一种可视化快速、灵敏检测炭疽杆菌的试剂及其检测方法

摘要

本发明涉及一种实现炭疽杆菌生物标志物二吡啶甲酸可视化检测的Eu3+‑小分子配合物传感器及其制备方法。将邻苯二酚类化合物与Eu3+进行螯合，得到具有比色和荧光双响应的配合物，通过二次吡啶甲酸与配合物反应发生的光物理学性质改变，实现对二吡啶甲酸的快速可视化检测。本发明配合物具有合成简单、检测快速的特点，对目标检测物有很高的灵敏度及选择性，进而实现裸眼监测二吡啶甲酸动态水平变化，并可负载于试纸上，成为快速可视化检测炭疽杆菌的优异工具，具有广泛的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一种可视化快速、灵敏检测炭疽杆菌的试剂及其检测方法，属于发光技术领域。

背景技术

炭疽芽孢杆菌是革兰氏阳性芽孢菌，属于需氧型菌类。炭疽是食草动物的一种主要疾病，可通过土壤中、皮毛上的芽孢导致感染。炭疽芽孢可以通过人类的呼吸道、消化道和皮肤间接感染人类，以皮肤型炭疽最为常见。由于炭疽芽孢在环境中的抵抗力极强，由此在军事方面，一直被各个国家列为是头号生物战剂，而吡啶-2, 6-二甲酸(DPA)作为炭疽芽孢杆菌壳层的主要组成成分，大约占据了干炭疽杆菌芽孢质量5-15%，因此可以通过可视化且定量检测DPA的含量来间接检测炭疽芽孢杆菌动态水平。

目前，检测炭疽杆菌芽孢的方法主要有生物方法和化学方法。其中，生物分析方法主要涵盖聚合酶链式反应和疫分析法，而化学方法分为高效液相色谱法、毛细管电泳法、电化学法、表面增强拉曼光谱法等。虽然这些都有着各自的优点，但这些方法依然存在着分析时间长，且操作复杂和成本高等不足，不能达到快速检测的目的。近年来，三价镧系离子独特的发光特性，如大的斯托克斯位移、窄发射带和优异的荧光寿命等，被广泛应用于光敏材料的制备。目前，有关荧光法检测吡啶-2, 6-二甲酸的研究逐渐增多，然而这些往往需要各精细的纳米粒子或者其他纳米手段，往往涉及到繁琐的合成和纯化步骤，导致反应周期长，合成成本高。因此，寻找合成简单、绿色高效、成本低廉、可以大规模推广的新型检测方法仍然是研究的重点领域。

发明内容

本发明的目的是针对当前检测吡啶-2, 6-二甲酸技术中存在的不足，提供一种高效可视化、特异性选择性地检测炭疽杆菌标志物吡啶-2, 6-二甲酸的试剂及其检测方法。

本发明实现过程如下：

一种可视化快速、灵敏检测炭疽杆菌的试剂，所述试剂为结构式（I）所示的化合物与三价铕离子形成的配合物，

所述R选自氢、羟基、氨基、硝基、卤素、C1-C4的烷基、C1-C4的烷氧基，优选为氢和羟基。

所述配合物的制备方法为：将可溶性三价铕盐与结构式（I）所示的化合物共同溶于水后干燥即可。所述三价铕盐与结构式（I）所示的化合物的摩尔比为：1:100~100:1，优选为1:10~10:1。

在载体上负载结构式（I）所示的化合物与三价铕离子形成的配合物得到检测炭疽杆菌的传感器，所述传感器是将配合物负载于载体之上，所述载体包括纸张、玻璃片、塑料片、金属片等，所述传感器能够检测吡啶-2, 6-二甲酸的浓度范围为0.1 μM～100 μM。

结构式（I）所示的化合物与三价铕离子形成的配合物在检测炭疽杆菌中的应用。

发明人研究发现，在结构式（I）所示的邻苯二酚类希夫碱化合物存在条件下，Eu

本发明的有益效果是：（1）已报道的关于荧光法检测吡啶-2, 6-二甲酸的方法需要制备精准的纳米粒子或者其他纳米手段，繁琐的合成和纯化步骤，导致配体制备周期长，合成成本高。本发明只需要在水溶液中进行简单混合就能达到高灵敏的检测目的，操作简便、绿色高效且成本低廉，还可以利用肉眼观察和简单的荧光强度对比，实现快速、准确地分析吡啶-2, 6-二甲酸水平变化。（2）选择性实验表明：体系中存有邻苯二甲酸，间苯二甲酸，对苯二甲酸，烟酸，异烟酸，2-吡啶甲酸，苯甲酸，L-谷氨酸，L-天冬氨酸和烟酰胺腺嘌双核甘酸等，络合物只有在吡啶-2, 6-二甲酸的作用下使荧光强度产生明显的变化以及裸眼可见的颜色变化，因此本方法具有良好的选择性。同时在5倍上述干扰物溶液中加入吡啶-2, 6-二甲酸溶液，发现此时荧光强度与单独加入相同浓度吡啶-2, 6-二甲酸溶液的荧光强度基本一致，证明了即使在干扰物氨基酸和和芳香配体共存情况下也不会干扰络合物对吡啶-2, 6-二甲酸的检测，具有优异的选择性。(3)本发明可以实现微量吡啶-2, 6-二甲酸的快速检测，检测限可以分别达到8.3 nM, 10.4 nM，比炭疽病的感染浓度低四个数量级。

附图说明

图1为实施例2中主体溶液不加吡啶-2，6-二甲酸和加入100μM吡啶-2，6-二甲酸后的发射光谱图；

图2为实施例2中主体溶液在荧光滴定过程中以啶-2，6-二酸浓度为横坐标，615nm处的荧光强度为纵坐标的线性拟合图；

图3为实施例2中主体溶液对各类酸在615nm处荧光强度柱状图及含吡啶-2，6-二甲酸的主体溶液在5倍干扰物溶液下的柱状图。(1-11依次为邻苯二甲酸，间苯二甲酸，对苯二甲酸，烟酸，异烟酸，2-吡啶甲酸，苯甲酸，L-谷氨酸，L-天冬氨酸，烟酰胺腺嘌昤双核甘酸，叱啶-2，6-二酸)；

图4为实施例3中主体溶液不加吡啶-2，6-二甲酸和加入100μM吡啶-2，6-二甲酸后的发射光谱图；

图5为实施例3中主体溶液在荧光滴定过程中以吡啶-2，6-二甲酸浓度为横坐标，615nm处的荧光强度为纵坐标的线性拟合图；

图6为实施例3中主体溶液对各类酸在615nm处荧光强度柱状图及含吡啶-2，6-二甲酸的主体溶液在5倍干扰物溶液下的柱状图。(1-11依次为邻苯二甲酸，间苯二甲酸，对苯二甲酸，烟酸，异烟酸，2-吡啶甲酸，苯甲酸，L-谷氨酸，L-天冬氨酸，烟酰胺腺嘌昤双核甘酸，叱啶-2，6-二酸)。

具体实施方式

为了更清楚的说明本发明，列举以下实施例，但其对发明的范围无任何限制。

本发明的技术方案为:

一种可视化快速、灵敏检测炭疽杆菌标志物—吡啶-2, 6-二甲酸的水溶液，组成为：

所述可视化检测炭疽杆菌标志物—吡啶-2, 6-二甲酸的水溶液的应用方法，主要分为以下几个步骤:将滤纸裁剪成pH试纸条大小，浸泡在上述溶液中30 min，50℃烘干，便可得到用于检测炭疽杆菌标志物—吡啶-2, 6-二甲酸的检测试纸；

将上述滤纸条浸入待测溶液中，停留0.5-1秒后抽出，在日光下观察颜色；DC-1显现蓝紫色则说明溶液中含有吡啶-2, 6-二甲酸，DC-2显现蓝色则说明溶液中含有吡啶-2,6-二甲酸；不显示红色或者蓝色则意味着溶液中不含有吡啶-2, 6-二甲酸。

实施例1

(1) 邻苯二酚希夫碱DC-1（R=H）、DC-2（R=OH）制备路线如下式，

DC-1的制备方法：

在干燥的50 mL两口圆底烧瓶中，依次加入276 mg（2 mmol）3,4-二羟基苯甲醛、152 mg（1 mmol）3,5-二氨基苯甲酸和15 mL甲醇（色谱级），搅拌固体溶解。将反应瓶转移至油浴锅中，升温至85℃，回流反应3 h，反应液变由淡黄色变为红色固体混浊。反应结束后，抽滤，滤饼用乙酸乙酯和DCM洗涤多次纯化，干燥后得到红色固体391 mg。产率：98%。熔点：>200℃；IR (KBr):

DC-2的制备方法：

在干燥的50 mL两口圆底烧瓶中，依次加入308 mg（2 mmol）2,3,4-三羟基苯甲醛、152 mg（1 mmol）3,5-二氨基苯甲酸和15 mL甲醇（色谱级），搅拌固体溶解。将反应瓶转移至油浴锅中，升温至85℃，回流反应3 h，反应液由淡黄色溶液变为红色固体混浊。反应结束后，抽滤，滤饼用甲醇和DCM洗涤多次纯化，干燥后得到红色固体410 mg。产率：96%。熔点：>200℃；IR (KBr):

按照类似的合成方法，可以合成得到R为氨基、硝基、卤素、乙烷基、甲氧基的配体。

实施例2

（1）称取19.0 mg DC-1于100mL烧杯中，加入19.6 mL水，室温下搅拌50分钟至完全溶解且均匀分散，然后向其中加入400 μL 0.1M EuCl

（2）取3mL主体溶液于石英池中，在激发波长为280nm处测11次空白的荧光发射光谱。用1 μL进样器加入不同浓度吡啶-2, 6-二甲酸(DPA)溶液(荧光滴定)。荧光测试采用采用北京卓立汉光OmniFluo900系列荧光光谱仪，用75 W的氙灯作为激发光源，配有一个激发单色光镜，一个发射单色光镜，单光子计数器和一个制冷型电倍增管。荧光发射光谱是以280 nm为最大激发波长，615 nm为最大发射波长测得。

随后，我们进行了一系列的实施例，通过逐渐增加步骤(2)中吡啶-2, 6-二甲酸水溶液的浓度，测出了一系列荧光数据，表现出了相应的荧光变化。图1为主体溶液不加吡啶-2，6-二甲酸（黑色）和加入100μM吡啶-2，6-二甲酸（红色）后的发射光谱图。

图2为主体溶液在荧光滴定过程中以啶-2，6-二酸浓度为横坐标，615nm处的荧光强度为纵坐标的线性拟合图。以吡啶-2, 6-二甲酸浓度为横坐标（浓度范围为0 – 100 μM），615 nm处的荧光强度为纵坐标进行线性拟合。随着吡啶-2, 6-二甲酸浓度的增大，

（3）取3 mL主体溶液于石英池中，并另外吸取10份相同的溶液(共计11组相同溶液);选取1份加入15 μL 18 mM吡啶-2, 6-二甲酸溶液，另外的10份溶液分别加入相同浓度且体积相等的10种不同成分干扰组分溶液(分别为邻苯二甲酸，间苯二甲酸，对苯二甲酸，烟酸，异烟酸，2-吡啶甲酸，苯甲酸，L-谷氨酸，L-天冬氨酸，烟酰胺腺嘌昤双核甘酸)(此时石英池中的叱啶-2, 6-二羧酸和各干扰溶液浓度均为90 μM，搅拌均匀，在最大激发波长为280 nm，最大发射波长为615 nm处测其荧光发射光谱。

（4）取3 mL.主体溶液于石英池中，加入50 μL 18 mM干扰组分溶液(分别为邻苯二甲酸，间苯二甲酸，对苯二甲酸，烟酸，异烟酸，2-吡啶甲酸，苯甲酸，谷氨酸，天冬氨酸，烟酰胺腺嘌呤双核甘酸)(此时石英池中的干扰溶液浓度为450 μM)，搅拌均匀，在最大激发波长为280 nm，最大发射波长为615 nm处测其荧光发射光谱。再向其中加入15 μL 18 mM吡啶-2, 6-二甲酸溶液(此时石英池中的干扰溶液浓度为450 μM，吡啶-2, 6-二甲酸溶液浓度为90 μM)，搅拌均匀，在最大激发波长为280 nm，最大发射波长为615 nm处测其荧光发射光谱。

图3为分别为在主体溶液中加入各类酸性溶液（橙色）和在含有干扰溶液的主体溶液中加入吡啶-2, 6-二甲酸后在615nm处的荧光强度的柱状图（绿色）。从图中可以看出，主体溶液对吡啶-2, 6-二甲酸溶液有非常明显的荧光响应，并在5倍氨基酸和和芳香配体的共存情况下，依旧能够实现对吡啶-2, 6-二甲酸的荧光响应，证明了主体溶液依然对吡啶-2, 6-二甲酸具有优异的选择性。

主体溶液分别加入吡啶-2, 6-二甲酸溶液和干扰组分溶液后在615nm处的荧光强度发生明显的变化。其中，主体溶液对吡啶-2, 6-二甲酸溶液有非常显著的荧光响应，因此该络合体可以选择性识别吡啶-2, 6-二甲酸。另外，在日光和254nm紫外灯照射下肉眼可以观察到只有加入吡啶-2, 6-二甲酸能够发生明显得地颜色变化，分别转变为蓝紫色，红色。

（5）将普通滤纸裁剪成pH试纸大小的滤纸条，浸泡在步骤(3)中溶液中，50℃烘干，得到可用于检测吡啶-2, 6-二甲酸的检测试纸。将上述滤纸分别浸入100 μM吡啶-2, 6-二甲酸溶液和上述干扰溶液中停留0.5-1秒后抽出，在日光下和254 nm紫外灯下观察颜色。

紫外灯下，肉眼可以观察到只有浸泡吡啶-2, 6-二甲酸溶液的检测试纸条呈红色，其它为无色；日光下，肉眼可以观察到只有浸泡吡啶-2, 6-二甲酸溶液的检测试纸条呈蓝紫色，其它为无色。

实施例3

（1）准确称取29.0 mg DC-2于100mL烧杯中，加入19.6 mL水，室温下搅拌50分钟至完全溶解且均匀分散，然后向其中加入400 μL 0.1M EuCl

（2）取3mL主体溶液于石英池中，在激发波长为280nm处测11次空白的荧光发射光谱。用1 μL进样器加入不同浓度吡啶-2, 6-二甲酸(DPA)溶液(荧光滴定)。荧光测试采用采用北京卓立汉光OmniFluo900系列荧光光谱仪，用75 W的氙灯作为激发光源，配有一个激发单色光镜，一个发射单色光镜，单光子计数器和一个制冷型电倍增管。荧光发射光谱是以280 nm为最大激发波长，615 nm为最大发射波长测得。

图4为实施例3中主体溶液不加吡啶-2，6-二甲酸（黑色）和加入100μM吡啶-2，6-二甲酸（红色）后的发射光谱图。随后，我们进行了一系列的实施例，通过逐渐增加步骤(2)中吡啶-2, 6-二甲酸水溶液的浓度，测出了一系列荧光数据，表现出了相应的荧光变化。

图5为主体溶液在荧光滴定过程中以吡啶-2，6-二甲酸浓度为横坐标，615nm处的荧光强度为纵坐标的线性拟合图。以吡啶-2, 6-二甲酸浓度为横坐标（浓度范围为0 – 100μM），615 nm处的荧光强度为纵坐标进行线性拟合。随着吡啶-2, 6-二甲酸浓度的增大，

（3）取3 mL主体溶液于石英池中，并另外吸取10份相同的溶液(共计11组相同溶液);选取1份加入15 μL 18 mM吡啶-2, 6-二甲酸溶液，另外的10份溶液分别加入相同浓度且体积相等的10种不同成分干扰组分溶液(分别为邻苯二甲酸，间苯二甲酸，对苯二甲酸，烟酸，异烟酸，2-吡啶甲酸，苯甲酸，L-谷氨酸，L-天冬氨酸，烟酰胺腺嘌昤双核甘酸)(此时石英池中的叱啶-2，6-二羧酸和各干扰溶液浓度均为90 μM，搅拌均匀，在最大激发波长为280 nm，最大发射波长为615 nm处测其荧光发射光谱。

（4）取3 mL.主体溶液于石英池中，加入50 μL 18 mM干扰组分溶液(分别为邻苯二甲酸，间苯二甲酸，对苯二甲酸，烟酸，异烟酸，2-吡啶甲酸，苯甲酸，谷氨酸，天冬氨酸，烟酰胺腺嘌呤双核甘酸)(此时石英池中的干扰溶液浓度为450 μM)，搅拌均匀，在最大激发波长为280 nm，最大发射波长为615 nm处测其荧光发射光谱。再向其中加入15 μL 18 mM吡啶-2, 6-二甲酸溶液(此时石英池中的干扰溶液浓度为450 μM，吡啶-2, 6-二甲酸溶液浓度为90 μM)，搅拌均匀，在最大激发波长为280 nm，最大发射波长为615 nm处测其荧光发射光谱。

图6为分别为在主体溶液中加入各类酸性溶液（橙色）和在含有干扰溶液的主体溶液中加入吡啶-2, 6-二甲酸后在615nm处的荧光强度的柱状图（绿色）。从图中可以看出，主体溶液对吡啶-2, 6-二甲酸溶液有非常明显的荧光响应，并在5倍氨基酸和和芳香配体的共存情况下，依旧能够实现对吡啶-2, 6-二甲酸的荧光响应，证明了，主体溶液依然对吡啶-2, 6-二甲酸具有优异的选择性。

（5）将普通滤纸裁剪成pH试纸大小的滤纸条，浸泡在步骤(3)中溶液中，50℃烘干，得到可用于检测吡啶-2, 6-二甲酸的检测试纸。将上述滤纸分别浸入100 μM吡啶-2, 6-二甲酸溶液和上述干扰溶液中停留0.5-1秒后抽出，在日光下和254 nm紫外灯下观察颜色。

紫外灯下，肉眼可以观察到只有浸泡吡啶-2, 6-二甲酸溶液的检测试纸条呈红色，其它为无色；日光下，肉眼可以观察到只有浸泡吡啶-2, 6-二甲酸溶液的检测试纸条呈蓝色，其它为无色。

综上所述，本发明通过对邻苯二酚类希夫碱(DC-1和DC-2)与铕离子复合后形成的络合物的使用，实现了对吡啶-2, 6-二甲酸的裸眼识别及区分检测，检测限分别为8.3 nM,10.4 nM。并且可以排除邻苯二甲酸，间苯二甲酸，对苯二甲酸，烟酸，异烟酸，苯甲酸，L-谷氨酸等其他氨基酸和芳香物的干扰；同时在5倍干扰物共存下还具有优异的选择性，实现了对吡啶-2, 6-二甲酸的简便、低成本的检测，同时达到了灵敏度高，选择性好，抗干扰能力强的目的。

初步试验表明，R为氨基、硝基、卤素、乙基、甲氧基的配体也具有如实施例2和3所述的性能。