等需要再次手术。本课题组自主研发了猪阴道脱细胞基质材料，获得了国家发明专利，应用其复合间充质干细胞构建的组织工程阴道优于传统小肠粘膜下基质材料构建的组织工程阴道，在形态学和功能学方面均和正常阴道相似。传统的组织工程技术在阴道重建中取得了一定成果，但存在种子细胞成活率低、构建粗糙、缺乏个性化等缺点。3D生物打印能够精确、快速实现支架复杂的宏观外形与内部微细结构的一体化构建，可以实现针对特定患者、特定组织器官的个性化生产，有望实现阴道完美的形态修复和真正意义上的功能重建。

单纯脱细胞基质材料水凝胶机械性能差，在3D生物打印中存在滴落过快，打印物不成型的缺点，不适合直接用于3D打印。因此，研究一种从喷嘴出丝顺畅稳定，打印物成型稳定，且有较好的生物相容性的高活性生物墨水，对解决组织工程阴道和卵巢构建中的技术问题具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于卵巢或阴道脱细胞基质的3D打印复合生物墨水的制备方法及应用，以解决现有组织工程阴道和卵巢存在种子细胞成活率低、构建粗糙、缺乏个性化等问题。

本发明采用的技术方案是：一种基于卵巢或阴道脱细胞基质的3D打印复合生物墨水的制备方法，包括以下步骤：

a、将预先制备的卵巢或阴道脱细胞基质粉末加入到胃蛋白酶溶液中进行消化，得到质量分数为3.0~3.5%的脱细胞基质溶液；其中，所述胃蛋白酶溶液的浓度为18~22 mg/mL；

b、在所得的脱细胞基质溶液中滴加碱液，使pH为7.0-7.3，从而得到流动态的脱细胞基质溶液；

c、制备明胶和海藻酸钠的混合胶溶液，其中，明胶的质量分数为13~17%，海藻酸钠的质量分数为2~4%；

d、将步骤c所得的明胶和海藻酸钠混合胶溶液加入到经步骤b处理的脱细胞基质溶液中，混合均匀后即得到所述复合生物墨水，其中，混合胶溶液与脱细胞基质溶液的体积比为1~3∶3。

步骤a中，所述卵巢脱细胞基质粉末通过以下方法制备：

（1）机械处理：取新鲜的猪/牛/人卵巢组织，去除卵巢周围组织，并将卵巢组织剪成组织块，用冷生理盐水冲洗；

（2）低渗溶液处理：将卵巢组织置于3~5℃含苯甲基磺酰氟的去离子水中，震荡处理36~60h，且每12 h换液一次；

（3）离子型洗涤剂处理：将经步骤（2）处理的卵巢组织置于pH为 7.8~8.2、温度为3~5℃的含苯甲基磺酰氟和十二烷基硫酸钠的Tris-HCl 溶液中，震荡处理10~14h，然后依次用PBS溶液和去离子水进行清洗；

（4）非离子型洗涤剂处理：将经步骤（3）处理的卵巢组织置于pH为 7.8~8.2、温度为3~5℃的含苯甲基磺酰氟和Triton X-100的Tris-HCl 溶液中，震荡处理6~8d，并每12h换液一次；然后依次用PBS溶液和去离子水进行清洗；

（5）酶处理：将经步骤（4）处理的卵巢组织置于pH为 7.3~7.6、温度为35~38℃的含脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶的Tris-HCl 溶液中，震荡处理12~13h，然后依次用PBS溶液和去离子水进行清洗；

（6）打孔：将经步骤（5）处理后的卵巢组织置于温度为3~5℃、质量分数为4~6%的过氧乙酸溶液中，震荡处理1.5~2.5h，然后依次用PBS溶液和去离子水进行清洗；

（7）将经步骤（6）处理后的卵巢组织消毒后冻干，冻干块经研磨即得卵巢脱细胞基质粉末。

步骤a中，所述胃蛋白酶溶液用0.01mol/L的盐酸溶液配制而成，消化处理为：在37℃下震荡处理24~26h。

步骤b中，所述碱液为0.1mM NaOH溶液。

步骤c中，混合胶溶液的配制过程为：将称取的明胶和海藻酸钠置于无菌去离子水溶液中，并于50~55℃融溶混合20~40min。

步骤d中，明胶和海藻酸钠混合胶溶液与脱细胞基质溶液的体积比为2∶3。

上述制备的任一复合生物墨水在3D生物打印人造卵巢或人造阴道中的应用。

所述应用为将复合生物墨水经巴氏消毒后包裹种子细胞，然后置于无菌打印料筒中，3~5℃控温10~20min，之后装入3D打印喷头内，设置喷头温度18~22℃，平台3~5℃控温5-20min，模型导入，并进行参数设置，开始进行3D打印，打印完成后，用5%CaCl2交联5~10min，使打印物成型稳定。

本发明通过将海藻酸钠与明胶按一定比例混合，利用明胶的温控交联特性和海藻酸盐与钙离子交联特性改性脱细胞基质水凝胶的力学性能。将脱细胞基质溶液与混合胶溶液经特定比例混合后得到出丝顺畅稳定、打印物成型稳定，且有较好的生物相容性的复合生物墨水。通过实验证明，本发明的复合生物墨水打印的组织材料与天然组织基质更接近，更有利于细胞生长和组织修复。

附图说明

图1是卵巢脱细胞基质整体和局部形态图。左图为新鲜的卵巢组织（nativeovary）；中图为冷冻前卵巢脱细胞基质（Unfreeze-dried dECMs）；右图为冷冻干燥后的卵巢脱细胞基质（Freeze-dried dECMs ），其质韧，可见生长卵泡在脱细胞前所在的孔隙（如箭头所指）。

图2是卵巢脱细胞基质组织学特性图（HE染色和DAPI染色）。

图3是卵巢脱细胞基质DNA含量分析图。

图4是卵巢脱细胞基质蛋白质或肽的SDS - PAGE检测图。

图5是卵巢脱细胞基质胶原蛋白和蛋白多糖的检测图。

图6是脱细胞卵巢基质的扫描电镜图。

图7是原生胶制备过程图。

图8是原生胶的扫描电镜图。

图9是原生胶流变学检测图。

图10是原生胶圆二色谱检测图。其中，A是常温圆二色谱，B是变温圆二色谱，C是二级拟合结构。

图11是原生胶试打印的照片。

图12是复合生物墨水试打印的照片。

图13是不同体积比复合生物墨水的扫描电镜图。

图14是不同体积比复合生物墨水的流变学检测图。

图15是不同体积比复合生物墨水的常温圆二色谱检测结果图。

图16是不同体积比复合生物墨水的变温圆二色谱检测结果图。

图17是不同体积比复合生物墨水的细胞活死实验结果图。

图18是MTT法检测不同体积比复合生物墨水的细胞增殖活性结果图。

图19是复合生物墨水异种皮下移植后生物相容性检测结果图。

图20是基于阴道脱细胞基质的生物墨水包裹大鼠骨髓间充质干细胞的生长情况。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明，实施例中未提及的试剂和操作均按本领域的常规操作实施。本发明阴道脱细胞基质材料可参考专利文件（申请号：201510584734.3）公开的方法进行制备。

实施例1 卵巢脱细胞基质的制备

母猪死后10min 内取新鲜卵巢组织（如图1所示），冷生理盐水充分清洗后，进行如下处理：

（1）机械处理：去除卵巢周围组织，将卵巢组织剪成5mm×5mm×5mm的组织块，再次冷生理盐水冲洗。

（2）低渗溶液处理：将卵巢组织置于4℃含 0.1mM PMSF的去离子水中，130 转，48h，每12 h换液一次。

（3）离子型洗涤剂处理：置于4℃含0.1mM PMSF 和 0.1% SDS的10mM Tris-HCl 溶液中，pH 8.0，130 转，12 h。之后，PBS 4℃，130 转，30min，每 15min 换液一次。去离子水4℃，130转，30min，每15min换液一次。

（4）非离子型洗涤剂处理：置于 4℃含 0.1mM PMSF 和 1% Triton X-100的10 mMTris-HCl 溶液中，pH 8.0，130转，7d，每12h换液一次。之后，PBS 4℃，130转，30min，每15min 换液一次。去离子水 4℃，130转，30min，每15min换液一次。

（5） 酶处理：核酸酶溶液（含 50 U/ml 脱氧核糖核酸酶Ⅰ 和 1 U/ml 核糖核酸酶A）, pH 7.5，37℃，80 转，12h。之后，PBS 4℃，130 转，30min，每 15min 换液一次。去离子水 4℃，130转，30min，每15min 换液一次。

（6）打孔：5%过氧乙酸 4℃，80 转，2h。PBS 4℃，130 转，30min，每15min 换液一次。去离子水 4℃，130 转，30min，每 15min换液一次。

（7）消毒：0.1%过氧乙酸和20%乙醇溶液 25℃，130 转，2h。无菌 PBS 4℃，130转，30min，每15min换液一次。无菌去离子水 4℃，130 转，30min，每15min换液一次。

（8）冻干备用：将卵巢组织（弃去组织表面过多的水）平铺于紫外线照射过的塑料板上，置于-80℃冻干机进行冷冻干燥，-20℃保存备用（冻干前后照片如图1所示）。

对上述制备的脱细胞基质材料进行表征检测：

（1）HE染色：取冻干后卵巢组织约 1cm×0.3cm大小，4%多聚甲醛固定，石蜡定向包埋，连续5µm切片。取石蜡切片，常规脱蜡水化后苏木素液10s，水洗0.5%盐酸酒精分色 10s，流水蓝化10s，水洗，伊红液10s，脱水透明，中性树胶封片，光镜观察未见细胞成分残留（如图2所示）。

（2）DAPI染色：取石蜡切片，常规脱蜡水化后DAPI 10µL，直接封片，光镜观察，未见细胞成分残留（如图2所示）。

（3）DNA含量检测

取新鲜卵巢组织和脱细胞后冻干卵巢组织，称重，用动物组织基因组 DNA 提取试剂盒（天根）提取 DNA，按说明书操作，分光光度计 NanoDrop 2000 测量 DNA 含量。脱细胞基质DNA含量为 48.4±1.88ng/m，相较于新鲜卵巢组织含量( 861.83±18.06ng/mg )，有统计学差异 ( P < 0.0001 )（如图3右图所示）。

（4）DNA大小检测

琼脂糖凝胶电泳检测脱细胞处理后卵巢组织所含 DNA 片段大小，新鲜卵巢组织作为对照。结果显示脱细胞基质材料在1.5%的琼脂糖中跑出的凝胶电泳图像中仅在新鲜猪卵巢组织中可见 DNA 条带的迁移，脱细胞处理后无明显DNA 条带（结果如图3左图所示）。

（5）蛋白质或多肽的检测：十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测 (SDS -PAGE )，直至蛋白质区带清晰，拍照。结果表明卵巢脱细胞基质存在各种蛋白质（如图4所示）。

（6）胶原蛋白和蛋白多糖的检测：Masson染色和甲苯胺蓝 ( Toluidine Blue,TB) 染色。卵巢脱细胞基质胶原纤维与脱细胞前卵巢组织相似，散布于卵巢各处持续存在（Masson染色）；甲苯胺蓝 ( Toluidine Blue, TB ) 染色亦可见脱细胞后蛋白多糖保持不变（如图5所示）。

（7）扫描电镜观察卵巢脱细胞基质超微结构。脱细胞后各断面均无细胞成份残留（图.6A-6E），三维结构和完整性得到很好的保存。卵巢脱细胞基质的低倍显微照片显示（图.6A-6B），一旦被不同类型的细胞填充，就会形成一个复杂的纤维网络，具有多孔结构。高倍镜下（图.6C-6E），卵泡细胞外基质结构完好无损，细胞外基质的孔壁内可见胶原纤维（白色箭头，图.6E-6F），壁内还含有柔性的纤连蛋白纤维（黑色箭头，图.6E），这些纤维的取向和结构几乎没有受到影响。

实施例2脱细胞基质溶液（原生胶）的制备（过程如图7所示）

（1）研磨：将冻干后猪卵巢脱细胞基质于研磨机中加适量液氮研磨成粉末状，-20℃保存备用。

（2） 消化：取0.1g上述粉末置于分别含15mg（5mg/mL）、30mg（10mg/mL）、40mg（15mg/mL）和60mg（20mg/mL）胃蛋白酶的3mL 0.01mol/L盐酸溶液中，制备成3.33%脱细胞基质溶液，即原生胶，设定摇床37℃，80转，24h。

（3）中和：在上述所制溶液中滴加0.1mM NaOH溶液约0.7mL，使其由酸性（pH 3.2-3.5）变成中性（pH 7.0-7.3），凝胶固态变为流动态，不可逆。

通过瓶倒转法检测4种不同蛋白酶浓度所制原生胶均符合水凝胶特征，但仅有20mg/mL胃蛋白酶所制水凝胶无任何块状未消化物，避免了3D打印时未消化物堵塞针孔的情况，故选为后续3D打印所用水凝胶。

对上述制备的原生胶进行鉴定：

（1）扫描电镜观察原生胶超微结构。原生胶呈现多孔的网络状结构（如图8所示）。

（2）原生胶流变检测

将上述所制备原生胶置于MAL1160979高级旋转流变仪样品台上，进行流变学表征，测量G'（储能模量，storage modulus）及G"（损耗模量，loss modulus）随振幅、频率、时间的变化。测试配件：PTD200，DG26.7测试系统。进行振幅扫描。结果显示G' 远远高于G"，材料显示固体特性（如图9所示）。

（3）原生胶圆二色谱检测

开氮气，将流量计调到3L/min，吹扫20min后，开启氙灯，打开Chirascan软件设置实验参数。用超纯水将原生胶稀释成5mg/mL溶液上机检测，超纯水作为背景溶剂扣除基线。进行常温圆二色谱和变温圆二色谱检测。结果显示其最大正吸收峰位于222.5nm，最大负吸收峰位于197.5nm，呈倒 ” S ”形，为典型的胶原三螺旋构象。由热变性曲线得知三螺旋结构的解旋主要发生在45-70℃之间，Tm=55.61℃（如图10所示）。

实施例3 原生胶试打印

启动捷诺飞二代生物打印系统。

取上述中性原生胶1mL装入无菌料筒（规格：5mL），针直径0.34mm，嵌入低温喷头，并将其固定在生物打印机上，喷头温度设置为20℃，打印台温度保持在4°C。设置气压→开始出丝。经调试不同出丝压力、温度及控温时间等参数，原生胶均不能正常出丝，表现为液态水滴状（如图11所示）。

实施例4 复合生物墨水的制备

上述3mL中性原生胶分别加3mL、2mL、1mL、0.75mL的15%明胶+3%海藻（55℃、30min融溶混匀）混合液，形成4种体积比（原生胶与混合胶溶液体积比分别为3∶3、3∶2、3∶1、4∶1）的复合生物墨水，巴氏消毒，置于4℃冰箱待3D打印。结果显示4种不同体积比（3∶3、3∶2、3∶1、4∶1）墨水均在高温（＞37℃）时凝胶变性熔化，低温（4℃）时凝胶复性凝固，为热敏水凝胶。

实施例5 复合生物墨水试打印

使用CAD软件绘制具有网格几何结构的3D结构，将其转化保存为STL格式，应用捷诺飞二代生物打印系统进行打印。取上述各体积比墨水1mL装入无菌料筒（规格：5mL），针直径0.34mm，嵌入低温喷头，并将其固定在生物打印机上，喷头温度保持在20°C，打印台温度控制在4°C。模型导入→参数设置（层数、层厚、针孔直径、气压、出丝速度等）→设备校准（平台测高、喷头测高）→开始打印。结果显示3种体积比（3∶3、3∶2、3∶1）墨水均能形成均匀的线条，正常出丝。4∶1体积比墨水出丝较短，有滴落现象（如图12所示）。不同体积比打印参数设置见下表：

对上述3种体积比的墨水进行检测：

（1）将上述制备的3种体积比墨水于-80℃冻干机真空冷冻干燥24h，扫描电镜观察。结果显示3∶1体积比生物墨水的孔隙疏松致密不一致，3∶2体积比生物墨水的孔隙相对均匀致密，3∶3体积比生物墨水的孔隙更加均匀致密（如图13所示）。

（2）流变学检测，由结果可知3∶3生物墨水机械强度最好，3∶2生物墨水次之，3∶1生物墨水强度最弱（如图14所示）。

（3）圆二色谱检测可见3种墨水均具有典型的胶原三螺旋构象（倒 “ S ” 形），3∶3和3∶2生物墨水三螺旋结构的解旋主要发生在45-70℃之间，Tm分别为59.2、59.0℃。3∶1生物墨水三螺旋结构的解旋主要发生在40-80℃之间，Tm为=49.2℃（如图15和图16所示）。其二级拟合结构如下表所示：

（4）细胞活死实验：3种生物墨水分别包裹昆明小鼠卵巢颗粒细胞进行3D打印（每毫升墨水包裹1x10

（5）MTT法检测细胞增殖活性：3种生物墨水分别包裹昆明小鼠卵巢颗粒细胞进行3D打印（每毫升墨水包裹2x10

综上所述，原生胶所占比例越大，细胞生存状态越好，而明胶和海藻酸盐所占比例越大，生物墨水机械强度越大，而3∶2生物墨水无疑是最佳选择。

实施例6 生物相容性检测

实验鼠按 0.04mg/kg 0.5%戊巴比妥钠麻醉，待角膜反射及翻正反射消失后背部备皮，75%酒精消毒，将体积比3∶2生物墨水皮下注射小鼠背部两侧。

分别在第1、2、4、9周予小鼠安乐死进行取材，每个时间段收集6枚组织块，浸入4%多聚甲醛中固定，包埋蜡块用于制备组织切片，行HE染色和CD45 抗体免疫组织化学染色，光镜观察。

所有大鼠在植入后9周内均存活，无并发症发生。植入一周后在复合生物墨水表面即可见血管生成反应。HE和免疫组化结果显示，植入后1-2周炎细胞逐渐增多，而2到9周炎细胞逐渐减少。随着时间的迁移，生物墨水的体积也逐渐减小。这些数据表明生物墨水在异种皮下移植中的生物相容性良好（如图19所示）。

实施例7 阴道脱细胞基质复合生物墨水的检测

按上述相同方法制备基于猪阴道脱细胞基质的复合生物墨水，并进行了相似的检测，其与卵巢脱细胞基质的复合生物墨水具有类似的性质，将其包裹间充质干细胞并进行检测，结果显示细胞生长状态良好（如图20所示）。