一株贝莱斯芽孢杆菌及其在防治黄瓜细菌性角斑病中的应用

摘要

本发明公开了一株贝莱斯芽孢杆菌及其在防治黄瓜细菌性角斑病中的应用。本发明提供了贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ZF145，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.20325。本发明所提供的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ZF145，其对黄瓜细菌性角斑病的盆栽防治效果可达71.10％，另外ZF145对多种植物病原细菌和多种病原真菌均具有拮抗作用。本发明为防治黄瓜细菌性角斑病提供了一株优良的生防菌株，并对黄瓜病害的绿色防控技术和促进黄瓜产业可持续发展具有重大的生产意义。

说明书

技术领域

本发明涉及植物病害生物防治技术领域，特别涉及一株贝莱斯芽孢杆菌及其在防治黄瓜细菌性角斑病中的应用。

背景技术

黄瓜细菌性角斑病是由扁桃假单胞流泪致病变种(Pseudomonas amygdaliPV.Lachrymans)侵染引起的一种细菌性病害，该病在苗期和成株期均可发生，苗期以子叶危害为主，成株期以叶片、叶柄以及卷须危害为主，发生严重时还可造成茎蔓和果实的危害，严重影响黄瓜产量。黄瓜细菌性角斑病菌主要在种子内存活或随病残体残留在土壤中存活，也可从伤口或气孔侵入对黄瓜造成危害。目前，黄瓜细菌性角斑病的防治主要依靠化学药剂，但是大量化学农药的滥用、长期使用单一药剂等均造成抗药性增强。因此，有针对性地筛选黄瓜细菌性角斑病菌拮抗菌株，开发可以替代用化学药剂防治黄瓜细菌性角斑病的微生物杀菌剂是蔬菜病害生物防治研究的重要方面。

芽孢杆菌在生物防治领域有着巨大的开发潜力，具有强大的繁殖能力、对营养要求不高、在各种复杂的环境下都能够生存、生防菌剂高效稳定方便以及对环境友好等优点。已经报道的能防治植物病害的芽孢杆菌主要有枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)、侧孢芽孢杆菌(Bacilluslaterosporus)和短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)等。但目前登记用于防治黄瓜细菌性角斑病的生物药剂中，尚未见贝莱斯芽孢杆菌的相关报道。

发明内容

为改进现有防治技术的不足，本发明的目的在于提供一株贝莱斯芽孢杆菌及其在防治黄瓜细菌性角斑病中的应用，同时对多种病原细菌和病原真菌均具有较强的拮抗效果。

第一方面，本发明要求保护一株贝莱斯芽孢杆菌。

本发明所要求保护的贝莱斯芽孢杆菌具体为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)ZF145，其于2020年7月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.20325。

第二方面，本发明要求保护的贝莱斯芽孢杆菌是一种微生物制剂。

本发明所要求保护的微生物制剂含有所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)ZF145。

进一步地，所述微生物制剂可由所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ZF145和助剂或者基质配制而成。当所述微生物制剂为液体形式时，所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ZF145的有效含量可为1.0×10

第三方面，本发明要求保护一种菌悬液。

本发明所要求保护的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ZF145菌悬液的含量为1.0×10

进一步地，所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ZF145的含量为1×10

第四方面，本发明要求保护所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ZF145或所述微生物制剂或所述菌悬液在如下任一中的应用：

(A1)防治黄瓜细菌性角斑病；

(A2)制备用于防治黄瓜细菌性角斑病的产品。

第五方面，本发明要求保护所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ZF145或所述微生物制剂或所述菌悬液在如下任一中的应用：

(C1)抑制植物病原菌；

(C2)制备用于抑制植物病原菌的产品；

(C3)防治由植物病原菌所致病害；

(C4)制备用于防治由植物病原菌所致病害的产品。

进一步地，所述植物病原菌可为植物病原细菌和/或植物病原真菌。

更进一步地，所述植物病原细菌可为扁桃假单胞流泪致病变种(Pseudomonasamygdali PV.Lachrymans)、胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovorumsubsp.Brasiliense)、丁香假单胞番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.Tomato)、密执安棒杆菌马铃薯环腐致病变种(Clavi-bacter michiganense subsp.Sepedonicus)、野油菜黄单胞野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.Campestris)和/或西瓜嗜酸菌(Acidovorax citrulli)。

更进一步地，所述植物病原真菌可为番茄匍柄霉病(Stemphylium lycopersici(Enjoji)Yamamoto)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、壳二孢(Mycosphaerella melonis)、尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)、茄链格孢(Alternaria solani)、炭疽菌(Colletotrichum sp.)、辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)和/或多主棒孢菌(Corynesporacassiicola)。

第六方面，本发明要求保护一种防治黄瓜细菌性角斑病的方法。

本发明要求保护的防治黄瓜细菌性角斑病的方法，可包括如下步骤：将所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ZF145或所述微生物制剂或所述菌悬液直接喷施于黄瓜植株上。

在所述方法中，喷施于黄瓜植株(如长至两叶一心时的黄瓜植株)上的用量为5mL/株，每mL是指含量为1×10

第七方面，本发明要求保护所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ZF145在制备所述微生物制剂或所述菌悬液中的应用。

实验证明，本发明所提供的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ZF145，其对黄瓜细菌性角斑病的盆栽防治效果可达71.10％，另外ZF145具有较为广谱的抑菌能力，包括实施例部分涉及的多种病原细菌和多种病原真菌。本发明为防治黄瓜细菌性角斑病提供了一株优良的生防菌株，并对黄瓜病害的绿色防控技术和促进黄瓜产业可持续发展具有重大的生产意义。

保藏说明

菌株名称：贝莱斯芽孢杆菌

拉丁名：Bacillus velezensis

参椐的生物材料(株)：ZF145

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2020年7月8日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.20325

附图说明

图1为双层培养法抑制效果示意图。A：ZF68；B：ZF73；C：ZF74；D：ZF76；E：ZF72；F：ZF77；G：ZF79；H：ZF145。

图2为贝莱斯芽孢杆菌ZF145在LB培养基的菌落形态。

图3为菌株ZF145基于多基因序列构建系统发育树。

图4为菌株ZF145抑菌谱测定。A为胡萝卜软腐果胶杆菌Pectobacteriumcarotovorum subsp.Brasiliense；B为丁香假单胞番茄致病变种Pseudomonas syringae pv.Tomato；C为西瓜嗜酸菌Acidovorax citrulli；D为密执安棒杆菌马铃薯环腐致病变种Clavi-bacter michiganense subsp.Sepedonicus；E为野油菜黄单胞野油菜致病变种Xanthomonas campestris pv.Campestris；F为番茄匍柄霉病Stemphylium lycopersici(Enjoji)Yamamoto；G为灰葡萄孢Botrytis cinerea；H为壳二孢Mycosphaerella melonis；I为尖孢镰孢菌Fusarium oxysporum；J为茄链格孢Alternariasolani；K为炭疽菌Colletotrichum sp.；L为辣椒疫霉菌Phytophthora capsici；M为多主棒孢菌Corynesporacassiicola。

图5为菌株ZF145对黄瓜细菌性角斑病的防治效果。A为菌株ZF145；B为清水对照。

图6为13种生物农药对黄瓜细菌性角斑病的防治效果。A为多粘类芽孢杆菌(顾地丰)；B为多粘类芽孢杆菌(盛润)；C为蜡质芽孢杆菌(泰诺)；D为解淀粉芽孢杆菌(绿都)；E为荧光假单胞杆菌(泰诺)；F为坚强芽孢杆菌(顺泉)；G为地衣芽孢杆菌(广仁)；H为地衣芽孢杆菌(中保)；I为枯草芽孢杆菌(科诺)；J为枯草芽孢杆菌(鲁抗)；K为枯草芽孢杆菌(拜沃)；L为枯草芽孢杆菌(康欣)；M为枯草芽孢杆菌(德强)；N为贝莱斯芽孢杆菌ZF145(中国农业科学院蔬菜花卉研究所)；O为清水对照

图7为22种化学农药对黄瓜细菌性角斑病的防治效果。A为3％中生菌素(凯立生物)；B为12％中生菌素(凯立生物)；C为5％中生菌素(凯立生物)；D为46％氢氧化铜水分散粒剂(杜邦农化)；E为77％氢氧化铜(志信农化)；F为45％精甲王铜(禾本科技)；G为30％琥胶肥酸铜(四友化工)；H为1.6％噻霉铜微乳剂(西大华特)；I为23％松酯酸铜(山东禾宜)；J为10％多抗霉素(德州祥龙)；K为4％春雷霉素(乳山韩威)；L为2％春雷霉素(日本东兴)；M为4％春雷中生(凯立生物)；N为33％春雷喹啉铜(山东一览科技)；O为30％噻唑锌悬浮剂(新农化工)；P为1.8％辛菌胺醋酸盐(西安近代科技实业有限公司)；Q为80％乙蒜素(开封大地农化)；R为0.3％四霉素(微科生物)；S为3％甲霜噁霉灵(绿亨化工)；T为50％氯溴异氰尿酸(南农农药)；U为0.3％四霉素+30％壬菌铜(侨昌)；V为格瑞微粉5号(格瑞蓝达)；W为贝莱斯芽孢杆菌ZF145(中国农业科学院蔬菜花卉研究所)；X为清水对照。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所涉及的培养基：

LB培养基：胰蛋白胨10g、氯化钠10g、酵母提取物5g、琼脂20g，1L蒸馏水，用于拮抗菌株的分离和培养；

NA培养基：牛肉膏3g、蛋白胨5g、琼脂粉15g，加水至1000mL，用于病原细菌的培养及拮抗试验；

PDA培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂粉15g，加水至1000mL，用于病原真菌的培养及拮抗试验。

下述实施例中所用到的黄瓜细菌性角斑病菌均为扁桃假单胞流泪致病变种(Pseudomonas amygdali PV.Lachrymans)。

实施例1、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ZF145的分离纯化和鉴定

一、拮抗细菌的分离及纯化

先从山东寿光、北京通州、昌平地区采集的黄瓜根际土壤样品中称取10g土样放入装有90mL无菌水的三角瓶中，置于28℃、180r/min的摇床上震荡30min，使土壤样品充分悬浮后取出，再放在80℃的水浴锅中处理10min，以杀灭杂菌，然后将土壤样品梯度稀释至10

二、黄瓜细菌性角斑病拮抗细菌的筛选

采用双层培养法筛选出抑制效果较高的拮抗细菌。首先将活化好的待测拮抗细菌和病原菌用无菌接种针挑取单菌落转接到LB/NB培养基中，置于28℃、180r/min摇床上振荡培养24h，制成1×10

三、拮抗细菌ZF145的鉴定

1、菌株ZF145形态观察和生理特性测定

采用三线法用灭菌牙签挑取活化好的单菌落形态在LB固体平板培养基上进行划线，置于28℃培养箱中培养24h后取出观察其菌落的颜色、形态和大小。依据《伯杰细菌鉴定手册》第八版及《常见细菌系统鉴定手册》，28℃培养24～48h后，对生理生化特征进行鉴定。

2、Biolog测定

挑取菌株ZF145单菌落接种至LB培养基试管斜面上，28℃培养24h。由中国农业微生物菌种保藏中心使用BIOLOG GENⅢ试剂盒(按照试剂盒说明书操作)对菌株ZF145进行唯一碳源利用的测定。

3、多基因扩增及序列分析

采用细菌基因组DNA提取试剂盒(试剂盒购北京自天根生化科技有限公司)提取菌株ZF145的总DNA，采用细菌通用引物27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)/1492R(ACGGCTACCTTGTTACGACTT)和针对目标基因设计引物gyrB-F(GCAGCAAAACAGTTATGATGAA)/R(AGTCTTCTCCGATACCTGTGC)、atpD-F(ACAAGTTTGTCTTCCTCGCC)/R(TGAGGTCGCTCTTCATTTAGG)对菌株ZF145进行PCR扩增。反应总体系为50μL，PCR扩增程序设置为：94℃3min，94℃30s，60℃1min，72℃45s，35个循环；72℃10min。扩增产物选用1％琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物直接采用双向测序方法进行测序。测序工作由北京博迈德生物技术有限公司完成。将所测得的菌株ZF145的16S rDNA序列分析上传NCBI，将测得序列在NCBI的Blast数据库中进行比对，比对不同菌株的16S rDNA、atpD、gyrB基因，采用最大似然法构建系统发育树，分析其亲缘关系。

四、结果与分析

1、拮抗细菌的分离筛选

采用平板稀释法，对采集的7份黄瓜根际土壤样品中的拮抗细菌进行分离。最终获得174株拮抗细菌，并对其进行保存、编号。通过双层培养法测定其对黄瓜细菌性角斑病抑制效果，其中ZF145抑菌圈最大，达到5.60cm，其抑制率为62.22％(表1、图1)。

表1、拮抗细菌菌株对黄瓜细菌性角斑病的防效

2、拮抗细菌ZF145的鉴定

菌株ZF145在LB固体培养皿上放入28℃培养2d后菌落为乳白色，边缘不规则，有褶皱(图2)。生理生化测定结果表明菌株ZF145为革兰氏阳性菌，在NaCl含量1％-8％的培养基上均能生长，柠檬酸盐利用、明胶液化为阴性；Biolog检测结果表明(表2)，菌株ZF145可以利用α-D-葡萄糖、氯化锂、亚碲酸钾、1％乳酸钠，但不能利用D-山梨醇、D-甘露醇、丙三醇、L-谷氨酸、D-天冬氨酸、D-丝氨酸。初步鉴定菌株ZF145属于芽孢杆菌属。为进一步明确拮抗菌株ZF145的分类地位及种属，提取ZF145基因组后采用PCR扩增16Sr DNA、gyr B及atp DDNA基因序列并用PCR原液进行测序。然后将测序结果(ZF145的16Sr DNA序列如SEQ IDNo.1所示；gyr B基因如SEQ ID No.2所示；atp D DNA序列如SEQ ID No.3所示)与GenBank中相似性最高的菌株进行系统发育树构建(图3)，结果显示拮抗菌株ZF145与贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)相似性最高为97％，确定ZF145为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)。

表2、ZF145生理生化特征

综合上述形态学、生理生化特性，以及基因组序列测定结果，最终确定本发明的菌株ZF145为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。

菌株ZF145已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。保藏日期2020年7月8日。保藏号为CGMCC No.20325。菌株名称：贝莱斯芽孢杆菌；拉丁名：Bacillusvelezensis；参椐的生物材料(株)：ZF145。

实施例2、菌株ZF145抑菌谱的测定

一、细菌抑菌谱测定

菌株ZF145对病原细菌的抑菌谱试验采取双层培养的方法。

供试病原菌：胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovorumsubsp.Brasiliense)、丁香假单胞番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.Tomato)、密执安棒杆菌马铃薯环腐致病变种(Clavi-bacter michiganense subsp.Sepedonicus)、野油菜黄单胞野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.Campestris)、西瓜嗜酸菌(Acidovorax citrulli)。

以上菌株均由中国农业科学院蔬菜花卉研究所保存。

首先将活化好的待测拮抗细菌和病原菌用无菌接种针挑取单菌落转接到LB/NB培养基中，置于28℃、180r/min摇床上振荡培养24h，制成1×10

二、真菌抑菌谱测定

采用平板对峙法检测菌株ZF145对病原真菌的抑制效果。

供试病原真菌：番茄匍柄霉病(Stemphylium lycopersici(Enjoji)Yamamoto)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、壳二孢(Mycosphaerella melonis)、尖孢镰孢菌(Fusariumoxysporum)、茄链格孢(Alternaria solani)、炭疽菌(Colletotrichum sp.)、辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)、多主棒孢菌(Corynesporacassiicola)。

以上菌株均由中国农业科学院蔬菜花卉研究所保存。

PDA平板中央接种直径5mm的待测病原菌菌饼，28℃培养2d后，在距平板中央3.5cm处接种5μL OD

抑菌率(％)＝(对照菌落直径－处理菌落直径)/对照菌落直径×100。

三、结果与分析

菌株ZF145对所检测的病原细菌中，可以明显抑制胡萝卜软腐果胶杆菌、丁香假单胞番茄致病变种、密执安棒杆菌马铃薯环腐致病变种、野油菜黄单胞野油菜致病变种和西瓜嗜酸菌5种病原细菌的生长，菌株ZF145对病原真菌也有明显的抑制果，可以抑制番茄匍柄霉病、灰葡萄孢、壳二孢、尖孢镰孢菌、茄链格孢、炭疽病菌、多主棒孢菌、辣椒疫霉菌8种病原真菌的生长，表明生防菌株具有较为广谱的抑菌能力(表3和图4)。

表3、菌株ZF145对病原菌的抑菌效果

实施例3、拮抗菌株ZF145对黄瓜细菌性角斑病的防治效果

一、拮抗菌株ZF145对黄瓜细菌性角斑病的盆栽防治效果

将黄瓜细菌性角斑病菌和贝莱斯芽孢杆菌ZF145在NA/LB固体平板上活化。28℃培养箱中进行培养后挑取单菌落转接到NB/LB液体培养基，置于28℃、160r/min摇床上培养36h后制备成1×10

盆栽黄瓜长至两叶一心时，采用喷雾接种法接种1×10

病情指数＝100×∑(各级病叶数×相对级数值)/(调查总叶数×9)

防治效果(％)＝100×(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数。

二、拮抗菌株ZF145与不同生物农药及化学农药的比较

菌株ZF145与不同生物农药及化学农药的比较试验。接菌方法参照步骤一拮抗菌株ZF145对黄瓜细菌性角斑病的盆栽防治效果，各生物农药及化学农药的来源及施用浓度按表4进行。

表4、13种生物农药及22种化学农药的施用浓度

三、结果与分析

1、拮抗菌株ZF145对黄瓜细菌性角斑病的盆栽防治效果

采用喷雾接种法对两叶一心的黄瓜接种黄瓜细菌性角斑病菌4d后，清水对照开始发病，其病情指数21.09，而接种生防菌株ZF145菌悬液后，黄瓜植株病情指数为6.10，其防治效果为71.10％(表5和图5)。结果表明从土壤样品中分离出来的拮抗菌ZF145在温室条件下对黄瓜细菌性角斑病具有良好的防治效果。

表5、菌株ZF145对黄瓜细菌性角斑病的盆栽防治效果

2、拮抗菌株ZF145与不同生物农药及化学农药的比较

采用喷雾接种法检测生防菌株ZF145、不同生物农药及化学农药对黄瓜细菌性角斑病的防治效果，结果显示：贝莱斯芽孢杆菌ZF145对黄瓜细菌性角斑病的防治效果最高，为87.27％。13种生物农药中，康欣生物科技有限公司生产的枯草芽孢杆菌对黄瓜细菌性角斑病防治效果最好，防效为74.61％，其次为广东顾地丰生物科技有限公司生产的多粘类芽孢杆菌和山东鲁抗生物农药有限责任公司生产的枯草芽孢杆菌，防效分别为67.93％、60.90％(表6、图6)。22种化学农药中乳山韩威生物科技有限公司的4％春雷霉素可湿性粉剂对黄瓜细菌性角斑病的防治效果最高，防效为80.94％，其次为福建凯立生物制品有限公司的5％中生菌素可湿性粉剂、南农农药科技发展有限公司的50％氯溴异氰尿酸可湿性粉剂，防效分别为71.72％、70.19％(表7、图7)。

表6、13种生物农药对黄瓜细菌性角斑病的防治效果

表7、22种化学农药对黄瓜细菌性角斑病的防治效果

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

<110> 中国农业科学院蔬菜花卉研究所

<120> 一株贝莱斯芽孢杆菌及其在防治黄瓜细菌性角斑病中的应用

<130> GNCLN210611

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1400

<212> DNA

<213> Bacillus velezensis

<400> 1

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gcttgagatt tccaatctgc cgggcaaact ggcggactgt tcttctaaag atccgagcat 1140

ttccgagctg tatatcgtag agggtgactc tgcgggcgga tcagcgaaac agggacggga 1200

ccgtcatttc caagccattc tgccgctgcg cggtaagatt ctgaacgttg agaaagccag 1260

acttga 1266

<210> 3

<211> 1035

<212> DNA

<213> Bacillus velezensis

<400> 3

ttctcctcgc ctaattcgtc cataccgaga atcgcgataa tatcctgaag ttctttgtaa 60

cgctgaagcg ttgactggac ttcacgcgcc accgcataat gctcttctcc gacaatttcc 120

ggagcaagcg cgcgggaagt ggaagccagc ggatcaaccg cagggtagat acccatttca 180

gttaatttac gctcaaggtt agtcgtcgca tccaagtgag cgaacgttgt cgccggagcc 240

gggtcagtgt agtcatcggc aggcacgtag atcgcctgga tagatgtaac tgaaccaacg 300

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tccttttgag catccgcagg cagcggttca tttaaatcaa ttttatctcc cagtacgtta 900

aatacgcgtc cgagagtcac atcaccgaca ggaacggaaa tcggagcacc tgtatcaact 960

gcttccattc cgcgctgaat tccgtccgta gatgccatgg caattgtacg gactgtatca 1020

tcgcctaaat gaaga 1035