骨髓间充质干细胞复合猪阴道脱细胞基质构建大鼠组织工程阴道的初步研究

摘要

目的：
　　探索应用骨髓间充质干细胞（BMSCs）复合猪阴道脱细胞基质（AVM）构建的大鼠组织工程阴道是否优于单纯应用AVM。
　　方法：
　　取20日龄雄性S D大鼠分离双侧股骨及胫骨，采用全骨髓贴壁法培养BMS C s。取第3代BMS Cs与AVM复合培养24h，扫描电镜观察细胞在支架上的生长情况。CM.dil标记第3代细胞，荧光显微镜观察染色情况及标记效率。将第3代BMS Cs以1×105/c m2的细胞密度与AVM复合培养，分别于复合后1、3、5、7天行MTT法检测BMS Cs在AVM上的增殖情况。经阴道全切雌性SD大鼠阴道构建动物模型。根据构建方式不同分为三组：（1）标记的BMSCs复合AVM，即复合BMSCs组，（2）单纯AVM构建大鼠组织工程阴道，即单纯支架组，（3）正常大鼠阴道作为对照组。分别于术后1、2、3、4、8周取材行大体形态观察，HE、Masson染色行微观形态学观察，冰冻切片荧光显微镜下观察阴道组织中BMSCs向上皮细胞，平滑肌细胞、神经细胞、血管内皮细胞的分化情况。组织浴槽法对新阴道进行功能学评价，试验开始前给予124 mM的高钾溶液，若反应不良将组织条弃掉。给予频率(10~100 Hz)，电压30V的电刺激，观察肌条反应情况，再分别给予不同浓度的去氧肾上腺素（10-6~2*10-4M）、酚妥拉明（10-5~2*10-4M）、卡巴胆碱(10-6~10-4M)、阿托品(10-5~10-4 M)后观察肌条反应。
　　结果：
　　全骨髓贴壁法培养的BMSCs具有成纤维细胞样形态，90％融合时成漩涡状或放射状生长。荧光显微镜观察CM.dil标记后的BMSCs，骨髓间充质干细胞胞膜呈红色荧光，细胞核不着色，标记效率几乎可达100%。扫描电镜观察发现大体观察发现，BMSCs牢固附着于AVM上，呈长梭形。MTT法检测BMS Cs与AVM复合培养后第7天细胞在支架上的细胞活性最佳。复合BMSCs组与单纯支架组均形成了新生阴道，术后8周两组新阴道均粘膜化，接近正常组织形态。HE、Mas so n染色后微观形态学观察发现，术后1周，复合BMSCs组可见少量上皮组织，单纯支架组仅可见未降解的AVM支架材料，两组均可见较多炎症细胞浸润。术后2周，复合BMSCs组上皮组织覆盖重建阴道全长，单纯支架组术后3周上皮组织才达重建阴道全长，术后4周两组上皮层细胞排列更加规则，更接近正常组织。复合BMSCs组纤维组织较单纯支架组排列更加规整。术后8周复合BMSCs组可见大量规整的平滑肌纤维，单纯支架组仅可见杂乱纤细的肌纤维。免疫荧光染色发现BMSCs可直接分化为平滑肌细胞、血管内皮细胞、神经细胞促进组织的再生。BMSCs也可能通过旁分泌作用、免疫调节作用促进组织再生。功能学检测发现，复合BMSCs组新阴道对药物及电刺激反应均优于单纯支架组。
　　结论：
　　复合BMSCs组与单纯支架组均可成功构建组织工程阴道，复合BMSCs组织工程阴道从形态学及功能学方面均优于单纯AVM支架组。BMSCs可通过直接分化作用促进大鼠组织工程阴道重建，并且可能通过旁分泌作用及免疫调节作用促进大鼠组织工程阴道重建。

目录

声明

英文缩写

前言

材料与方法

1 材料和仪器

2 实验方法

结果

1 大鼠BMSCs的形态学观察

2 荧光显微镜观察CM.dil标记后的BMSCs

3 扫描电镜观察BMSCs在AVM支架上的生长情况

4 MTT结果

5 大体观察

6 HE及Masson染色

7 免疫荧光检测

8 组织工程阴道的功能学检测结果

附图

讨论

结论

参考文献

综述:间充质干细胞在女性盆底功能障碍性疾病中的应用

致谢

个人简历