烟草氯离子通道蛋白基因NtCLC-F及其应用

摘要

本发明属于烟草基因工程技术领域，具体涉及烟草氯离子通道蛋白基因NtCLC‑F及其应用。该基因碱基序列如SEQ ID NO.1所示。烟草氯离子通道蛋白NtCLC‑F由726个氨基酸残基组成，其中第181‑500位氨基酸保守氯离子通道蛋白结构域。该蛋白与植物叶片中氯离子含量相关，降低该蛋白表达后，叶片中氯离子含量明显升高。本发明通过对特定烟草氯离子通道NtCLC‑F的初步研究，发现其与烟草氯离子含量高度相关，在将该基因沉默后，烟草中氯离子含量发生了明显升高。基于这一特性，可为氯离子含量调控烟草新品种培育一定的应用基础和参考借鉴。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，特别是指烟草基因工程技术领域，具体涉及氯离子通道蛋白基因NtCLC-F及其应用。

背景技术

烟叶原料是卷烟工业的基础。近年来，我国烟叶原料生产整体水平有了明显的提高，但是烟叶原料质量距卷烟工艺配方的需要还有一定的差距，尤其是部分烟区如黄淮烟区烤烟及海南雪茄烟氯离子含量偏高，其中黄淮烟区烟叶氯离子连续多年远远高于全国水平，严重影响了本地区烟叶原料在高档产品中应用，然而南方部分烟区如四川、重庆、福建等省份烟叶多年来一直处于烟叶最适氯离子范围之外，同样会影响烟叶含水量等外观质量。

一般认为，烟叶氯离子含量以0.3-0.8％为宜，含量达到1％时会影响阴燃持火性，高于1％时会出现黑灰熄火现象；另外烟叶氯离子含量过高会造成淀粉积累多，叶片肥厚而脆，吸湿性大，存放时颜色易变深，产生不良气味。

植物根存在选择性吸收氯的机制，且某些耐受氯的植物还具有将氯离子从根中排出的机制。植物在根部吸收氯离子后，通过木质部运输到地上部分。研究表明，低氯富集的莲花在木质部中运输速度低于常规莲花品种。此外，国际上也对氯离子在胞内和胞间的运输机制、以及植物通过韧皮部分泌氯的机制也有相关报道。其中分子生物学证据显示，某些通道蛋白和转运蛋白，包括CLC(Chloride Channel)、CCC(Cation-chlorideCotransporter)、PTR(Oligopeptide Transporter)、ABC转运蛋白、SLAC(S-type AnionChannel)、ALMT(Al3+-activated Malate Transporter)等，已被证明直接或间接与氯离子在植物体内的运输有关。

拟南芥中CLC蛋白家族有7个成员。研究表明AtCLCa在驱使硝酸盐进入液泡的过程中起到关键作用，而AtCLCb没有这种功能；其他的AtCLC分布在其他细胞区间，AtCLCd和AtCLCf可能在转运高尔基囊泡网络中起到酸化作用；AtCLCe可能参与类囊体膜的阴离子渗透性；AtCLCg与AtCLCc功能一致，参与植物盐胁迫。2010年Jossier等研究发现，AtCLCc定位于叶片的保卫细胞，突变株对盐敏感；而且与对照相比，突变株氯离子浓度明显下降，但钾离子的浓度几乎没有变化。

根据贵州院对240个烟草核心种植资源进行的重测序及常规化学成分测定结果开展的关联分析显示，烟草不同品种间的氯离子含量差异显著，表明烟草氯离子含量可以通过育种或者遗传手段加以改进。

发明内容

本发明的目的在于提供一种烟草氯离子通道蛋白基因NtCLC-F及其应用，从而为适宜氯含量烟叶培育提供基础。

本发明是通过以下技术方案实现的：

烟草氯离子通道蛋白基因NtCLC-F，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示，其中特异性核酸片段为2-432位碱基。

进一步的，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其由456个氨基酸残基组成，其中第2-432位氨基酸为保守的p450结构域。

进一步的，引物设计为：

NtCLC-F-F：5’-CTGGTAGGGAGCTTCTC-3’，

NtCLC-F-R：5’-CCTCCTAAAGAGAATGG-3’。

进一步的，以烟草K326的cDNA为模板，以NtCLC-F-F、NtCLC-F-R为引物，进行PCR扩增。

上述任一项的烟草氯离子通道蛋白基因NtCLC-F的应用，该烟草氯离子通道蛋白基因NtCLC-F与植物叶片中氯离子含量相关，降低烟草氯离子通道蛋白基因NtCLC-F表达后，植物叶片中氯离子含量明显降低。

进一步的，利用基因沉默技术或者基因超表达方法，通过调节烟草氯离子通道蛋白NtCLC-F的表达量，来调节控制烟叶中氯离子含量。

进一步的，通过转基因技术、瞬时表达技术或基因组编辑技术，构建含有NtCLC-F基因的病毒诱导沉默载体、RNAi干涉载体、超表达载体或基因组编辑载体，转化烟草，筛选获得氯离子含量变化的烟草新品种。

进一步的，利用病毒诱导的基因沉默技术，干扰NtCLC-F基因的表达使其沉默，NtCLC-F基因沉默植株中氯离子含量显著下降，进而获得氯离子含量下降的植物新品种。

本发明的有益效果是：

本发明通过对特定烟草氯离子通道NtCLC-F的初步研究，发现其与烟草氯离子含量高度相关，在将该基因沉默后，烟草中氯离子含量发生了明显提高。基于这一特性，可为烟草适宜氯含量烟叶新品种培育提供一定的应用基础和参考借鉴。

附图说明

图1为本发明烟草TRV2-PDS、TRV2-GFP及TRV2-NtCLC-F载体转化组的表型对比图；

图2为与对照植株相比NtCLC-F基因沉默植株中该基因的相对表达量；

图3为病毒诱导基因沉默的烟叶及对照烟叶中的主要氯离子含量比较。

具体实施方式

以下通过具体实施例来详细说明本发明的技术方案，以下的实施例仅是示例性的，仅能用来解释和说明本发明的技术方案，而不能解释为是对本发明技术方案的限制。

生物材料：

本氏烟草，一种常用烟草材料，下述实施例中烟草种植于郑州烟草院种植基地，育苗钵中育苗，待发芽后两周进行分苗，种于塑料钵(10cm×10cm)中，22℃、16h光/8h暗条件下进行日常肥水管理。

下述实施例中所采用的VIGS载体是一种来自烟草脆裂病毒的病毒载体(tobaccorattle virus，TRV)，所具体利用的TRV2由郑州烟草研究院基因中心保存，其带有卡那筛选标记和35S启动子，同时TRV2带有EcoR I和BamH I等多克隆位点，可以用来携带和转化外源基因。

实验试剂：

LB液体培养基，1L含量中含有：10g细菌蛋白胨(bacteriological peptone)；10g氯化钠(NaCl)；5g酵母抽提物(yeast extract)，高温高压灭菌。

YEB液体培养基，1L含量中含有：5g牛肉浸膏(beef extract)；5g细菌蛋白胨(bacteriological peptone)；5g蔗糖(sucrose)；1g酵母抽提物(yeast extract)；2mL 1M硫酸镁(MgSO4)，高温高压灭菌。

1M 2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)储备液：ddH

200mM乙酰丁香酮(Acetosyringone，As)储备液：二甲基亚砜(DSMO)溶解，-20℃储存备用。

MMA(100mL)：1mL(1M)MgCl2；1mL(1M,pH5.6)MES；75μL(200mM)As。

实施例1

本实施例就烟草NtCLC-F基因克隆及沉默载体的构建过程简要介绍如下。

(1)烟草NtCLC-F基因克隆

根据前期对于烟草基因组及相关NtCLC-F基因研究，选择特异编码序列为目标片段，设计PCR扩增用引物序列如下：

NtCLC-F-F：5’-CTGGTAGGGAGCTTCTC-3’，

NtCLC-F-R：5’-CCTCCTAAAGAGAATGG-3’。

以烟草K326(烟草品种)叶片的cDNA为模板，以NtCLC-F-F和NtCLC-F-R为引物，进行PCR扩增获得NtCLC-F基因。

PCR扩增程序为：95℃预变性3min，95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，34个循环后，72℃彻底延伸5min。

对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并回收电泳产物备用。

(2)构建重组TRV2-NtCLC-F载体

将步骤(1)中的PCR扩增产物进行EcoRI、BamHI双酶切，同时对空载体TRV2进行EcoRI、BamHI双酶切，分别回收酶切产物，利用T4 DNA连接酶进行连接。

将连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α，转化操作结束后将转化产物涂布在含50mg/L Kan的LB固体培养基上，在37℃培养过夜。

挑选阳性单菌落扩增后进一步进行PCR鉴定，并结合测序验证，确保获得构建正确的重组载体TRV2-NtCLC-F。

烟草NtCLC-F基因，包括2181个碱基，碱基序列如SEQ ID NO.1所示，具体如下：

ATGACGGGAGGCGAGTACAGCGATCACAATGTTTTATTACGTTCTACTTCATCGGCGTCAGAAGGCGATTTAGAAAGCCAGTCGCCGAGGAGAACGAATACCAGAAGCATTAAGGATCTATTAAAGCGGTTGGATCGAGGGTTTTCGGGTCGGCGATCAGAGAGGGACCAAAACTCGTCGTCTTCTCCTTCTTCTAATCGCGGTGTTTCGGATGAAGTTCTCGGCGATAGTGCTCCACCGGAATGGGCGATGTTGCTTGTTGGATGTCTCCTTGGCCTTGCTACTGGCCTTTGTGTTGCTGCCTTTAACCGCGGGGTTAGTTTCAGCTTTTCTTTCAAAATTTTATAGCTTTTTTCGTTTTGCTTATAATGAACTTATTTTTGCCTCCAATAACTGGACAAATATGAGAAATTTAACCTCCAACGGGGACAATTGTACTCTAATATGGCTTGTTTCAGTCCAATACTATATAGTTTATCTTCTAAAGCACATTAGGGGTTCTTATTTAGTATCAAAATCTGAAAATTAAAAATTATGGACATTGGAAACAGCAAAATGCTGTTGCATTCGGATATCTGCCTGTTATAGTTAAAGATATTCCTCTTATTTATTTGTTTGTGTACCTTTCCTGGGGTTGTAGGGTTTCCACAGTACAGATCTTAATTAATGAGTAGCTGCAGTTCCTCTGTGTGTGTGTGTGTTTGTCTTAATGAGGGAATATGCGTGTAGCGGGACTGATTTTGTGACTTGCAAGCTTATCCGACCATTTTCTTTGTTGATTAAAGGTGTTGCATTTAGAGAGTTTCTTTGAACAGTATTATTTCTTGTATTGGATGACAACGAGGATATTTGTTTAGGTACACGTAATACACGAGTGGGCGTGGGCTGGTACTCCTAATGATGGTGCTGCTTGGCTTCGTTTGCAAAGGCTAGCTGATACTTGGCACCGGATACTTTTAATACCAGTTTTGGGTGGAGTCATTGTTGGCATGCTGCATGGTCTGCTTGAAATATTGGACCAAATAACACAGTCCAGCTCTTCTCAGGGACAAGGATTTGATTTGATTGCTGGAATCTTCCCTACAGTGAAGGCCACTCAGGCTGCTATCACTCTGGGTACTGGTTGTTCTTTGGGTCCTGAAGGCCCTAGTGTAGATATTGGGAAGTCATGTGCCTATGGATGCTCCATGATGATGGAAAACAACCGGGAAAGGAGAATAGCTCTCATTGCAGCTGGTGCAGCTGCTGGAATTGCTTCAGGTATACTGTTTCTCATTAAGAAGTATCTGGACCAGGGGTTTTTTCTTTTATCACTTCCAAAGTAATGAAGAGTATACGGCCTTTTGCAAAATTATATGTTAGGAAGATGCACGGTTTGCTTGTAAATTCTGGTATGATGATCACTGAGAGGTTAGATGTAATCTGGGGACATTGACTAAGATTGGAGACATTGGTTGCTCGATCTAAAAACCATTATGAACGGATGTTTTTTGCAAAATTCTCTCGTTATGAAGGTTTTTGGTGTGTTAATGCTTATATGGATTATGAATCTCATGCATATTCAAGTGACACTAAGAGCACTAAAGAGACTTTCATGCTTTCCCATCTTTTACTTCATTCCCAAGAGACCTTTTTTTCTCTATTTTCTCTTTCCCAAAAATGAAACAGTGTCACCAAAATAGGCTGTCGCCTTGGCGCCCAGCTGTCCCTTTATTTGTTACAAATAGAAAAGCCGTCAAGTCTTTTGGGCTTGCAATGTTCAATATGGGTCTTATTATCAAAGGAGTAGAAACTATTCCTGCAAGCTAATATGACTTCTGTGGTTCCCACAGGCTGTTTATAATTGTAAGGAGATATACTTGCCTATTATTTTTGTCGATATGCCACATACATATTCCTCCTTTGTGTACTTCTTGATATGCGTATGTCTGGGACAGTATAATTGTCTGTGTGAATAGTGGAGCTTTGTGCCTTTCCGGAGCTTGCCTCAGCTGGTGGATGGATCTTCAGGTTTAAGTTTCTTGTACTACAGGTTTCAATGCAGCGGTAGCAGGTTCTTTCTTTGCGATTGAAACAGTTTTAAGACCACTCCGTGCAGAAAATTCACCCCCATTTACAACTGCAATGATCATATTGGCTTCTGTTATATCATCAACTGTATCAAATGCAGTACTTGGCGAGAAACAGGCTTTCACAGTGCCCACGTATGATATGAAATCTGCTGCTGGTATTTGATCTAATTCTGGTTTATTTTATCATGGCTGGAACATTGCTACATCAGTGCTTCGGTATTTCCGTGGCTGCTGTTCTCTTTATTTATGCTGTATCTGCACTAGTACCAATTGCCATGGATATTTGCTCTTTCACAATTTTGCTGCGCGCAGTTTCTGTTCATGTTGCATTGTTGGATGGAAAATTTTGTAATCAGGGAACTGGGAGTTGCATTTCTGCTCTATTTTTACCCTTTCTCATGAAAATGTTTACTGTTGGTATTATCTGTTCATACTTACATACTGTCTTTCACATGCTAAATAAGAAATGGATAACATCAAACGCTCTTTTCTGCTTCTATATGCCTATTGTAACATGTGAATATACTGCGCTTTTGATGGTAACAAGGAAAACAGTGACGTGTTCTTATATTTTCAGGCATGGGCACACATCGATTAGCTCGTAACTTGGAGTCAGTGTGCTATTCTAGTCTTTAGCACGTACTATGATTATGCTTAACGATTAACCTCTTTCAGTATCTCGGACTTTCCATTGTGTAAATGTGGGCTGTAGTCATTTCCTGTATGATAGATTTTCGAAAGAAAATGGATAAAGTGATGGCTTTTGTAGATAACTGGTTATCATGTTACTTCATGCTTTACATGTATAAGCTCTGTCTTGATTGTCATTCTATTCAATATGGATTTCTTTCTGAATGCTTAAGAATCTTCTTTTATAGAGCTTCCATTGTATCTGATACTGGGGATGCTGTGTGGAGTAGTAAGTGTGGCTTTCACTCGATTGGTGTCCTGGTTCACCAAGGGGTTTCAGTTCCTCAAGGAAAAATTTGGACTTCCTGATGTTGTCTGCCCTGCCTTGGGGGGTTTAGGAGCTGGTGTAATAGCTCTTAGATATCCTGGAATTCTCTATTGGGGTTTCACTAATGTTGATGAAATCCTTCATACTGGGAAGACTGCATCTGCACCTGGAATCGGATTGCTAGCCCAATTAGTTGCTGCTAAAGTCGTGGCCACTGCTTTGTGCAAAGGGTCTGGCCTTGTTGGTGGATTGTATGCACCAAGTTTAATGATAGGTGCTGCTGTAGGTGCTGTATTTGGAGGGCTAGCTGGGGAACTAATAAATTCAGCTATTCCAGGGAATGCTGCTATTGCCCAGCCACAGGCATATGCACTGGTCAGATGATATACTTTTTCCATATACTTTCTCCAAACAATTATTTTATTACACTTCATTGCAGCTTAGGAAGTAAACTTTTCTAATGGATAAATTTAAACAATGTAGGTGGGAATGGCTGCTACACTAGCTTCCGTTTGCTCAGTGCCTTTGACTTCAGTGCTCTTATTGTTTGAGTTGACAAAAGATTATAGAATTTTGCTTCCTCTCATGGTTAGTCTTGCTGAACAAAGATTCACTAGCTCTACTTGTTTTTCATGTGTGTTACTAAAAGCTGCCTCACTTGCTTAAACACCTAGCTATGTCCATAATCTCCTATCTTCTGAGTAACTCAAGTCTGTCACATAATCTTTCGTACTTTCTAGTTTCTACTAACCTGTCTTCTTTCTGATGGATGGCTGTCATACTAGGTTATGGAGGAAAGTACTTCCTTCAATTACGTATGAGTTACTTCTGAGTTTCTTTCATCCTGAAATCAAGGTTTCTTGACTTTGATCGATGTCTGGTTTTTCTTTACAAGTTATATCTTAGGGAATCATTATTTATGTATCTGTGTTTTAACTTTGTGGCAGTATGGCTGTTTGTTTGTACTAAGTTTTAACTTAGTTGCATTGAATTTGAGCTCTTAGTGTGTGTTTGACCTCCAATTTTTGTATTTTGTGTATCTTGTGGCTCTTATTTGAATATTCTGCTGGAAGAGGCTAAATTAGAAATTTTTGGGTGAAATAAGATCAAGTAGTTTGTTTAAATCATGGTTGAAATCACTCTGGGGAGGGGTCAGGCGGTGAATTTAATGTTGATAAATGGTCCTGACACGTTGGACTGTTGTCCCCTCTACATATGAGAGGTCAGAGGGCTAGAAAGTAGGAGAGCATTCTATAATTAGGAGGAGAGTATTCTGTAGTTAGGAGCCTAATTCTCTTATAACACATTACATTACATCACATAATAATGTAATATTACATTGTATGTGTATATATCTGTGTGTGTCCGAGTCAGCTTGCTTCCAACATATACTTGCTATCTCCCACCAGAGGCGTAGGCAGAGAGGAAGAAATCACCTAATGTTTTCTCTGCTGGGATTTGAACACATTATATTGTACTATAGTAAGACTTAACCGTTATAGGACTTTCACATATACAAATATGATTTGTATATTTTACAACTAGGAGTTAATGGAATCTTATAGAACACTCGGATTTATACAATAAAGGATCAGACACGATCTATGTAAAATTAGATCTAGTAACTCTTCAGCTCCAACTTTCCACATGCATATTTAAGACCACAAGATTCAAGGGCATTTTGGTACATTACACATATCTTTAGTTTAAGACCACAAGATTTAAATGTCTCCCTTACTTCTTAAACTCTGTACCTAGTCAAACTAAGACACATATATTGAAACGGAGTGAGTACATCTTTTACCAGCCAACGACCAGAGTTCTGCACAATTTAAGTTTGCAATAACAAGGCTTGTTGGTTACTTGCGTCCTAGTAATCTACTCGGAAGAACCGTGAATAAGTATGGTTGAAATCTTAGTTTGGACAGGCAAACTCATGCTCGCATTACTCAATTATAGAACAGGAACATATCTCTGCATGTTTTAGCAATTAGGTAAAAGTGCAATTTGTTAACACTTCTAGAAACGACAGTATGACATAACTTCCTAATAAAAAGCTTGCTGATTTGTTTGCCACCTCATGTAATAGCTTAAGCTGTTAGAGTTGGGACACATTCATTTATTCATTCTAGATCACTTGCATGAAGAAGTAGACTAAACACACCTGGACTTTGCATTAGCCACTAGGTGAAGTACCAAGGAGAGGATCGGCTTCTTGGAGCTGAGATATGTGATGAATGGCATTGATAAATGTCTGGAATGGAGTCAACTGACCGCCCTGCTTGGTTGAAGCATGTGAAAATGTTTTGTAGATGGGTGGCGTCAAGTCTTGAACTCATTACTTCTACCAGCTCTTGTAGCATGTGGAATTGTTTGACTACCTCATCTAGAAGCTTAAGTTAGACACATTCATTTATTTATTTGAAGTAACAAAAGTACTGGTTGCAATAACCATGTGTTTTTTTCCCGTACAGATTCAGAGATTTGTGATAGAATACTGCATTGCCTTCCTAGCTAATTTTTTTTTGTTTGGGGGTTGGGGTGAAGATGATTGAACTTGGAAGATCGAAATTTTTTCTTATGTGTTTGTATAAATAACTTAGGGTTATTTCCATGTAGAGCTATAGTTTTTTCAGATTGTAGTAATAATGCCTGACCATATGGTTTGCTAGTTAGTGGATCTCAGTTATCTTTGTACAATCTCATGGATGTTCTTATTGTAGTAATAATGCCTGAGCATATGGTTTGCTAGTTAGTGGCTCTCAGTTATCTTTGTACAATCGCATGGATGTTCTTTGTTATTATAGCTTGAATTTTCAATGCCATAATGATATGTGGGGTAACACTTGCACCTTTTAATCATGCAAGTGTTTTAAATGTTCTTCACTAGGGTGCTGTTGGACTGGCAATATGGGTGCCTTCTGTTACAGACCAGCCAAAGGAAACGGAGGTATCAGAAGCGAAATTTGCATCAAAAGGTTACTCAATTCTTTCACCGGTTGATGAGAAAAATGAAGGGAATGTTCCGAGGAAATCTGGTGAGGGAAATGACTTGGAACTATTGGTGATTGGGAGTCATAATAGTCGTGAATCATTTGATGAAGGTCTCATTCTGGAAGATCTAAAGGTACTATCTTTGCTTTCGGCACCTAAGAATGTGGAAAAGTTTGTGTTTTAATGGATCTCATACTCAGGTTTCATTTTCTTATTGATTTTTTGAACCAAACACCGCCTCATTTTCTTTTGAACACTTGTTCTATGATTTAGGTACGTCAAGTTTCTAATGTGTATTTCCTTCTATTAGGTTTCTCAGGCCATGTCAAATGATTATTTGAAGGTCTCTCCAAGCCAAACTGTGAAAGAAGCTTTAGAGTGCATGCATGACGGCCAACAGAATTGCGTTGTTGTGGTTGATGCTGAAGGTTACTTGGAAGGAATTTTAACATATGGTGACGTCAAAAGAAGTTTGTTTAAGAGCCATGGGGATTCTTCTAACAGTGATTTATCAGTCACAGATGTATGCGCTTTAGATTGCCATCATGCCAAATGTCTTTTAATGTTCAGTTCTTTTGTTTTCTCCATTTGTTTTCTCTTTCCCGACTTTGCCCCGGGGAGTTCACTCCCTGCACGTTCCTGCTTTTTCTTAATTTAGTTACATGATTTAGCAGGCAAATACTTGTCTTGTGTCCTCTATATGCATAAGAGGAATAAGCTATCGTGGCCAAGATTGTGGACTCCTAACTTGTTATCCTGATACGGATCTAGCAACTGCAAAGCAACTAATGGAGGCCAAAGGAATTAAACAATTGCCTGTGGTCAAACGTGGTGGAGAATTCAGAAGAGAAAGAAAGCGCAGAACTATTGCTATTTTGCGTTATGATTCAATAGAGGAGTCAATCAGGTTTTGCATCTTTTCAATGTAG

烟草氯离子通道蛋白NtCLC-F，包括726个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体如下：

MTGGEYSDHNVLLRSTSSASEGDLESQSPRRTNTRSIKDLLKRLDRGFSGRRSERDQNSSSSPSSNRGVSDEVLGDSAPPEWAMLLVGCLLGLATGLCVAAFNRGVHVIHEWAWAGTPNDGAAWLRLQRLADTWHRILLIPVLGGVIVGMLHGLLEILDQITQSSSSQGQGFDLIAGIFPTVKATQAAITLGTGCSLGPEGPSVDIGKSCAYGCSMMMENNRERRIALIAAGAAAGIASGFNAAVAGSFFAIETVLRPLRAENSPPFTTAMIILASVISSTVSNAVLGEKQAFTVPTYDMKSAAELPLYLILGMLCGVVSVAFTRLVSWFTKGFQFLKEKFGLPDVVCPALGGLGAGVIALRYPGILYWGFTNVDEILHTGKTASAPGIGLLAQLVAAKVVATALCKGSGLVGGLYAPSLMIGAAVGAVFGGLAGELINSAIPGNAAIAQPQAYALVGMAATLASVCSVPLTSVLLLFELTKDYRILLPLMGAVGLAIWVPSVTDQPKETEVSEAKFASKGYSILSPVDEKNEGNVPRKSGEGNDLELLVIGSHNSRESFDEGLILEDLKVSQAMSNDYLKVSPSQTVKEALECMHDGQQNCVVVVDAEGYLEGILTYGDVKRSLFKSHGDSSNSDLSVTDANTCLVSSICIRGISYRGQDCGLLTCYPDTDLATAKQLMEAKGIKQLPVVKRGGEFRRERKRRTIAILRYDSIEESIRFCIFSM

实施例2

在实施例1基础上，利用农杆菌介导的VIGS技术，进一步将所构建的重组TRV2-NtCLC-F载体转化烟草植株，并就相关植物表型变化情况做验证分析，具体实验过程简介如下。

(1)转化农杆菌

需要说明的是，参考实施例1操作及现有技术，同时制备了TRV2-GFP、TRV2-PDS重组载体作为转基因正负对照，具体转化过程为：

将TRV2-GFP(载体对照)、TRV2-PDS(VIGS效率对照)及TRV2-NtCLC-F的阳性克隆质粒，分别通过电击转化方式转化进入农杆菌GV3101感受态细胞中，利用含50mg/L Kan和50mg/L Rif的YEB平板进行培养筛选，在28℃倒置培养2d后，利用菌落PCR筛选带有目的基因的农杆菌。

(2)制备转染用菌液

将步骤(1)中筛选所得阳性农杆菌克隆在5mL的YEB液体培养基(含50mg/L Kan和50mg/L Rif)中，28℃、250rpm条件下培养过夜；

取50uL过夜培养物接种至50mL的YEB液体培养基(含50mg/L Kan)中，培养至OD

最后室温放置3h左右后，作为转染用菌液。

(3)瞬时转化

以3ˉ4周苗龄的本氏烟草叶片为实验材料，利用1mL规格注射器，将步骤(2)中所制备转染用菌液注射至烟草叶片中，注射后的烟草继续在人工培养箱内培养，观察表型变化。

注射3周后的烟草表型变化情况如图1所示。可以看出，含TRV2-PDS的农杆菌浸染植株新生叶有漂白现象，说明侵染成功；而TRV2-GFP组则无明显变化，相对应的TRV2-NtCLC-F组烟草植株无显著变化，表明NtCLC-F基因对烟草其他基本生理状态无明显影响。

进一步通过qRT-PCR对NtCLC-F基因表达情况进行了检测，结果如图2所示，可以看出，TRV2-NtCLC-F的侵染植株中，NtCLC-F的表达量显著降低，基因表达量下降约78％。

进一步地，对实验组(TRV2-NtCLC-F浸染植株)和对照组(TRV2-GFP浸染植株)中的植物氯离子含量情况进行了检测，结果如图3，结果可以看出，沉默植株的生长表型正常，氯离子含量升高为对照的130％左右，这一结果表明NtCLC-F基因是一个很好调控氯离子靶标基因，可以在不影响烟株表型的情况下有效调控烟叶中氯离子，可以采用uORFs(upstreamopen reading frames)对该基因进行超量表达，实现对氯离子含量的控制。(uORFs是基因编码区上游一段负调控基因表达的序列，通过对基因的uORFs进行编辑可实现基因的超量表达)。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变形，本发明的范围由所附权利要求及其等同限定。

序列表

<110> 河南中烟工业有限责任公司

<120> 烟草氯离子通道蛋白基因NtCLC-F

<130> WPM201837

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6953

<212> DNA

<213> 人工序列(NtCLC-F )

<400> 1

atgacgggag gcgagtacag cgatcacaat gttttattac gttctacttc atcggcgtca 60

gaaggcgatt tagaaagcca gtcgccgagg agaacgaata ccagaagcat taaggatcta 120

ttaaagcggt tggatcgagg gttttcgggt cggcgatcag agagggacca aaactcgtcg 180

tcttctcctt cttctaatcg cggtgtttcg gatgaagttc tcggcgatag tgctccaccg 240

gaatgggcga tgttgcttgt tggatgtctc cttggccttg ctactggcct ttgtgttgct 300

gcctttaacc gcggggttag tttcagcttt tctttcaaaa ttttatagct tttttcgttt 360

tgcttataat gaacttattt ttgcctccaa taactggaca aatatgagaa atttaacctc 420

caacggggac aattgtactc taatatggct tgtttcagtc caatactata tagtttatct 480

tctaaagcac attaggggtt cttatttagt atcaaaatct gaaaattaaa aattatggac 540

attggaaaca gcaaaatgct gttgcattcg gatatctgcc tgttatagtt aaagatattc 600

ctcttattta tttgtttgtg tacctttcct ggggttgtag ggtttccaca gtacagatct 660

taattaatga gtagctgcag ttcctctgtg tgtgtgtgtg tttgtcttaa tgagggaata 720

tgcgtgtagc gggactgatt ttgtgacttg caagcttatc cgaccatttt ctttgttgat 780

taaaggtgtt gcatttagag agtttctttg aacagtatta tttcttgtat tggatgacaa 840

cgaggatatt tgtttaggta cacgtaatac acgagtgggc gtgggctggt actcctaatg 900

atggtgctgc ttggcttcgt ttgcaaaggc tagctgatac ttggcaccgg atacttttaa 960

taccagtttt gggtggagtc attgttggca tgctgcatgg tctgcttgaa atattggacc 1020

aaataacaca gtccagctct tctcagggac aaggatttga tttgattgct ggaatcttcc 1080

ctacagtgaa ggccactcag gctgctatca ctctgggtac tggttgttct ttgggtcctg 1140

aaggccctag tgtagatatt gggaagtcat gtgcctatgg atgctccatg atgatggaaa 1200

acaaccggga aaggagaata gctctcattg cagctggtgc agctgctgga attgcttcag 1260

gtatactgtt tctcattaag aagtatctgg accaggggtt ttttctttta tcacttccaa 1320

agtaatgaag agtatacggc cttttgcaaa attatatgtt aggaagatgc acggtttgct 1380

tgtaaattct ggtatgatga tcactgagag gttagatgta atctggggac attgactaag 1440

attggagaca ttggttgctc gatctaaaaa ccattatgaa cggatgtttt ttgcaaaatt 1500

ctctcgttat gaaggttttt ggtgtgttaa tgcttatatg gattatgaat ctcatgcata 1560

ttcaagtgac actaagagca ctaaagagac tttcatgctt tcccatcttt tacttcattc 1620

ccaagagacc tttttttctc tattttctct ttcccaaaaa tgaaacagtg tcaccaaaat 1680

aggctgtcgc cttggcgccc agctgtccct ttatttgtta caaatagaaa agccgtcaag 1740

tcttttgggc ttgcaatgtt caatatgggt cttattatca aaggagtaga aactattcct 1800

gcaagctaat atgacttctg tggttcccac aggctgttta taattgtaag gagatatact 1860

tgcctattat ttttgtcgat atgccacata catattcctc ctttgtgtac ttcttgatat 1920

gcgtatgtct gggacagtat aattgtctgt gtgaatagtg gagctttgtg cctttccgga 1980

gcttgcctca gctggtggat ggatcttcag gtttaagttt cttgtactac aggtttcaat 2040

gcagcggtag caggttcttt ctttgcgatt gaaacagttt taagaccact ccgtgcagaa 2100

aattcacccc catttacaac tgcaatgatc atattggctt ctgttatatc atcaactgta 2160

tcaaatgcag tacttggcga gaaacaggct ttcacagtgc ccacgtatga tatgaaatct 2220

gctgctggta tttgatctaa ttctggttta ttttatcatg gctggaacat tgctacatca 2280

gtgcttcggt atttccgtgg ctgctgttct ctttatttat gctgtatctg cactagtacc 2340

aattgccatg gatatttgct ctttcacaat tttgctgcgc gcagtttctg ttcatgttgc 2400

attgttggat ggaaaatttt gtaatcaggg aactgggagt tgcatttctg ctctattttt 2460

accctttctc atgaaaatgt ttactgttgg tattatctgt tcatacttac atactgtctt 2520

tcacatgcta aataagaaat ggataacatc aaacgctctt ttctgcttct atatgcctat 2580

tgtaacatgt gaatatactg cgcttttgat ggtaacaagg aaaacagtga cgtgttctta 2640

tattttcagg catgggcaca catcgattag ctcgtaactt ggagtcagtg tgctattcta 2700

gtctttagca cgtactatga ttatgcttaa cgattaacct ctttcagtat ctcggacttt 2760

ccattgtgta aatgtgggct gtagtcattt cctgtatgat agattttcga aagaaaatgg 2820

ataaagtgat ggcttttgta gataactggt tatcatgtta cttcatgctt tacatgtata 2880

agctctgtct tgattgtcat tctattcaat atggatttct ttctgaatgc ttaagaatct 2940

tcttttatag agcttccatt gtatctgata ctggggatgc tgtgtggagt agtaagtgtg 3000

gctttcactc gattggtgtc ctggttcacc aaggggtttc agttcctcaa ggaaaaattt 3060

ggacttcctg atgttgtctg ccctgccttg gggggtttag gagctggtgt aatagctctt 3120

agatatcctg gaattctcta ttggggtttc actaatgttg atgaaatcct tcatactggg 3180

aagactgcat ctgcacctgg aatcggattg ctagcccaat tagttgctgc taaagtcgtg 3240

gccactgctt tgtgcaaagg gtctggcctt gttggtggat tgtatgcacc aagtttaatg 3300

ataggtgctg ctgtaggtgc tgtatttgga gggctagctg gggaactaat aaattcagct 3360

attccaggga atgctgctat tgcccagcca caggcatatg cactggtcag atgatatact 3420

ttttccatat actttctcca aacaattatt ttattacact tcattgcagc ttaggaagta 3480

aacttttcta atggataaat ttaaacaatg taggtgggaa tggctgctac actagcttcc 3540

gtttgctcag tgcctttgac ttcagtgctc ttattgtttg agttgacaaa agattataga 3600

attttgcttc ctctcatggt tagtcttgct gaacaaagat tcactagctc tacttgtttt 3660

tcatgtgtgt tactaaaagc tgcctcactt gcttaaacac ctagctatgt ccataatctc 3720

ctatcttctg agtaactcaa gtctgtcaca taatctttcg tactttctag tttctactaa 3780

cctgtcttct ttctgatgga tggctgtcat actaggttat ggaggaaagt acttccttca 3840

attacgtatg agttacttct gagtttcttt catcctgaaa tcaaggtttc ttgactttga 3900

tcgatgtctg gtttttcttt acaagttata tcttagggaa tcattattta tgtatctgtg 3960

ttttaacttt gtggcagtat ggctgtttgt ttgtactaag ttttaactta gttgcattga 4020

atttgagctc ttagtgtgtg tttgacctcc aatttttgta ttttgtgtat cttgtggctc 4080

ttatttgaat attctgctgg aagaggctaa attagaaatt tttgggtgaa ataagatcaa 4140

gtagtttgtt taaatcatgg ttgaaatcac tctggggagg ggtcaggcgg tgaatttaat 4200

gttgataaat ggtcctgaca cgttggactg ttgtcccctc tacatatgag aggtcagagg 4260

gctagaaagt aggagagcat tctataatta ggaggagagt attctgtagt taggagccta 4320

attctcttat aacacattac attacatcac ataataatgt aatattacat tgtatgtgta 4380

tatatctgtg tgtgtccgag tcagcttgct tccaacatat acttgctatc tcccaccaga 4440

ggcgtaggca gagaggaaga aatcacctaa tgttttctct gctgggattt gaacacatta 4500

tattgtacta tagtaagact taaccgttat aggactttca catatacaaa tatgatttgt 4560

atattttaca actaggagtt aatggaatct tatagaacac tcggatttat acaataaagg 4620

atcagacacg atctatgtaa aattagatct agtaactctt cagctccaac tttccacatg 4680

catatttaag accacaagat tcaagggcat tttggtacat tacacatatc tttagtttaa 4740

gaccacaaga tttaaatgtc tcccttactt cttaaactct gtacctagtc aaactaagac 4800

acatatattg aaacggagtg agtacatctt ttaccagcca acgaccagag ttctgcacaa 4860

tttaagtttg caataacaag gcttgttggt tacttgcgtc ctagtaatct actcggaaga 4920

accgtgaata agtatggttg aaatcttagt ttggacaggc aaactcatgc tcgcattact 4980

caattataga acaggaacat atctctgcat gttttagcaa ttaggtaaaa gtgcaatttg 5040

ttaacacttc tagaaacgac agtatgacat aacttcctaa taaaaagctt gctgatttgt 5100

ttgccacctc atgtaatagc ttaagctgtt agagttggga cacattcatt tattcattct 5160

agatcacttg catgaagaag tagactaaac acacctggac tttgcattag ccactaggtg 5220

aagtaccaag gagaggatcg gcttcttgga gctgagatat gtgatgaatg gcattgataa 5280

atgtctggaa tggagtcaac tgaccgccct gcttggttga agcatgtgaa aatgttttgt 5340

agatgggtgg cgtcaagtct tgaactcatt acttctacca gctcttgtag catgtggaat 5400

tgtttgacta cctcatctag aagcttaagt tagacacatt catttattta tttgaagtaa 5460

caaaagtact ggttgcaata accatgtgtt tttttcccgt acagattcag agatttgtga 5520

tagaatactg cattgccttc ctagctaatt tttttttgtt tgggggttgg ggtgaagatg 5580

attgaacttg gaagatcgaa attttttctt atgtgtttgt ataaataact tagggttatt 5640

tccatgtaga gctatagttt tttcagattg tagtaataat gcctgaccat atggtttgct 5700

agttagtgga tctcagttat ctttgtacaa tctcatggat gttcttattg tagtaataat 5760

gcctgagcat atggtttgct agttagtggc tctcagttat ctttgtacaa tcgcatggat 5820

gttctttgtt attatagctt gaattttcaa tgccataatg atatgtgggg taacacttgc 5880

accttttaat catgcaagtg ttttaaatgt tcttcactag ggtgctgttg gactggcaat 5940

atgggtgcct tctgttacag accagccaaa ggaaacggag gtatcagaag cgaaatttgc 6000

atcaaaaggt tactcaattc tttcaccggt tgatgagaaa aatgaaggga atgttccgag 6060

gaaatctggt gagggaaatg acttggaact attggtgatt gggagtcata atagtcgtga 6120

atcatttgat gaaggtctca ttctggaaga tctaaaggta ctatctttgc tttcggcacc 6180

taagaatgtg gaaaagtttg tgttttaatg gatctcatac tcaggtttca ttttcttatt 6240

gattttttga accaaacacc gcctcatttt cttttgaaca cttgttctat gatttaggta 6300

cgtcaagttt ctaatgtgta tttccttcta ttaggtttct caggccatgt caaatgatta 6360

tttgaaggtc tctccaagcc aaactgtgaa agaagcttta gagtgcatgc atgacggcca 6420

acagaattgc gttgttgtgg ttgatgctga aggttacttg gaaggaattt taacatatgg 6480

tgacgtcaaa agaagtttgt ttaagagcca tggggattct tctaacagtg atttatcagt 6540

cacagatgta tgcgctttag attgccatca tgccaaatgt cttttaatgt tcagttcttt 6600

tgttttctcc atttgttttc tctttcccga ctttgccccg gggagttcac tccctgcacg 6660

ttcctgcttt ttcttaattt agttacatga tttagcaggc aaatacttgt cttgtgtcct 6720

ctatatgcat aagaggaata agctatcgtg gccaagattg tggactccta acttgttatc 6780

ctgatacgga tctagcaact gcaaagcaac taatggaggc caaaggaatt aaacaattgc 6840

ctgtggtcaa acgtggtgga gaattcagaa gagaaagaaa gcgcagaact attgctattt 6900

tgcgttatga ttcaatagag gagtcaatca ggttttgcat cttttcaatg tag 6953

<210> 2

<211> 725

<212> PRT

<213> 人工序列(NtCLC-F)

<400> 2

Met Thr Gly Gly Glu Tyr Ser Asp His Asn Val Leu Leu Arg Ser Thr

1 5 10 15

Ser Ser Ala Ser Glu Gly Asp Leu Glu Ser Gln Ser Pro Arg Arg Thr

20 25 30

Asn Thr Arg Ser Ile Lys Asp Leu Leu Lys Arg Leu Asp Arg Gly Phe

35 40 45

Ser Gly Arg Arg Ser Glu Arg Asp Gln Asn Ser Ser Ser Ser Pro Ser

50 55 60

Ser Asn Arg Gly Val Ser Asp Glu Val Leu Gly Asp Ser Ala Pro Pro

65 70 75 80

Glu Trp Ala Met Leu Leu Val Gly Cys Leu Leu Gly Leu Ala Thr Gly

85 90 95

Leu Cys Val Ala Ala Phe Asn Arg Gly Val His Val Ile His Glu Trp

100 105 110

Ala Trp Ala Gly Thr Pro Asn Asp Gly Ala Ala Trp Leu Arg Leu Gln

115 120 125

Arg Leu Ala Asp Thr Trp His Arg Ile Leu Leu Ile Pro Val Leu Gly

130 135 140

Gly Val Ile Val Gly Met Leu His Gly Leu Leu Glu Ile Leu Asp Gln

145 150 155 160

Ile Thr Gln Ser Ser Ser Ser Gln Gly Gln Gly Phe Asp Leu Ile Ala

165 170 175

Gly Ile Phe Pro Thr Val Lys Ala Thr Gln Ala Ala Ile Thr Leu Gly

180 185 190

Thr Gly Cys Ser Leu Gly Pro Glu Gly Pro Ser Val Asp Ile Gly Lys

195 200 205

Ser Cys Ala Tyr Gly Cys Ser Met Met Met Glu Asn Asn Arg Glu Arg

210 215 220

Arg Ile Ala Leu Ile Ala Ala Gly Ala Ala Ala Gly Ile Ala Ser Gly

225 230 235 240

Phe Asn Ala Ala Val Ala Gly Ser Phe Phe Ala Ile Glu Thr Val Leu

245 250 255

Arg Pro Leu Arg Ala Glu Asn Ser Pro Pro Phe Thr Thr Ala Met Ile

260 265 270

Ile Leu Ala Ser Val Ile Ser Ser Thr Val Ser Asn Ala Val Leu Gly

275 280 285

Glu Lys Gln Ala Phe Thr Val Pro Thr Tyr Asp Met Lys Ser Ala Ala

290 295 300

Glu Leu Pro Leu Tyr Leu Ile Leu Gly Met Leu Cys Gly Val Val Ser

305 310 315 320

Val Ala Phe Thr Arg Leu Val Ser Trp Phe Thr Lys Gly Phe Gln Phe

325 330 335

Leu Lys Glu Lys Phe Gly Leu Pro Asp Val Val Cys Pro Ala Leu Gly

340 345 350

Gly Leu Gly Ala Gly Val Ile Ala Leu Arg Tyr Pro Gly Ile Leu Tyr

355 360 365

Trp Gly Phe Thr Asn Val Asp Glu Ile Leu His Thr Gly Lys Thr Ala

370 375 380

Ser Ala Pro Gly Ile Gly Leu Leu Ala Gln Leu Val Ala Ala Lys Val

385 390 395 400

Val Ala Thr Ala Leu Cys Lys Gly Ser Gly Leu Val Gly Gly Leu Tyr

405 410 415

Ala Pro Ser Leu Met Ile Gly Ala Ala Val Gly Ala Val Phe Gly Gly

420 425 430

Leu Ala Gly Glu Leu Ile Asn Ser Ala Ile Pro Gly Asn Ala Ala Ile

435 440 445

Ala Gln Pro Gln Ala Tyr Ala Leu Val Gly Met Ala Ala Thr Leu Ala

450 455 460

Ser Val Cys Ser Val Pro Leu Thr Ser Val Leu Leu Leu Phe Glu Leu

465 470 475 480

Thr Lys Asp Tyr Arg Ile Leu Leu Pro Leu Met Gly Ala Val Gly Leu

485 490 495

Ala Ile Trp Val Pro Ser Val Thr Asp Gln Pro Lys Glu Thr Glu Val

500 505 510

Ser Glu Ala Lys Phe Ala Ser Lys Gly Tyr Ser Ile Leu Ser Pro Val

515 520 525

Asp Glu Lys Asn Glu Gly Asn Val Pro Arg Lys Ser Gly Glu Gly Asn

530 535 540

Asp Leu Glu Leu Leu Val Ile Gly Ser His Asn Ser Arg Glu Ser Phe

545 550 555 560

Asp Glu Gly Leu Ile Leu Glu Asp Leu Lys Val Ser Gln Ala Met Ser

565 570 575

Asn Asp Tyr Leu Lys Val Ser Pro Ser Gln Thr Val Lys Glu Ala Leu

580 585 590

Glu Cys Met His Asp Gly Gln Gln Asn Cys Val Val Val Val Asp Ala

595 600 605

Glu Gly Tyr Leu Glu Gly Ile Leu Thr Tyr Gly Asp Val Lys Arg Ser

610 615 620

Leu Phe Lys Ser His Gly Asp Ser Ser Asn Ser Asp Leu Ser Val Thr

625 630 635 640

Asp Ala Asn Thr Cys Leu Val Ser Ser Ile Cys Ile Arg Gly Ile Ser

645 650 655

Tyr Arg Gly Gln Asp Cys Gly Leu Leu Thr Cys Tyr Pro Asp Thr Asp

660 665 670

Leu Ala Thr Ala Lys Gln Leu Met Glu Ala Lys Gly Ile Lys Gln Leu

675 680 685

Pro Val Val Lys Arg Gly Gly Glu Phe Arg Arg Glu Arg Lys Arg Arg

690 695 700

Thr Ile Ala Ile Leu Arg Tyr Asp Ser Ile Glu Glu Ser Ile Arg Phe

705 710 715 720

Cys Ile Phe Ser Met

725