校正离子源效率低下的方法使得样品间归一化成为可能

摘要

在质谱法中，显著误差在样品制备期间(样品间误差)、在离子产生期间(离子抑制)和在离子传输期间(离子传输损耗)引入。我们证明了校正离子抑制和离子传输损耗的能力，并且一旦校正了离子损耗，则分析样品的样品间归一化到内标是可能的。通过归一化至标准样品，分析样品变得与任何类似处理的样品完全可比。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年6月22日提交的美国申请62/688846的优先权，其公开内容通过引用结合。

背景技术

传统上，由于离子产生或离子传输的效率低下而在离子源中频繁引入变异性，所以认为质谱法并不是良好的定量方法。因此，在希望准确定量的情形下，需要内标和清洁的“基线”色谱分离。随着待测量的化合物的数量增加，这种实践变得昂贵且笨拙；因此，在大多数情况下，待定量的化合物的数量保持较小，并且采用具有明确定义的化学浓度和组成的内标。

实际的定量行为是在逐个化合物基础上进行的，并且定量通过直接比较内标的量与分析物的量来实现；即，分析物与内标的比率乘以已知内标量。这实现了比最初获得的原始数据更好的对每种化合物的定量解决方案，因为原始数据几乎总是遭受到一些离子损耗。

本发明采用校正整个样品的全局方法，并且获得归一化和直接定量每种化合物的损耗百分比的额外益处。不存在采用这种方法的已知现有文献。

在大多数质谱仪的离子源中见到的变异是由在所需要的分析过程的两个不同部分(即，被测量离子的产生和传输)期间的电离损耗引起的。离子抑制是应用于离子产生过程期间发生的离子损耗或效率低下的通用术语。在离子传输通过源和质量分析器期间，发生另外的离子损耗。这两个过程引起离子损耗或变异，但是它们在其性质上非常不同。

离子抑制损耗因化合物而异，并且对产生离子的环境敏感，因此它们在样品与样品之间变化，而由源的几何形状和电子器件引起的离子损耗经受显著改变，但是在延长的时间段内是稳定的；二者都会给质谱学家带来不同种类的问题，因为它们短期和长期地降低了总体样品间(sample-to-sample)可比性。

代谢组学分析目前分为两种主要方法{Fiehn

非靶向分析的优点在于，它没有对需要研究的分子类别做出推测，并且因此被认为是产生假想的良好手段，并且是更大系列的“发现”研究中的第一步。不幸地，通常在非靶向分析中采用的技术在其核心处具有一系列经常被忘记或被误解的假设。

这些假设中三个最严重的假设是1)离子抑制，通常称为矩阵效应(ME)，对于给定的样品类型，在所有样品之间可能是一致的，因此可被忽略；2)在给定实验的运行时间期间，离子传输损耗将不会显著改变；以及3)样品在大小和形式方面足够相似，因此归一化是简单的或不必要的。

如下文所讨论，所有这三个假设都是相关的，并且一旦它们彼此相关，则所有这三个假设都可以被校正。尽管最初应用于代谢组学，但本解决方案适用于其中需要使用化学复杂的内标定量大量化合物或归一化是基于校正的数据的所有情形。

离子抑制(抑制)是一种尽管了解甚少，但充分表征的{Annesley

通常，认为抑制是分子结构的复杂函数，其涉及化合物的所有物理参数；即酸度/碱度、极性/芳香性、疏水性/亲油性、电子和物理结构、化合物本身的浓度{Annesley

已经显示，例如在通过固相提取(SPE)或通过基线色谱分离制备样品期间，样品的化学复杂性的降低可降低一些化合物的抑制，但是这些方法都没有完全去除抑制{Vats

因为抑制发生在源的电离过程中，所以抑制是与所有源后MS过程(包括ms/ms{Freitas

校正离子抑制的效应的最常见方式是通过使用内标{Baillie

因此，开发了基于同位素富集的生物混合物的技术，例如MIRACLE {Mashego

当生物提取物是生物体(例如大肠杆菌)的提取物时，分析成为生化复杂的内标中所有化合物的靶向分析。这些技术基于被许多上述作者证明的事实，即如果共洗脱标准物和分析物，则二者总是被相同程度地抑制。

在这些情况下，如果标准物的浓度是已知的，则分析物与标准物的比率允许计算分析物的浓度。这种计算容易实现，并且是所有此类研究的终点。

然而，需要注意的是，在标准物中使用氘几乎总是改变化合物的色谱行为，从而冒着分析物和标准化合物不会共洗脱的风险。出于这些原因，必须使用不会改变化合物的色谱行为的重稳定碳同位素，例如

技术(例如MIRACLE，其中同位素标准物使用＞99%

与离子抑制损耗不同，离子传输损耗具有长期稳定性，但当离子源的电子或物理特性改变时发生改变。这些改变是基础性的。

因此，与连续改变的离子抑制不同，离子传输变异可能使得难以直接将一个样品或实验的结果与甚至在源已经改变之后分析的相同样品的重新分析中见到的结果进行比较，但是通常不影响结果的单个分析主体。尽管源是看起来相当简单的装置，但是在初始离子产生期间改变流出物喷雾的角度、改变其任何表面的电压、或透镜、或者调节或清洁毛细管或其他内表面等等改变了质谱仪中传输的离子的数量，使得对不同时间运行的样品的比较不易变得无用。尽管经常努力降低传输损耗的总体水平，但是几乎没有努力对其进行校正。

样品间归一化(如抑制)是充分表征的研究领域，并且有许多用于归一化的方法提供{Li

下文公开的发明扩展了在下列文献中描述的方法：美国专利7,820,963号，基础IROA专利，2010年10月26日颁发，下文中称为IROA963；美国专利7,820,964号，2010年10月26日颁发，下文中称为IROA964；美国专利8,168,945号，2012年5月1日颁发，下文中称为IROA945；美国专利8,536,520号，2013年9月17日颁发，下文中称为IROA520；美国专利8,969,251号，2015年3月3日颁发，下文中称为IROA251；美国专利申请公开U.S. 2018/0315587 A1，2018年11月1日公布且本文中称为IROA587。这些专利、申请和其中引用的技术通过引用结合到本文中。

发明内容

预期一种在质谱(MS)分析性分析期间校正离子的源内或传输损耗并使用校正的离子数据以针对样品间差异进行归一化的方法。根据这一预期方法，对分析样品进行质谱分析以提供指示存在的每种化合物的母峰和一个或多个子峰的峰集的原始数据。分析样品由两个部分的生物产生和/或半合成产生的分子量为约60 Da至约100,000 Da的化合物构成。

所述分析样品的第一部分由其同位素以其天然丰度量存在的元素(第一同位素)构成。第二部分提供可存在于第一样品中的有同位素特征的化合物(第二同位素)。同位素特征(isotopic signature)通过第一部分的除氢和氘外的元素的一种或多种天然丰度的第一同位素的稳定的第二同位素的存在来提供。相对于第二部分中的相同元素的同位素，预期的天然丰度同位素通常具有较低的分子量。因此，第一部分和第二部分两者中都存在的化合物是等同位素体(isotopomer)。

为了便于理解，贯穿本文通常使用12C和13C作为第一同位素和第二同位素的示例。这些同位素也优选用于本文中。

在该分析样品中，第一部分是天然同位素丰度C12实验样品，并且第二部分是化学复杂的内标样品，其含有约50至约10,000种可存在于实验样品中的有同位素特征的含C13的化合物。天然丰度样品和内标样品两者中都存在的化合物被称为成对化合物，并且它们的MS峰被称为成对峰集。

给定化合物的峰集的峰的高度总和可提供该化合物在其分析样品的部分中存在的量的相对量度。化合物的峰集下的面积总和也提供该化合物在其部分中存在的量的相对量度。因此，对每个部分中存在的成对化合物的峰集的高度或面积求和并确定那些成对化合物峰的高度总和与高度总和或面积总和与面积总和的比率，提供两个部分的化合物中存在的两种同位素如12C/13C的相对量的比率。

分开地校正每个成对峰集的离子损耗，并将所得校正值用于确定归一化因子。对于这方面，通过将每种化合物的内标校正为作为实验确定的恒定值且始终相同的值来校正每种化合物的源内离子损耗，以提供损耗校正的内标值。将在每种分析样品中测定的每种化合物的C12/C13比率确定为原始数据中所见的化合物的所有天然丰度C12峰的总面积或峰集高度分别除以原始数据中所见的化合物的所有内标C13峰集的总面积或峰集高度。天然丰度化合物的损耗校正的天然丰度值通过将损耗校正的内标值乘以那些化合物中每一种的C12/C13比率而确定。

使用利用求和技术的归一化算法，以及对于分析样品的天然丰度部分和内标部分两者的所有成对峰集如此获得的所有校正值，来确定所有校正的成对峰化合物的归一化因子。内标部分的总和是两个分析物部分中都存在的所有化合物的损耗校正的内标值的总和，且天然丰度部分的总和是两个分析物部分中都存在的所有化合物的损耗校正的天然丰度值的总和。

在一个实施方案中，通过将天然丰度部分的总和除以内标部分的总和来计算每种分析样品的归一化因子。通过将每个单独的损耗校正的天然丰度值乘以归一化因子的倒数来对所述分析样品的每种测定的天然丰度化合物的数据进行归一化，以提供归一化天然丰度值。

附图说明

在形成本公开的一部分的附图中，

图1是绘制出作为注入等分试样大小的函数获得的MS原始数据信号的显示任何化合物的理论12C信号的图表；

图2是绘制出作为注入等分试样大小的函数获得的MS原始数据信号的显示内标中的任何化合物的理论13C信号的图表；

图3至图8使用自下文讨论的利用人血浆样品作为示例的“实施例”获得的数据制作。图3本身为显示获得的原始MSTUS C12值(菱形)和校正的MSTUS C12值(正方形)相对于注入等分试样大小的标绘的图表，清楚地显示原始值没有随着等分试样体积的加倍而加倍；

图4显示所有样品的C12与C13的基准比率，相关性为0.9967；

图5是显示所测定的所有化合物的频率相对于离子抑制百分比的图表，其示出所有化合物显示一定水平的离子抑制；

图6是显示式C9H16N2O5的化合物的MS信号值相对于以微升计的等分试样大小的图表，其中原始值以圆圈显示，且校正值以菱形显示，并且显示具有非常高水平的离子抑制的化合物与它们的浓度不相关，注意到在400 μL的等分试样大小时抑制为91.8%，并且注意到峰高或峰面积与该水平下的注入浓度负相关；

图7是显示针对校正的C12值(正方形)和归一化值(三角形)，MS信号值相对于等分试样大小的图表；

图8是绘制硬脂酸样品的MS信号相对于等分试样大小的图表，其中原始数据值以菱形显示，归一化值以正方形显示，且预期值以三角形显示，其说明没有内标的化合物的归一化被正确地归一化但保留抑制，原因是那些值在没有内标的情况下不能被校正；以及

图9是显示以下情况的图表：所有化合物的曲线下总面积(MSTUS)受抑制严重影响(圆圈)，而校正的MSTUS-IS值的相关性(菱形)具有零标准偏差，因此对于计算是完美的。

具体实施方案

本发明预期一种在质谱(MS)分析性分析期间校正离子的源内或传输损耗并使用校正的离子数据以针对样品间差异进行归一化的方法。根据该预期方法，对分析样品进行质谱分析，以提供指示存在的每种化合物的母(基础)峰和一个或多个子峰的峰集的原始数据。

应当理解，在大多数MS分析中，单一化合物提供一个基础(母；最高)峰和一个或多个子峰，所述子峰的高度小于母峰的高度，并且尤其取决于许多公知的因素，特别是所测定化合物中存在的天然非最丰富的同位素的量。因此，每种分析的化合物通常提供多个数据值，所述数据值表现为MS峰，并且在本文中称为所存在和测定的每种化合物的“峰集”。

分析样品由两个部分构成，在本文中称为第一部分和第二部分，它们是生物产生和/或半合成产生的(下文讨论)分子量为约60-75 Da至约100,000 Da的化合物。所检验的化合物的分子量通常在较窄的范围内，且所研究的范围随所用机器和所用样品制备技术而变。

一个优选的重量范围是约60 Da至约2000 Da。另一个优选的范围指望1000 Da或更小至约60 Da的化合物。[以道尔顿(Da)和原子质量单位(AMU)表示的分子量在本文中可互换使用]。

分析样品的第一部分由其同位素以天然最丰富的量存在的元素(第一同位素)构成。第二部分提供可存在于第一样品中的有同位素特征的化合物(第二同位素)。

同位素特征(signature (sign))通过第一部分的元素的一种或多种天然最丰富的第一同位素的稳定的第二同位素的存在来提供。相对于第二部分中的相同元素的同位素，第一部分的预期的天然最丰富同位素通常具有较低的分子量。第一部分和第二部分两者中都存在的化合物被称为等同位素体。

稳定的天然非最丰富的同位素对放射性衰变是稳定的。同一原子的第一同位素和第二同位素的说明性实例为选自以下同位素的一种或多种元素：碳(C12和C13)、氮(N14和N15)、氧(O16、O17或O18)、硫(S32、S33、S34或S36)、氯(Cl35和Cl37)、镁(Mg24、Mg25和Mg26)、硅(Si27、Si28和Si29)、钙(Ca40、Ca42、Ca43和Ca44)和溴(Br79和Br81)。第一同位素和第二同位素不是氢和氘。

为了便于理解，贯穿本文通常使用12C和13C作为第一同位素和第二同位素的示例。这些同位素也优选用于本文中。

在所述分析样品中，第一部分是天然同位素丰度C12实验样品，并且第二部分是化学复杂的内标样品，其含有约50至约10,000种可存在于实验样品中的有同位素特征的含C13的化合物。在一些优选的实施方案中，这样的有同位素特征的含C13化合物的数量缩减到约50种至约2000种。这种缩减可通过调整色谱技术来实现，这是众所周知的。

分析样品的实验样品部分通常是生物来源的，例如血清、血浆、尿、淋巴或其他体液或产物如粪便、细胞培养溶解产物、切碎的植物动物或真菌组织。实验样品部分也可源自实验室化学反应，其中存在含有一种或多种反应物、产物和副产物的反应组合物。

天然丰度样品和内标样品两者中都存在的化合物被称为成对化合物(等同位素体)，并在MS分析时提供成对峰集。给定化合物的峰集的峰的高度总和可提供该化合物在其分析样品的部分中存在的量的相对量度。化合物的峰集的曲线下面积的总和还提供该化合物在其部分中存在的量的不同相对量度。

因此，对每个部分中存在的成对化合物的峰集的高度或面积求和，并确定那些成对化合物峰的高度总和与高度总和或面积总和与面积总和的比率，提供两个部分的化合物中存在的两种同位素如12C/13C的相对量的比率。

分开地校正每个成对峰集的离子损耗，并将其用于确定归一化因子。对于这方面，通过将每种化合物的内标校正为作为实验确定的恒定值且始终相同的值来校正每种化合物的源内离子损耗，以提供损耗校正的内标值。将在每种分析样品中测定的化合物对的每种化合物的C12/C13比率确定为原始数据中所见的化合物的所有天然丰度C12峰的总面积或峰集高度分别除以原始数据中所见的化合物的所有内标C13峰集的总面积或峰集高度。天然丰度化合物的损耗校正的天然丰度值通过将损耗校正的内标值乘以那些化合物中每一种的C12/C13比率而确定。

使用利用求和技术的归一化算法，以及对于分析样品的天然最丰富部分和内标部分两者的所有成对峰集如此获得的所有校正值，来确定所有校正的成对峰化合物的归一化因子。内标部分的总和是两个分析物部分中都存在的所有化合物的损耗校正的内标值的总和，且天然丰度部分的总和是两个分析物部分中都存在的所有化合物的损耗校正的天然丰度值的总和。

通过将天然丰度部分的总和除以内标部分的总和来计算每种分析样品的归一化因子。通过将每个单独的损耗校正的天然丰度值乘以归一化因子的倒数来对所述分析样品的每种测定的天然丰度化合物的数据进行归一化，以提供归一化天然丰度值。

在一个优选的实施方案中，成对化合物的同位素特征符合IROA模式，如美国专利申请公开U.S. 2018/0315587 A1和前面提到的相关专利文献中所述。在另一个优选的实施方案中，每种化合物的损耗校正的内标值是自另一分析(即，不同于权利要求中所述分析的分析)的数据获得的实验确定的值。在另一个实施方案中，内标中每种化合物的损耗校正值从赋值数据库检索。在又一个实施方案中，每种化合物的损耗校正的内标值是从目前或所述(所要求保护的)分析中的数据通过实验确定的。

在另一个优选的实施方案中，通过将分析样品的第一部分和第二部分的化合物分开地与含有同一反应性基团的等同位素体试剂对中的一种或另一种反应，以半合成方式提供同位素特征，所述反应性基团与分析样品部分中存在的一种或多种成对化合物的官能团反应并键合。在本实施方案中，在将所述第一部分和所述第二部分混合以形成分析样品之前，进行分析样品的第一部分和第二部分的化合物与等同位素体试剂对中的一种或另一种的分开反应。

因此，说明性地使用细胞培养物作为所述两个部分的来源，可溶解细胞并分开地使所得溶解产物与提供确定的特征如IROA特征或类似模式的等同位素体试剂对中的一种或另一种反应，通过离心将不溶性细胞碎片与剩余物分离，并将所得两种上清液混合以形成分析样品制剂。或者，可对每种上清液进行所需的等同位素体标记反应，随后混合以形成分析样品组合物。

因此，短语“分析样品”在本文中用作旨在涵盖“分析样品制剂”和“分析样品组合物”两者的通用短语，因为使用任一者提供优于现有技术的增强结果。优选使用“分析样品组合物”，只不过是因为需要更多的等同位素体试剂来与包括碎片的细胞内容物充分反应，并且因此会造成浪费。

一旦形成，分析样品通常通过气相色谱(GC)或更通常通过液相色谱(LC)或高压液相色谱(HPLC)物理分离，然后将洗脱物提供到质谱仪用于质谱(MS)分析。因此，该分离技术在现代文献中通常被称为LC-MS。

通过将实验样品(待分析)如生物提取物与恒定量的化学复杂的同位素可区分的内标混合来制备分析样品。作为最低限度的定义，内标含有可重现浓度的可重现化合物组，并且可重复使用，理想地至少五至十年；然而，使用这种方法可使内标短期起作用，其中结果仅在较短的时间段内是可比的。

在一个优选的实施方案中，内标的化学组成与实验样品的完整化学组成的小分子量化合物(例如，小于约2000 Da，且更通常小于约1000 Da)匹配。然而，实验样品的自然化学变异排除了完美性。生物产生的代谢物的重量下限是约60-75 AMU，如在乙酸和甘氨酸中。因此，内标优选具有在所有实验样品中发现的至少约50种化合物。随着通常发现的化合物的数量增加，归一化更佳。

由于内标的化学复杂性，所有分析样品都可被看作内部由两种完整样品：实验样品和内标样品组成。分析样品被分析之后，使用例如ClusterFinder™、mzMine、mass-hunter的软件或类似这样的软件来发现并定量每个样品中可见的所有峰。

来自内标的每个峰应被识别为源自内标，并且来自实验样品的每个峰应被识别为源自实验样品。对于每种分析样品，在实验和内标两者中发现相同化合物的所有情况都应该被识别，并且可被称为“通常发现列表”。

对于“通常发现列表”中的所有化合物，对于源自实验样品的化合物和源自内标的其等同位素体两者，都将存在质谱响应。这种响应可以是曲线下面积(或峰高总和)、单一同位素的高度的形式，或者也可使用其他标准量度。所见到的响应分别被称为“原始C12响应”和“原始IS响应”。众所周知，并且在下文的实施例中证明，由于离子在源和质谱仪的其他零件中的产生和传输中存在显著的变异，所以这样的原始响应不是它们的潜在化合物的浓度的正确普遍反映。

除了这些原始值之外，原始“C12/C13比率”可通过将“原始C12响应”除以“原始IS响应”来计算。因此，从发现的所有化合物的分析数据，可得到三个值，“原始C12响应”、“原始IS响应”和“C12/C13比率”。

已知前两个值是它们的真值的不完美反映，但是熟练的从业者理解第三个值是原始真值的比率的准确反映，因为公认的是，分析过程中遭受的损耗将由两侧同等地施加。

对于内标，如果已知准确的原始值；即没有遭受损耗或遭受最小损耗的响应，则“原始IS响应”可用“校正的IS响应”代替，并且“校正的C12响应”可通过将“校正的IS响应”乘以“C12/C13比率”来计算。

准确的原始值可通过实验确定，或者对于每个内标确定一次，记录，然后该值随后可根据需要由软件检索。因为原始响应中的误差是其变异性，对于本领域技术人员来说，“准确的原始值”的精度不如使用乘以“C12/C13比率”的恒定且可重现的值重要。

原始数据中的损耗以复杂的方式随时间和化合物两者而变化。一些损耗归因于每种特定化学结构的性质，并且随着引起化合物电离的环境的改变而在每个样品内变化。

同样众所周知的是，其他损耗作为离子源改变的物理参数的函数而广泛地施加到所有化合物。这些后者的损耗具有长得多的时间线，但是当它们改变时，它们使得之前和之后的样品直接无法比较。尽管存在补偿这种长期损耗的方法，但是它们需要作出潜在样品实际上是可比的假设，这可能是真实的，也可能不是真实的。

这里描述的技术对这两种类型的损耗都进行了校正，并且使用本领域技术人员通常接受但从未实施的第一原理非常准确地进行这一点。对于准确的原始值使用标准值是特别有用的，因为特别克服了长期的改变。

在校正离子损耗之后，仍然存在尚未解决的问题，即事实上样品可能具有不同的大小，如上所讨论，这可能使得即使具有校正结果的样品也无法与其他样品比较。这个问题通常被称为归一化问题。如前所讨论，存在许多归一化方法。

求和型归一化算法对于克服样品大小差异问题是有用的。几种这样的算法在{Li

使用R脚本(3.4.2版)来模拟计算，并开发用于抑制校正和MSTUS归一化的算法。简短地讲，算法中使用的所有峰都具有最低标准：1)它们必须存在于所有样品中，2)它们必须高于最小峰面积(或高度)，和3) C13-IS与C12单一同位素峰之间的比率必须大于0.001。关于标准1)，所用的峰可存在于两个部分中，使得计算的数目随样品而变化，或者存在于所有样品中从而使用相同的集，使得优选地，峰存在于两个和/或所有样品中。

原始数据集具有在所有16个样品中发现的389个IROA峰，这些峰中的232个满足接受标准并用于MSTUS归一化。注意，MSTUS归一化总是使用整个数据集的子集来进行归一化。在算法中使用子集，且甚至所发现的IROA峰的子集，但是因为它们都是IROA峰，所以都被确定为生物来源，并且对于所考虑的232种化合物，存在足够的数量来确定所需的MSTUS比。

对于所有峰，使用抑制校正的C12值，因为它们是样品中发现的真实浓度的较好反映。这些抑制校正值通过将最少抑制的C13-IS值乘以C12与IROA AUC的比率来确定。(这些的范围为0.001至98.5。)C13-IS值固定在对于特定IS化合物所见的最少抑制值。

为了归一化，将C12侧的MSTUS总和除以C13侧的MSTUS总和以获得校正因子，因为当每种化合物乘以这个因子时，原始样品中每种化合物的总和(MSTUS C12)将等于所有抑制校正的IS值的总和。因为这些样品在化学上是相同的，归一化的证据是归一化后的值是相同的。对于其中化学平衡改变的“正常”样品，归一化使得两侧相等，但不干扰化合物之间的浓度关系。

因为IROA内标(IROA-IS)总是以相同浓度存在，所以所有IS峰(MSTUS-IS)的总面积(或高度)的标绘应匹配图2中所示的理论标绘。然而，如图9中所见，与校正值相比较，MSTUS-IS原始值显示随着浓度增加来自其组成峰的总体抑制的显著累积效应。

类似地，根据实验设计，原始天然丰度MSTUS-C12信号应可预测地增加，如图1中所证明。但是，在这种情况下，如图3中所示，实际的原始数据由于影响样品中的大部分化合物的总体抑制而偏离，产生比其应当的值低几乎60%的值。

以上讨论了MSTUS值，或MSTUS集中的所有化合物的总和。在检验单个化合物，例如L-酪氨酸时，除了最低浓度外，所有样品中的抑制都是明显的。在最高浓度的样品中，使用以下等式，29.1%的抑制看来是明显的：

(SC-C12 - 原始C12)/SC-C12

其中SC-C12是抑制校正的C12的平均值，并且原始C12是相同样品中未校正的峰的平均值。从这个数据集中清楚可见，实际上每种化合物都表现出一些抑制，并且它们的内标也同样如此。

因此，不足为奇的是IROA酪氨酸内标不仅被抑制，而且显示与其天然丰度对应物完全相同的抑制水平(独立测定的数值)。尽管分析物和内标两者都被抑制，但IROA IS面积(或高度)与分析物面积(或高度)的比率与实验设计完全一致。这并不奇怪，因为它们在电离过程期间经受相同的环境，而且IROA采用的碳同位素不应对电离性质有任何显著影响。

最近已经显示，IROA等同位素体集合在离子迁移率方面表现相同，并且在破碎方面可预测地相似。除了质量之外，任何给定峰的IROA等同位素体峰都将表现一致。

如下文所讨论，在计算中所检验和使用的232种化合物必须具有大于250,000的基础峰，和在最低浓度下至少0.001的比率。这个集合中的所有化合物的抑制范围为约6%至约92% (图5)。大多数化合物似乎被抑制约20%至约60%。在非常高水平的抑制下，一些化合物受到如此严重的抑制，以致它们与它们的实际浓度负相关，如对于图6的C9H16N2O5化合物可见。注意，250,000的基础峰值是机器特异性的，并且随机器而变化。

因为每种化合物的分析物与IROA-IS的比率正确地反映了分析物相对于IROA-IS的原始浓度，所以抑制校正值可通过如下确定：将IS设定为等于其最少抑制值(公认为实验上看到的最高值)，并将这个值乘以该比率，以确定合理的抑制校正值可以是多少。

尽管可使用任何数值来充当代替“最少抑制值”的常数，但是使用实际最少抑制值具有保留所讨论的峰的近似正确幅度的益处。因此，对于发现的所有化合物计算抑制校正值是相对容易的。C12抑制校正的公式为：

X * C12/IROA-IS比率

其中X可以是任何值，但是最少抑制的观察值处于正常幅度。类似地，在没有抑制的情况下，IROA-IS是常数，因此它总是被赋相同的值。

MSTUS算法通常用于归一化基于NMR和LC/MS的代谢组学数据，特别是高度可变的样品，例如尿。然而，显然MSTUS不是完美的解决方案，因为它没有考虑数据集中的噪声。这种噪声是由于包括人为数据而导致的，这导致了极端的抑制，这又损伤了MSTUS本身的潜在合理性。

在IROA中，由于噪声不表现出IROA特性，因此噪声被自动去除。因此，使用所有IROA化合物的抑制校正值，MSTUS算法现在可应用于这种校正的数据集以实现更好的结果。此外，由于已加入了IROA内标，因此存在两种物理样品(构成分析物的天然丰度样品，和参照IROA-IS样品)，并且可执行相对于内标的真实归一化，同时去除噪声，这在先前不可能。

IROA-IS中每种分析物的相关峰的独特碳包络(例如95% C13)确保去除人为数据。使用特定(ClusterFinder™)算法来搜索这些包络(envelope)，然后在天然丰度峰样品中识别它们的相关峰。消除了没有匹配的任何特征，去除噪声和人为数据。MSTUS归一化校正因子的计算是：

SCC12总和/SCIS总和

其中SCC12总和是所有考虑的C12化合物峰的抑制校正的总面积(或高度)，且SCIS总和是所有考虑的IS化合物的抑制校正的总面积(或高度)。

将抑制校正值乘以这些因子以将它们全部归一化为相同的基础。归一化MSTUS值是所有归一化值的总和。在正常代谢组学研究中，其中样品大小和化学成分是变化的，归一化校正样品大小或制剂中的差异；即影响整个制剂的变化，并且由于化学组成的差异，归一化总和不同。

在本实验的设计中，并且仅在本实验中，由于样品在化学上是相同的，因此归一化应当将所有样品归一化到相同，并且这样做(未示出)。IROA和MSTUS方法的组合提供可重现手段以产生离子抑制校正数据，所述数据可被有效地归一化以实现准确的测量。由于存在两个数据集，所以可使用组合的MSTUS求和方法来更好地适应这两个数据集。

实施例

对于三次重复(n＝3)中的每一次，将75 μL普通人血浆样品(含有K2-EDTA作为抗凝剂)添加到聚丙烯微量离心管中，随后添加1.5 mL干冰冷却的甲醇，并将汇集的溶液在4℃下以16,100 g离心10分钟。将上清液转移到新的管，从其中制备400 μL、200 μL、150 μL、100 μL、75 μL和50 μL的等分试样。

然后使用离心真空浓缩器干燥甲醇等分试样，并-80℃下储存。在即将LC-MS分析前将干燥的残余物再悬浮于40 μL含有20 μg C13 IS的TQ-IS (TruQuant™ C13 IS; IROATechnologies)溶液中。

通过将含有0.6 mg以95% C13完全标记的生物复杂的混合物的TQ-IS小瓶的内容物溶解在1.2 mL H

通过将含有各20 μg以5% C13和95% C13两者完全标记的生物复杂的混合物的TQ-LTRS小瓶的内容物溶解于40 μL H

汇集的血浆使用-80℃甲醇提取(甲醇:血浆，20:1)。将150 μL、200 μL、250 μL、300 μL、350 μL、400 μL、450 μL、500 μL和550 μL的汇集提取物的六份重复等分试样递送到小瓶，使用离心真空浓缩器干燥，并在-80℃下储存。

为了分析，用40 μL的TQ-IS (或IROA-IS)在蒸馏水中重构样品。通过添加40 μL蒸馏水使TQ-LTRS再溶解。将样品随机化并根据其各自的色谱系统LC-MS进行分析。

色谱系统由Phenomenex Kinetex™ HILIC柱(1.7 µm，100 Å，100 x 2.1 mm)以及Phenomenex Kinetex™ C18柱(2.6 µm，100 Å，150 x 2.1 mm) C18柱组成，且将柱室保持在40℃。溶剂A由含有10 mM正乙酸铵和0.1%甲酸的水组成，并且溶剂B是含有10 mM乙酸铵和0.1%甲酸的甲醇。

在整个色谱运行期间使用200 μL/分钟的流速。从0分钟至5分钟，溶剂组合物保持恒定为5%溶剂B。然后从5分钟至30分钟，溶剂组合物从5%溶剂B斜升到95%溶剂B。接着从30分钟至40分钟，将95%溶剂B的溶剂组合物维持。最后，从40分钟至45分钟，使溶剂组合物返回到5%溶剂B并保持恒定。

质谱法是在以FTMS全扫描模式操作的Thermo Scientific™ Orbitrap Fusion™Lumos™ Tribrid™上执行，其中扫描范围为70-650 m/z且分辨率为240,000。对于加热的电喷雾正电离，使用3500的喷雾电压，并且将汽化器和毛细管温度分别设定为250℃和375℃。鞘流气体、辅助气体和吹扫气体压力分别为35、10和0 (任意单位)。

使用ClusterFinder™软件(3.1版-IROA Technologies)分析数据。

TQ-IS (或IROA-IS)是生化复杂的内标。TQ-IS和TQ-LTRS是得自IROATechnologies的TruQuant™工作流的一部分。这里使用这些试剂是说明性的，这里描述的方法与其他同位素标记系统一起工作，所述其他同位素标记系统含有足够数量的化合物以确保MSTUS归一化是准确的。TQ-IS与匹配的TQ-LTRS一起使用，以发现、列出和定性TQ-IS中的所有化合物。不需要使用TQ-LTRS。在本研究中，发现并分析了对于内标和样品两者中都存在的102种化合物的抑制响应。

在本实验中采用的实验设计极其简单；也就是说，在温和的氮气流下，递送不同等分试样大小的一式三份的单一均匀溶液(这里为人血浆的提取物)并干燥。因为每个样品的来源和化学物质发源于单一均匀溶液，并且仅在体积上变化，即使其绝对浓度可能是未知的，但每个样品中每种化合物的相对量应与原始等分试样的体积成比例地增加，并且在绘图时应对应于图1。

一旦干燥，各样品用恒定体积的内标(在这种情况下，40 μL)再溶解，因此内标中每种化合物的量应恒定，并且对应于在图2中所示的图表。以随机顺序注入样品并检验所得数据。

图3(菱形)显示对所有分析化合物所见的平均响应，但如可以看出的，其不对应于预期曲线(图1)。在这种情况下，观察值低于预期值，并且随着浓度增加而显示更强的偏差，使得清楚的是，这里所见的主要(如果不唯一)效应是抑制。

另一方面，对于所有化合物，每种分析物的AUC与其相应内标化合物的AUC的理论比率；即“C12/C13比率”，示于图4中，并且这对应于预期曲线(图1)。因此清楚的是，如先前研究已表明，只要内标中的同位素是C13，则总体分析物与内标的比率不受离子抑制的影响；即内标及其相应分析物的电离速率通常被相同程度地抑制。

此外，最少抑制将发生在具有最小等分试样样品的样品中。因此，认为具有最小等分试样的一式三份样品的内标的平均值是用于我们第一次近似的最少抑制值。

鉴于上面所讨论的观察结果，考虑以下已知和真实的事实：1)已知每个样品中每种内标化合物的浓度都以恒定值存在，2)已经显示，所有化合物的分析物与内标的比率看来正确地反映了原始浓度，而与抑制无关，因为3)分析物和其相应的内标被同等地抑制，因此：

1)可通过将内标的原始“未抑制”值提供为内标的校正值来校正观察到的内标值，并且

2)将这同一值乘以分析物与标准物的比率，以确定分析物在其未被抑制的情况下将具有的正确值。

对于每种化合物内标和分析物对，这些值非常容易计算，并且在图3中看到原始值和校正值(菱形=原始数据，正方形=校正数据)。校正数据与理论图表(图1)充分对应。

在本研究的计算中，使用在具有最低分析物浓度的样品中所见的内标的值作为“未抑制值”的估计值。毫无疑问，即使这个值也受到一些抑制。然而，如果考虑数学，则容易认识到，该值本身的重要性小于该值是适当幅度的恒定值，因为可使用这样的值来克服短期和长期源内损耗两者。

在本分析中使用的值具有相对于所有其他化合物的正确近似幅度，并且认为这具有一些微小的益处。实际上，很可能是总是用作内标中的每种化合物的“标准值”的单一值的建立提供了用于产生“标准校正谱”的一般机制，其去除了在实验运行多天、多月或甚至仪器的一些变化时“将谱相对于彼此归一化”的需要；即不仅是克服了样品间的误差。

仪器漂移问题的不同之处在于，它们在延长的时间段内作为总变异源施加在所有质谱信号的大部分上，但是也随时间而随机变化。可理解，这可被校正。如果具有总是基于内标的标准量和固定SOP的比率，则先前的讨论清楚地表明可使用上面讨论的方法计算分析物的正确值。

对原始值的校正的分析指示，在本实验中看到的抑制范围为约6%至约91.8% (见图5)。令人惊讶的是，不存在没有遭受任何离子抑制的化合物。然而，该分布的总体形状和中值为约40%的事实支持这种观察结果。可能存在比91%更高地被抑制的化合物，然而，由于继续存在的离子很少，所以可能难以看到这些化合物并不足为奇。被抑制大于80%的化合物通常与其注入浓度负相关，并且无论注入浓度如何，60%至80%的化合物基本上是平的(见图6)。这些事实强烈地指示为什么原始数据的校正如此重要。

上述校正仅校正了离子损耗，它们不校正样品大小或浓度的变异，技术上称为“归一化”。鉴于上述结果和讨论，应当清楚，原始数据是大多数化合物的实际浓度的足够不准确的反映，以致于基于原始数据的任何归一化都包含显著量的误差。在此采用的归一化策略具有两个新颖的方面，首先，其使用如上所述的针对离子损耗校正的数据，其次，由于在每种分析样品中都包含完整的标准样品，所以将实验样品归一化为其结合的内标。

第一策略方面通过校正所有离子损耗来减小整个数据集的总体变异。第二方面将校正的数据集归一化为校正的“标准”样品，并且这样做使得实验样品与归一化为相同“标准”样品的任何其他实验样品间接地可比。该机制是直截了当的：在离子损耗的校正中，我们校正了每种化合物的实验部分和内标部分两者；因此，MSTUS求和优选地也对样品求和，以提供“实验样品中所有校正值的总和”被计算，和“内标样品中所有校正值的总和”被计算。

然后，“归一化因子”是“实验样品中所有校正值的总和”除以“内标样品中所有校正值的总和”。一旦计算，则通过将每种化合物的校正值乘以“归一化因子”而将所有校正值归一化。一旦归一化，样品则看起来具有相同的大小，而不论有任何物理样品间差异(见图7)。

尽管对于浓度非常易变的样品如尿来说，归一化的需要更加明显，但是令人惊讶的是难以处理非常小的活组织检查样品或其他实体样品，原因是在制备期间引入了显著的变异，如水分含量，和常规发生的实体损耗。这种双重MSTUS算法针对所有这样的变异调整所有样品。图7中所示的实验数据可代表归一化的极端情况，但是其在这里的成功使得清楚的是，其将在所有情况下都起作用。

由损耗校正的化合物计算的归一化因子实际上适用于实验样品中发现的所有化合物，无论它们是否具有匹配的内标。因此，归一化因子可应用于可能没有机会被校正的未校正峰，并且这些化合物将被正确地归一化，但仍将显示抑制损耗(见图8)。即使不可能校正离子损耗，归一化值也比原始值更准确。

从该讨论中应当清楚的是，通过使用化学复杂的内标，可校正任何质谱数据集中的许多主要变异源，并且一旦校正，就可使用内标作为双重MSTUS算法的基础来将样品彼此归一化。这些组合的动作有效地校正了大多数质谱分析中的大多数误差。

本文引用的每个专利、专利申请和文章都通过引用并入。冠词“一”或“一个/种”的使用旨在包括一个/种或多个/种。

前面的描述和实施例旨在说明而不是视为限制。在本发明的精神和范围内的其他变体也是可能的，并且对于本领域技术人员来说它们本身将是容易呈现的。

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