纳米颗粒仿生酶敏感元件的制备方法及其产品和应用

摘要

本发明公开了纳米颗粒仿生酶敏感元件的制备方法及其产品和应用，将二维纳米材料分散于溶剂中，加入含有过渡金属源的乙酸盐在一定温度下水浴一定时间，冷冻干燥去除溶剂；将得到的产物与六元杂环化合物和物质氨基酸研磨成均匀混合物，然后再惰性气氛中热解，冷却得到纳米颗粒仿生酶敏感元件；将制得的敏感元件制成传感器后不仅具有极短的响应时间、极高的反应灵敏度、较低的检测限，还具有优异的选择性；能够在实时检测活细胞释放的超氧阴离子自由基方面有重要的应用前景，该材料性能突出、取材方便，利于商业化应用。

说明书

技术领域

本发明涉及材料技术领域，具体涉及纳米颗粒仿生酶敏感元件的制备方法，还涉及由该方法制得额产品和应用，以及利用纳米颗粒仿生酶敏感元件制得的电化学传感器。

背景技术

超氧阴离子(O

然而，O

由于超氧化物歧化酶(SOD)是O

设计高性能的仿生酶敏感元件是实现O

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供纳米颗粒仿生酶敏感元件的制备方法；本发明的目的之二在于提供由所述方法制得的纳米颗粒仿生酶敏感元件；本发明的目的之三在于提供所述纳米颗粒仿生酶敏感元件在制备检测活细胞释放超氧阴离子自由基电化学传感器中的应用；本发明的目的之四在于提供基于所述的纳米颗粒仿生酶敏感元件的电化学传感器；本发明的目的之五在于提供所述电化学传感器在检测活细胞释放超氧阴离子自由基中的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、纳米颗粒仿生酶敏感元件的制备方法，将二维纳米材料分散于溶剂中，加入含有过渡金属源的乙酸盐在使金属离子与二维纳米材料均匀吸附，冷冻干燥去除溶剂；将得到的产物与六元杂环化合物和物质氨基酸均匀混合成混合物，然后再惰性气氛中热解形成碳结构，冷却得到纳米颗粒仿生酶敏感元件。

本发明中，所述溶剂可以为极性溶剂也可以为非剂型溶剂，优选为去离子水；本发明中冷冻干燥除了可以快速去除溶剂，还利于形成多孔结构，将得到的产物与六元杂环化合物和物质氨基酸均匀混合可以采用研磨或球磨，其他可均匀混合的方式也可。

本发明中，所述二维纳米材料为石墨烯、氧化石墨烯、碳纳米管或碳纳米纤维中的一种或多种；所述含过渡金属源的乙酸盐为含钴、镍、锰、铜或铁源的乙酸盐；所述六元杂环化合物为三聚氰胺、吡啶、吡嗪、嘧啶或哒嗪中的一种或多种；所述生物质氨基酸为丝氨酸、半胱氨基酸或丙氨酸中的一种或多种。

本发明中，二维纳米材料、含过渡金属源的乙酸盐和六元杂环化合物的质量比为400：1：200。

本发明中，均匀吸附优选为在水浴条件下，优选的，在80℃下水浴2小时。

本发明中，所述热解是在900℃下热解2小时。

2、由所述方法制得的纳米颗粒仿生酶敏感元件，所述纳米颗粒仿生酶敏感元件为过渡金属原子通过杂原子掺杂固定于纳米材料缺陷结构处。

3、所述纳米颗粒仿生酶敏感元件在制备检测活细胞释放生物活性分子电化学传感器中的应用。

优选的，所述生物活性分子为超氧阴离子自由基、多巴胺、过氧化氢或一氧化氮。根据不同的金属在不同点位下可检测不同物质。金属金、铁等可以测过氧化氢，锰、铜等可以测多巴胺，铁也可以测一氧化氮；铁、钴、镍、锰、铜等都可以测超氧阴离子。

4、所述的纳米颗粒仿生酶敏感元件的电化学传感器，所述电化学传感器的工作电极表面涂敷有所述的纳米颗粒仿生酶敏感元件。

优选的，所述涂敷为将所述纳米颗粒仿生酶敏感元件以0.5-5mg/mL的配比浓度分散于水中，获得电极修饰溶液，将所述电极修饰溶液涂覆到电极上，干燥后再涂覆粘接剂，再次干燥即可。

5、所述电化学传感器在检测活细胞释放生物活性分子中的应用。

本发明的有益效果在于：纳米颗粒仿生酶敏感元件的制备方法，根据需检测的物质或分子，进行过渡金属原子种类的优化，从而筛选最佳的过渡金属活性中心以获得高灵敏仿生酶材料。以超氧阴离子为例，提供了一种高灵敏纳米颗粒仿生酶敏感元件及其制备方法和应用；本发明在制备纳米颗粒仿生酶敏感元件，通过合理设定二维纳米材料、含过渡金属源的乙酸盐和六元杂环化合物三者的质量，同时合理选择过渡金属的种类，使以最终制备的纳米颗粒仿生酶敏感元件为原料构建的电化学传感器不仅具有极短的响应时间、极高的反应灵敏度、较低的检测限，还具有优异的选择性。其中，纳米碳材料的加入可以提高仿生材料的导电性，提升其整体的电子传递性能，选择合适的过渡金属及控制其负载量，可以很好的增强仿生材料的选择性，利用催化剂对碳纳米材料进行改造能够使其更适于负载更大量均匀的金属纳米颗粒，从而使仿生材料具有更多的检测活性位点。以该纳米颗粒仿生酶材料制备的传感器相比于传统材料制备的传感器，在实时定量检测超氧阴离子自由基时，显示出了更高的性能，能够在实时检测活细胞释放的超氧阴离子自由基方面有重要的应用前景。该材料性能突出、取材方便，利于商业化应用。

本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书来实现和获得。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为实施例1中制备的纳米颗粒仿生酶敏感元件的TEM图；

图2为实施例1中制备的纳米颗粒仿生酶敏感元件的HRTEM图；

图3为实施例1中制备的纳米颗粒仿生酶敏感元件的电子衍射图；

图4为实施例1中制备的纳米颗粒仿生酶敏感元件的接触角表征图；

图5为实施例2中制备的超氧化物歧化酶仿生材料的TEM图；

图6为实施例2中制备的超氧化物歧化酶仿生材料的HRTEM图；

图7为实施例3中制备的超氧化物歧化酶仿生材料的SEM图；

图8为在电压范围为0.3-1.0V下，实施例1中构建的传感器对O

图9为在电压范围为0.3-1.0V下，实施例2中构建的传感器对O

图10为在电压范围为-0.2-0.8V下，实施例3中构建的传感器对O

图11为实施例1中构建的传感器对O

图12为实施例1中构建的传感器对O

图13为实施例1中构建的传感器对O

图14为实施例1中构建的传感器对不同干扰成分选择性测试结果图；

图15为实施例1中构建的传感器实时检测DU145细胞在酵母多糖(Zym)刺激下释放的O

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1

纳米颗粒仿生酶材料(Co-NSG)合成中，具体步骤如下：

(1)首先通过超声将100mg氧化石墨(GO)分散在30mL去离子水(DIW)中，加入2.5mgC

涂覆仿生酶敏感元件的工作电极：

将上述制备的Co-NSG纳米颗粒仿生酶材料以1mg/mL的配比浓度分散于水中，获得电极修饰溶液，将4.0μL该电极修饰溶液涂覆到玻碳电极上，在26℃下干燥5h后再涂覆Nafion质量分数为0.1wt％的Nafion溶液2.0μL，再次在26℃下干燥5h，制得表面涂覆纳米颗粒仿生酶敏感元件的工作电极。

构建超氧阴离子自由基电化学传感器：

将制得的表面涂覆纳米颗粒仿生酶敏感元件的工作电极与电化学工作站、对电极(铂丝电极)、参比电极(Hg/HgCl

图1为实施例1中制备的纳米颗粒仿生酶敏感元件的TEM图，由图1可知，负载着金属钴纳米颗粒的杂原子掺杂石墨烯基仿生酶合成，测量可知Co纳米颗粒的平均直径在60nm左右。

图2为实施例1中制备的纳米颗粒仿生酶敏感元件的HRTEM图，由图2可知，钴纳米颗粒在杂原子掺杂的石墨烯上分散良好。

图3为实施例1中制备的纳米颗粒仿生酶敏感元件的电子衍射图，由图3可知，钴纳米颗粒在杂原子掺杂的石墨烯上固定良好。

图4为实施例1中制备的纳米颗粒仿生酶敏感元件的接触角表征图，由图4可知，该仿生酶的接触角为77.51°，小于90°，这证明该材料具备良好细胞应用潜力。

本实施例中氧化石墨烯可以但不限于用还原氧化石墨烯、碳纳米管、碳纳米纤维等碳纳米材料替换；乙酸钴四水合物可以但不限于用钴、镍、锰、铜或铁等过渡金属源的乙酸盐替换；三聚氰胺可以但不限于用吡啶、吡嗪、嘧啶和哒嗪等六元杂环化合物替换；半膀氨基酸可以但不限于用丝氨酸和丙氨酸等生物质氨基酸替换。

实施例2

超氧化物歧化酶仿生酶材料，具体步骤如下：

将100mg GO与500mg C

涂覆NSG仿生酶材料的工作电极：

将制备的NSG仿生酶材料以1mg/mL的配比浓度分散于水中，获得电极修饰溶液，将该电极修饰溶液涂覆到玻碳电极上，在26℃下干燥5h后再涂覆Nafion质量分数为0.1wt％的Nafion溶液，再次在26℃下干燥5h，制得表面涂覆超氧化物歧化酶仿生材料的工作电极。

构建超氧阴离子自由基电化学传感器：

将中制得的表面涂覆超氧化物歧化酶仿生材料的工作电极与电化学工作站、对电极(铂丝电极)、参比电极(Hg/HgCl

图5为实施例2中制备的超氧化物歧化酶仿生材料的TEM图，由图5可知，杂原子掺杂的石墨烯仿生酶材料合成。

图6为实施例2中制备的超氧化物歧化酶仿生材料的HRTEM图，由图6可知，杂原子掺杂的石墨烯仿生酶材料是无定形的。

实施例3

超氧化物歧化酶仿生酶材料，具体步骤如下：

配制45mL磷酸盐缓冲溶液，再将0.1014g硫酸锰加入2mL去离子水中，将两种溶液混合均匀，26℃下搅拌反应8h后以5000r/min的速度离心10min后取沉淀，将沉淀以去离子水洗涤后在80℃下真空干燥12h，制得超氧化物歧化酶仿生酶材料。

涂覆仿生酶敏感元件的工作电极：

将制备的超氧化物歧化酶仿生材料以1.5mg/mL的配比浓度分散于水中，获得电极修饰溶液，将该电极修饰溶液涂覆到玻碳电极上，在26℃下干燥5h后再涂覆Nafion质量分数为0.1wt％的Nafion溶液，再次在26℃下干燥5h，制得表面涂覆有超氧化物歧化酶仿生材料的工作电极；

构建超氧阴离子自由基电化学传感器：

将制得的表面涂覆有超氧化物歧化酶仿生材料的工作电极与电化学工作站、对电极(铂丝电极)、参比电极(Hg/HgCl

图7为实施例3中制备的超氧化物歧化酶仿生材料的FESEM图，由图7可知，片状磷酸锰仿生酶材料合成，尺度为微米级。

实施例4

将含有8μmol·L

实施例5

将含有8μmol·L

实施例6

将含有8μmol·L

实施例7

测试实施例1中构建的传感器对O

图13为实施例1中构建的传感器对O

实施例8

将不同物质的溶液依次加入到实施例1中构建的传感器的电解液中，测试该传感器对不同干扰成分的计时电流响应，每隔50s分别依次连续地向传感器中的电解液中加入50nmol·L

实施例9

将实施例1中构建的传感器用于DU145细胞检测，细胞密度为1×10

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。