家蚕滞育解除过程中相关氯离子通道蛋白基因及辅酶研究

摘要

家蚕是研究卵滞育的重要模式昆虫之一，具有良好的可调控性和操作性并取得了相当多的研究成果。本研究以932品种的蚕卵为实验材料，通过多种不同方式处理蚕卵，获得最佳的解除滞育的方式；利用生物信息学、分子生物学和基因工程等技术方法，筛选出盐酸解除滞育过程中的氯离子通道蛋白基因，进行克隆和表达分析；同时研究了胚胎发育过程四种辅酶的变化，获得主要结果如下：
　　（1）蚕卵在盐酸和DMSO中浸渍不同时间得到的孵化率不同。蚕卵产后20h进行浸酸，浸酸时间0.5~1.5min时，随着浸酸时间的增加孵化率逐渐上升；浸酸时间1.5~6min时，孵化率保持在95％~97%之间。蚕卵产后20h利用DMSO浸渍，浸渍时间15~40min时，孵化率逐渐上升；浸渍时间40~50min时，孵化率保持在88%~90%之间；浸渍时间60min时，孵化率下降为86%。蚕卵产后10d完全进入滞育，置于5℃冷库保存90d，再用盐酸进行刺激，浸酸时间4~6min时，孵化率维持在94%~95%之间；浸酸7min时，孵化率下降为93%，发现蚕卵死亡现象。
　　（2）克隆家蚕细胞内氯离子通道（BmCLIC）、家蚕谷氨酸氯离子通道（BmGluCl）和家蚕γ-氨基丁酸氯离子通道受体（Bmγ-Cl）三个氯离子通道基因。根据候选基因的CDS序列设计引物，通过PCR、琼脂糖电泳、胶回收、连接载体、酶切和测序等技术，成功克隆出BmCLIC、BmGluCl和Bmγ-Cl3个目的基因。
　　（3）通过实时荧光定量PCR技术，检测了BmCLIC、BmGluCl和Bmγ-Cl基因在不同处理卵和胚胎发育过程中的转录表达情况。发现产后20h卵和冷藏卵浸酸处理后BmCLIC、BmGluCl和Bmγ-Cl基因相对表达量都相应提高，表明浸酸可以诱导目的基因上调。在滞育卵中，BmCLIC基因第1d相对表达量最大，随着发育经过逐渐减小；BmGluCl基因第1d相对表达量最大，在发育过程中先减小后增加；Bmγ-Cl基因第2d相对表达量最大值为2.04，随着发育经过逐渐减小。在即时浸酸卵和 DMSO处理卵发育过程中的三个候选基因都有相同的变化趋势。
　　（4）检测了滞育卵和即时浸酸卵的胚胎发育1~9d中的乙酰辅酶A、黄素腺嘌呤二核苷酸、辅酶Ⅰ和辅酶Ⅱ四种辅酶的变化。乙酰辅酶A在滞育卵发育过程中，乙酰辅酶A呈现持续下降；在浸酸卵发育前期持续下降，第5d后缓慢回升。FAD在滞育卵发育前期呈现上升，第5d后呈现下降趋势；在即时浸酸卵发育过程中，每克蛋白中的FAD量从第1d的0.00024pg一直上升到第9d的0.00102pg。NAD在滞育卵发育过程中，从第1d的41.54952下降到第4d的13.45342下降，第4d后保持在相对较低的稳定状态；在浸酸卵发育过程中，呈现上升趋势，第9d时峰值为122.04747mol/g。NADP在滞育卵发育过程中，保持稳定的水平；在浸酸卵发育过程中，呈现上升趋势，第9d时峰值为59.45774 mol/g。

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1 前言

1.1 滞育及滞育机制研究现状

1.2 氯离子通道蛋白研究现状

1.3 本研究的内容和意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 方法

3 结果与分析

3.1 不同处理蚕卵的孵化情况

3.2 候选基因的克隆

3.3 候选基因在932蚕卵中的表达分析

3.4 四种辅酶的变化

4 结论与讨论

4.1 结论

4.2 讨论

4.3本文主要创新点

致谢

参考文献

附录A 载体示意图

附录B 测序图谱及比对分析

附录C 荧光定量PCR扩增曲线和溶解曲线

附录D 目的基因在样品中的相对表达量