表面修饰磷酸钛/锆基团的聚乙烯亚胺-二氧化硅微球及其制备和应用

摘要

本发明公开了一种表面修饰磷酸钛/锆基团的聚乙烯亚胺‑二氧化硅微球的制备方法，包括如下步骤：在二氧化硅微球的表面键合具有高密度胺基的聚乙烯亚胺分子；通过Mannich反应将聚乙烯亚胺结构中的大量胺基活泼氢转化为亚磷酸基团；利用亚磷酸基团与金属离子之间的螯合作用吸附钛离子或锆离子，最终制备得到表面修饰磷酸钛/锆基团的聚乙烯亚胺‑二氧化硅微球。通过本发明所提供的制备方法所制备的表面修饰磷酸钛/锆基团的聚乙烯亚胺‑二氧化硅微球，能够对复杂样品基质中的磷脂类化合物实现特异性吸附和高效富集，可将其应用于血清中轮廓磷脂的特异性高效固相萃取，有望应用于疾病代谢组学中磷脂类疾病标记物的筛选。

说明书

技术领域

本发明属于功能化无机材料和分析技术领域，涉及一种表面修饰磷酸钛/锆基团的聚乙烯亚胺-二氧化硅微球及其制备和应用，具体涉及其在磷脂分子的富集、纯化和分离的应用。

背景技术

磷脂(Phospholipids,PLs)是一类结构中含有磷酸根的脂类，大多数为磷酸(phosphoric acid,H

研究发现，磷脂在体内有多种生物功能：(i)作为一种两性化合物，磷脂分子是构成细胞膜的主要化合物，同时起到保持细胞完整性的作用。(ii)磷脂分子的sn-1和sn-2的脂肪酸链可以为体内各种炎症反应过程需要的类二十烷酸(类花生酸)的生物合成提供多种不饱和脂肪酸。(iii)卵磷脂是体内胆碱的重要来源，而且在同型半胱氨酸新陈代谢及血管疾病中扮演重要的角色。(iv)人脑能直接从血液中摄取卵磷脂及胆碱，并很快转化为乙酰胆碱，有助于提高学习能力和记忆力。(v)磷脂，尤其是卵磷脂，具有抗氧化的作用，可以清除血液中的过氧化物，有利于减少脂肪在血管内壁的滞留时间，消散粥样硬化斑块，对防治高血脂和高胆固醇有显著的功效。(vi)心磷脂在线粒体膜中大量存在，与线粒体相关生理功能及疾病息息相关；有研究发现，哺乳动物心脏中的卵磷脂的生物合成及再生与BarthSyndrome有着密切的关联。(vii)细胞膜磷脂具有分布不对称性，细胞凋亡初期，内膜上的磷脂酰丝氨酸会发生外翻现象。在正常生理和某些病理情况下，正常血细胞可以发生凋亡或者被活化，白介素-1β转化酶活性下调以及细胞膜跨膜电位降低等机制使PS由细胞膜内侧翻转到细胞膜外侧，从而使血细胞膜表面具有PS表达。(viii)细胞膜内膜含有大量的负电荷磷脂，主要为磷脂酰丝氨酸，被证明在凝血过程中也起到重要的作用。体外实验显示，当PS被阻断后，凝血过程受到明显抑制；而当凝血体系中加入PS，则无论是内源性、外源性凝血因子X还是凝血酶原的激活，凝血过程都会被大大加强。(ix)(神经)鞘磷脂与卵磷脂并存于细胞膜外侧，研究发现它们及相关代谢产物参与了细胞生长、分化及细胞凋亡过程。(x)细胞膜上的磷脂酰肌醇及其水解产物，有助于将胞外信号转换为胞内信号，参与信号传导过程。除上述生理活性外，磷脂还被证实与肺功能等有关。因此，血液与组织中磷脂的含量及结构变化，对于病理研究、疾病防治及疾病标记物筛选方面具有非常重要的研究价值。近年来，血清疾病代谢组学的研究发现，代谢异常的磷脂类化合物可以作为多种疾病监测的潜在标记物，为早期诊断及预后治疗等提供了简单有效的技术依据。

目前，生物样品中富集磷脂的萃取方法主要分为两大类：液液萃取(liquid-liquid extraction,LLE)和固相萃取方法(solidphase extraction,SPE)。LLE方法处理的样品往往比较干净，不会或者很少引入外界杂质，但是这些方法往往处理过程比较复杂，且需要控制富集溶液的pH以得到较好的萃取效果；此外，LLE萃取方法需要的样本量大，容易造成较大的损失。而SPE方法需要的样品量较小，有效提高了样品利用率；由于SPE方法往往针对于某一类或者几类化合物进行特异性萃取，得到的产物的纯度较高。当前一些用于选择性富集磷酸肽的方法如金属离子亲和色谱的特异性较低，在富集磷酸肽的同时往往会富集到一些非磷酸肽，因此此类方法在用于磷脂富集时的特异性也较低。而通过以磷酸基团为配合基团的固定金属离子亲和色谱，可以高特异性吸附磷酸肽，有效降低了非磷酸化肽段的非特异性吸附，将其用于磷脂富集，可获得较高的特异性。

聚乙烯亚胺(Polyethylenimine,PEI)是一种水溶性高分子阳离子聚合物，分为线性和分枝状两种，其中分枝状聚乙烯亚胺富含伯胺、仲胺和叔胺基，具有较高的反应活力，易于进行化学修饰，例如能够很容易地与环氧基、醛基、异氰酸酯化合物和酸性气体反应。钛和锆等金属离子与磷脂之间的Lewis酸碱作用实现对磷脂类化合物的特异性吸附，这种特殊的性质使得钛和锆等金属离子被广泛应用于磷脂的富集分离。这种制备方法原理明确、操作简单、反应效率高且原材料易得，为磷酸基团或者磷酸酯化金属离子修饰的材料提供了一种可行有效的制备方法。同时，由于聚乙烯亚胺分子中富含氨基活泼氢，因此，利用该方法制备的材料表面磷酸酯钛/锆含量较高，有望能够大大提高磷酸化肽或磷脂的萃取及富集效率。

因此，将聚乙烯亚胺修饰在比表面积较大的二氧化硅基质表面，并利用其表面高密度且反应活泼的氨基结合磷酸基团并利用磷酸基团螯合钛/锆离子，为磷脂化合物的高效选择性富集、纯化和分离提供了一种新的技术思路。

发明内容

本发明的目的在于提供一种便于操作、特异性高，能对磷脂化合物进行高效分离富集纯化的表面修饰磷酸钛/锆基团的聚乙烯亚胺-二氧化硅微球(表面修饰高密度磷酸钛或磷酸锆的二氧化硅微球材料)，并提供所述表面修饰磷酸钛/锆基团的聚乙烯亚胺-二氧化硅微球的制备方法及其应用。

为了达成上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种表面修饰磷酸钛/锆基团的聚乙烯亚胺-二氧化硅微球，所述微球以全多孔二氧化硅微球为基体，表面键合聚乙烯亚胺分子，再经过磷酸功能化并利用磷酸基团与钛离子(或锆离子)之间的强烈螯合作用，将钛离子或者锆离子吸附在表面富含磷酸基团的聚乙烯亚胺-二氧化硅微球表面后制备得到表面修饰磷酸钛/锆基团的聚乙烯亚胺-二氧化硅微球。

其中，所述二氧化硅微球选用不同粒径、不同孔径的二氧化硅微球。

所述二氧化硅微球的粒径范围为10-100μm；优选地，为20或40μm。

所述二氧化硅微球的孔径范围为0-50nm；优选地，为12nm。

所述二氧化硅微球的形状为球形。

进一步地，所述二氧化硅微球为表面经环氧丙基功能化的二氧化硅微球；或，含有其他活性基团的二氧化硅微球。

其中，所述聚乙烯亚胺为具有不同分子量和聚合度的分枝状聚乙烯亚胺。

所述聚乙烯亚胺的分子量为10kDa-100kDa；优选地，为10kDa或70kDa。

其中，所述磷酸钛/锆基团为聚乙烯亚胺-二氧化硅微球经亚磷酸功能化后的磷酸基团与钛离子(或锆离子)之间的强烈螯合作用形成的；或，其他活性功能基团衍生化的磷酸钛/锆基团。

本发明还提供了一种表面修饰磷酸钛/锆基团的聚乙烯亚胺-二氧化硅微球的制备方法，首先对二氧化硅微球表面修饰环氧丙基或者其他活性官能基团，然后利用环氧丙基的开环反应或者其他反应机理键合不同分子量的分枝状聚乙烯亚胺分子，使其表面富含伯胺、仲胺及叔胺等活性功能基团，然后利用氨基的高反应活性，对其进行磷酸基团修饰并利用磷酸基团螯合钛/锆离子，从而最终制备得到表面修饰磷酸钛/锆基团的聚乙烯亚胺-二氧化硅微球。

具体地，所述方法步骤如下：

(1)二氧化硅微球表面修饰聚乙烯亚胺：将活化后的二氧化硅微球进行环氧丙基或者其他活性功能基团的修饰，然后将表面修饰环氧丙基或者其他活性功能基团的二氧化硅微球分散在聚乙烯亚胺溶液中，搅拌反应，即得到聚乙烯亚胺修饰的二氧化硅微球；

(2)聚乙烯亚胺修饰的二氧化硅微球的磷酸功能化修饰：向步骤(1)得到的聚乙烯亚胺修饰的二氧化硅微球中加入浓盐酸和亚磷酸溶液，搅拌反应后加入甲醛溶液，然后继续回流反应，即得到磷酸功能化的聚乙烯亚胺修饰的二氧化硅微球；

(3)对磷酸功能化的聚乙烯亚胺修饰的二氧化硅微球修饰钛/锆离子：将步骤(2)得到的磷酸功能化的聚乙烯亚胺修饰的二氧化硅微球超声分散在含钛/锆离子的水溶液中，搅拌反应，即得到表面修饰磷酸钛/锆基团的聚乙烯亚胺-二氧化硅微球。

步骤(1)中，所述的二氧化硅微球的活化步骤为：将二氧化硅微球在盐酸溶液中超声分散后，进行冷凝回流反应；反应后抽滤、洗涤、干燥，即得到活化后的二氧化硅微球。

其中，所述二氧化硅微球为不同粒径、不同孔径、不同性状的二氧化硅微球。

所述二氧化硅微球的粒径范围为10-100μm；优选地，为20或40μm。

所述二氧化硅微球的孔径范围为0-50nm；优选地，为12nm。

所述二氧化硅微球的形状为球形。

其中，所述盐酸溶液的浓度为12-36wt％；优选地，为12wt％。

其中，所述超声分散的时间为1-5min；优选地，为2min。

其中，所述超声分散的频率为10-100kHz；优选地，为40kHz。

其中，所述反应的温度为90-110℃；优选地，为102℃。

其中，所述反应的时间为12-24h；优选地，为24h。

其中，所述干燥的温度为40-80℃；优选地，为60℃。

步骤(1)中，所述的二氧化硅微球表面修饰活性功能基团步骤为：对活化后的二氧化硅微球进行干燥除水，后在除水甲苯中超声分散；然后加入环氧丙基或其他活性功能基团，进行回流反应；反应结束后抽滤、洗涤、干燥，即得表面修饰活性功能基团的二氧化硅微球。

其中，所述干燥除水的温度为60-120℃；优选地，为110℃。

其中，所述干燥除水的时间为6-12h；优选地，为6h。

其中，所述超声分散的时间为1-5min；优选地，为2min。

其中，所述超声分散的频率为10-100kHz；优选地，为40kHz。

其中，所述活化后的二氧化硅微球与环氧丙基或其他活性功能基团的质量/体积比为1g：1ml-1g：5ml；优选地，为1g：3ml。

其中，所述反应的温度为100-120℃；优选地，为115℃。

其中，所述反应的时间为12-24h；优选地，为24h。

其中，所述干燥的温度为40-80℃；优选地，为45-80℃；进一步优选地，为45℃。

所述步骤(1)中，所述聚乙烯亚胺为具有不同分子量和聚合度的分枝状聚乙烯亚胺。

所述聚乙烯亚胺的分子量为10kDa-100kDa；优选地，为10kDa或70kDa。

所述步骤(1)中，所述聚乙烯亚胺溶液的浓度为5-10mg/ml；优选地，为8.75mg/ml。

所述步骤(1)中，所述表面修饰环氧丙基或者其他活性功能基团的二氧化硅微球在聚乙烯亚胺溶液中的含量为1g/10ml-1g/100ml；优选地，为1g/40ml。

所述步骤(1)中，所述反应的温度为60-80℃；优选地，为65℃。

所述步骤(1)中，所述反应的时间为12-24h；优选地，为12h。

所述步骤(2)前还包括将聚乙烯亚胺修饰的二氧化硅微球用超纯水超声分散的步骤。

其中，所述超声分散的时间为10-100kHz；优选地，为40kHz。

其中，所述超声分散的频率为1-5min；优选地，为2min。

所述步骤(2)中，所述浓盐酸的浓度为12-36wt％；优选地，为36wt％。

所述步骤(2)中，所述聚乙烯亚胺修饰的二氧化硅微球、浓盐酸、亚磷酸溶液的用量比为1g：10ml：1ml-1g：50ml：5ml；优选地，为1g：30ml：4ml。

所述步骤(2)中，所述亚磷酸溶液的浓度为20-80wt％；优选地，为50wt％。

所述步骤(2)中，所述反应的温度为100-110℃；优选地，为105℃。

所述步骤(2)中，所述反应的时间为5-20min；优选地，为10min。

所述步骤(2)中，所述加入甲醛溶液的量为1-5ml；优选地，为2.5ml。

所述步骤(2)中，所述回流反应的温度为100-120℃；优选地，为105℃。

所述步骤(2)中，所述回流反应的时间为1-2h；优选地，为1.5h。

所述步骤(3)中，所述超声分散的时间为1-5min；优选地，为2min。

所述步骤(3)中，所述超声分散的频率为10-100kHz；优选地，为40kHz。

所述步骤(3)中，所述含钛/锆离子的水溶液的浓度为50-200mM；优选地，为100mM。

所述步骤(3)中，所述含钛/锆离子的水溶液具体指硫酸钛、ZrOCl

所述步骤(3)中，所述磷酸功能化的聚乙烯亚胺修饰的二氧化硅微球在含钛/锆离子的水溶液中的含量为1g/10ml-1g/100ml；优选地，为1g/60ml。

所述步骤(3)中，所述反应的温度为30-40℃；优选地，为30℃。

所述步骤(3)中，所述反应的时间为2-3h；优选地，为2h。

在一个具体实施方式中，所述方法具体包括如下步骤：

(1)二氧化硅微球活化：将二氧化硅微球在盐酸溶液中超声分散后，在油浴锅中恒温冷凝回流反应；反应后抽滤，用超纯水和无水乙醇洗涤，产物置于真空干燥箱中干燥，即得到活化后的二氧化硅微球；

(2)二氧化硅微球表面修饰活性功能基团：对活化后的二氧化硅微球进行干燥除水，后在除水甲苯中超声分散；在磁力搅拌条件下加入环氧丙基或其他活性功能基团，恒温油浴条件下回流反应；反应结束后冷却至室温抽滤，用甲苯、丙酮及无水乙醚洗涤，产物置于烘箱中干燥；

(3)二氧化硅微球表面修饰聚乙烯亚胺：将表面修饰环氧丙基和/或其他活性功能基团的二氧化硅微球在乙醇溶液中超声分散，加入聚乙烯亚胺溶液，超声后在60-80℃恒温且氮气保护条件下搅拌反应12-24h；反应结束后冷却至室温，离心；将离心固体用超纯水分散后抽滤，并用超纯水、乙醇、无水乙醚洗涤，产物置于烘箱中干燥，即得到聚乙烯亚胺修饰的二氧化硅微球；

(4)聚乙烯亚胺修饰的二氧化硅微球的磷酸功能化修饰：将步骤(3)得到的聚乙烯亚胺修饰的二氧化硅微球用超纯水超声分散；加入浓盐酸和亚磷酸溶液，100-110℃恒温且氮气保护条件下搅拌反应5-20min后加入1-5ml甲醛溶液，然后继续反应1-2h即得到磷酸功能化的聚乙烯亚胺修饰的二氧化硅微球；

(5)对磷酸功能化的聚乙烯亚胺修饰的二氧化硅微球修饰钛/锆离子：将步骤(4)得到的磷酸功能化的聚乙烯亚胺修饰的二氧化硅微球超声分散在含钛/锆离子的水溶液中，30-40℃恒温且氮气保护条件下搅拌2-3h反应，反应结束后用超纯水和无水乙醇洗涤，即得到表面修饰磷酸钛/锆基团的聚乙烯亚胺-二氧化硅微球。

本发明还提供了由上述方法制备得到的表面修饰磷酸钛/锆基团的聚乙烯亚胺-二氧化硅微球。

本发明还提供了上述表面修饰磷酸钛/锆基团的聚乙烯亚胺-二氧化硅微球在富含磷脂分子中的富集、纯化和分离中的应用。

本发明还提供了上述表面修饰磷酸钛/锆基团的聚乙烯亚胺-二氧化硅微球在磷脂标准品溶液的固相萃取中的应用。

本发明还提供了上述表面修饰磷酸钛/锆基团的聚乙烯亚胺-二氧化硅微球在血清中的固相萃取中的应用。

本发明的有益效果包括：本发明的合成方法简单有效，制得的材料表面含有高密度的磷酸酯钛/锆，能够选择性吸附磷脂分子。利用该表面修饰磷酸钛/锆基团的聚乙烯亚胺-二氧化硅微球作为磷脂化合物的富集分离材料，实现对血清中轮廓磷脂的有效萃取，有望应用于疾病代谢组学中磷脂类化合物的高效富集纯化。

附图说明

图1为磷酸酯锆修饰的聚乙烯亚胺-二氧化硅微球的制备流程图示。

图2为磷脂标准品溶液①经过20μm SiO

图3为磷酸酯锆(钛)修饰的聚乙烯亚胺-二氧化硅微球的红外表征谱图。

图4为HPLC-ELSD检测时五种磷脂分子的标准曲线(A为峰面积，C为对应磷脂的浓度(μg/mL))。

图5为四种固相萃取柱对五种不同磷脂的固相萃取回收率。

图6为四种固相萃取柱在两种溶剂体系下对蛋白沉淀后血清中磷脂的富集检测情况。Sample 1-40μm SiO

图7为血清中磷脂固相萃取前后经UPLC-QqQ MS分离检测后提取离子对(Q1/Q3,774.7/184.1)得到的36:1PC-O色谱图。

图8为血清中磷脂固相萃取前后经UPLC-QqQ MS分离检测后提取离子对(Q1/Q3,544.4/184.1)得到的20:4Lyso PC色谱图。

图9为血清中磷脂固相萃取前后经UPLC-QqQ MS分离检测后提取离子对(Q1/Q3,794.7/653.7)得到的40:5PE色谱图。

图10为血清中磷脂固相萃取前后经UPLC-QqQ MS分离检测后提取离子对(Q1/Q3,500.5/359.5)得到的20:5Lyso PE色谱图。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

实施例1：20μm SiO

全多孔20μm-SiO

全多孔20μm-SiO

20μm-SiO

20μm-SiO

所述20μm SiO

20μm SiO

实施例2：20μm SiO

为了初步验证该方法制备的磷酸酯(IV)价金属离子基团修饰的聚乙烯亚胺-二氧化硅微球在磷脂萃取中的可行性，本发明首先将制备的20μm SiO

磷脂标准品溶液①配制：称取磷脂标准品适量溶于甲醇溶液，配制成为含0.71mMPC(16:0/18:1)、0.50mM 15:0PC、0.18mM PE(16:0/18:1)、0.63mM 16:0Lyso PC、0.80mM14:0PC及0.89mM 18:0Lyso PC的磷脂标准品混合溶液①。

20μm SiO

磷脂标准品溶液①的固相萃取过程：(1)预处理：依次加入1mL×2氨-甲醇溶液(0.1M)、1mL×2正己烷:异丙醇溶液(20:80，v/v)及0.5mL×2正己烷:异丙醇:三氟乙酸溶液(20:80:0.5，v/v)溶液，对上述20μm SiO

HPLC-ELSD检测条件：Kromasil C8色谱柱(5μm，250×4.6mm)；进样量：10μL；流动相A：含10mM乙酸铵的甲醇-水溶液(80:20,v/v)，流动相B：含10mM乙酸铵的甲醇溶液；梯度条件为：0-3min，50％B/3-18min，50-100％B/18-22min，100％B；ELSD蒸发管温度为45℃；雾化气体为空气；气体流速为2.5L/min。

由图2结果可见，在上样及淋洗后的流出液中均没有检测到PC、Lyso PC及PE三种类型的磷脂，而在洗脱后的流出液中则检测到了萃取前的6种磷脂标准品。该结果表明，该方法制备的磷酸酯(IV)价金属离子(钛或锆)基团修饰的聚乙烯亚胺-二氧化硅微球对磷脂分子具有特异的选择吸附能力，而且能够实现迅速洗脱。

实施例3：40μm SiO

全多孔40μm-SiO

全多孔40μm-SiO

40μm-SiO

40μm-SiO

所述40μm SiO

40μm SiO

40μm SiO

40μm SiO2@PEI

本发明对磷酸酯锆(钛)修饰的聚乙烯亚胺-二氧化硅微球及其制备过程中中间产物进行了红外色谱表征，结果见图3。结果显示，由于磷酸酯键的特征峰与Si-O伸缩振动特征峰区域(1000-1200cm

实施例4：四种固相萃取柱的制备

1)40μm SiO

2)40μm SiO

3)40μm SiO

4)40μm SiO

实施例5：40μm SiO

磷脂标准品溶液②配制：称取磷脂标准品适量溶于甲醇溶液，配制成为含2.20mg/mL 14:0卵磷脂(PC)、1.62mg/mL 16:0溶血卵磷脂(LPC)、0.21mg/mL 16:0脑磷脂(PE)、0.8mg/mL磷脂酰甘油(PG)(16:0/18:1)及1.07mg/mL 18:0溶血脑磷脂(LPE)的磷脂标准品混合溶液②。

标准曲线设置：将磷脂标准品溶液②依次用甲醇稀释成1倍、2倍、4倍、8倍、16倍溶液，然后各取10μL进样，用HPLC-ELSD检测，作峰面积对数与浓度对数的标准曲线。

磷脂标准品溶液②的固相萃取过程：(1)预处理：依次加入1mL×2氨-甲醇溶液(0.1M)、1mL×2正己烷:异丙醇溶液(20:80，v/v)及0.5mL×2正己烷:异丙醇:三氟乙酸溶液(20:80:0.5，v/v)溶液，对上述四种磷酸酯钛(锆)基团修饰的40μm SiO

HPLC-ELSD检测条件：Kromasil C8色谱柱(5μm，250×4.6mm)；进样量：10μL；流动相A：含10mM乙酸铵的甲醇-水溶液(80:20,v/v)，流动相B：含10mM乙酸铵的甲醇溶液；梯度条件为：0-3min，50％B/3-18min，50-100％B/18-22min，100％B；流速为0.4ml/min；柱温为55℃；ELSD蒸发管温度为35℃；雾化气体为空气；气体流速为2.5L/min。

大多数磷脂结构中不存在发色基团，或者紫外吸收波长较小且灵敏度低，因此，本发明利用通用型HPLC-ELSD分离检测系统对一系列不同浓度的磷脂标准品混合溶液进行了测定，并对色谱峰面积和磷脂浓度作双对数曲线，得到五种标准磷脂分子的线性回归标准曲线，见图4。可见，五种磷脂标准品均能得到良好的标准曲线，可以应用于固相萃取后磷脂回收率的测定。

根据下面公式计算四种不同类型的固相萃取柱对五种不同磷脂标准品的萃取回收率，结果见图5。

其中，Recovery为不同磷脂标准品的固相萃取回收率，C

从图5的HPLC-ELSD可以看出，不同类型的固相萃取柱对不同类型磷脂的回收率也不同：40μm SiO

实施例6：血清中的固相萃取及测定

血清样本预处理-蛋白沉淀：将正常人血清样本从-80℃冰箱中取出，缓慢升温融化后，取20μL加入180μL在4℃冰箱提前预冷的含1wt％甲酸的甲醇:乙腈(1:1)溶液，涡旋2min，置于4℃冰箱静置10min，然后低温高速离心(4℃，12000rpm，10min)，取上清，即得到蛋白沉淀后的血清。

蛋白沉淀后血清的磷脂萃取过程：1)预处理：依次加入1mL×2氨-甲醇溶液(0.1M)、1mL×2正己烷:异丙醇溶液(20:80，v/v)(或1mL×2乙腈)及0.5mL×2正己烷:异丙醇:三氟乙酸溶液(20:80:0.5，v/v)(或0.5mL×2含0.5％三氟乙酸的乙腈)溶液，对上述四种磷酸酯钛(锆)基团修饰的40μm SiO

UPLC条件：Waters ACQUITY UPLC BEH ShieldRP18色谱柱(1.7μm，2.1×100mm)；流动相A：含20mM的甲醇-水溶液(5:95，v/v)，流动相B：甲醇，梯度条件参见表1；流速：0.4mL/min；柱温：55℃。

表1 UPLC梯度洗脱条件

质谱条件：帘气为15.0psi；雾化气为15.0psi；辅助气为10.0psi；离子源电压为4500V；离子源温度为500℃。

四种不同类型的磷酸酯钛(锆)固相萃取柱在两种溶液体系(正己烷-异丙醇体系、乙腈体系)下对经过蛋白沉淀处理的血清进行了磷脂萃取，洗脱液复溶后进行UPLC-QqQ MS检测，利用多反应监测(multiple reaction monitoring，MRM)技术对血清中上百多种磷脂进行了测定，见图6。该结果显示，四种类型固相萃取柱在两种溶剂体系条件下均能实现对血清中磷脂的选择性萃取。图7、图8、图9和图10分别为提取离子对(Q1/Q3,774.7/184.1)、(Q1/Q3,544.4/184.1)、(Q1/Q3,794.7/653.7)和(Q1/Q3,500.5/359.5)后的36:1PC-O、20:4Lyso PC、40:5PE及20:5Lyso PE的色谱图。

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离本发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。