一种基于不同基因型玉米种氮效率差异遗传特性的评价方法

摘要

本发明属于种植作物基因工程技术领域，具体涉及一种基于不同基因型玉米种氮效率差异遗传特性的评价方法，并进一步公开其在玉米作物种植领域的应用。本发明所述基于不同基因型玉米种氮效率差异遗传特性的评价方法，通过研究不同基因型玉米杂交种及其亲本自交系氮素吸收、转运与分配能力的差异，进而分析不同基因型品种氮效率相关基因的表达水平，从分子机制和溯源角度探析其氮效率差异的遗传特性及生理机制，为不同基因型玉米品种的高质量种植提供理论指导。

说明书

技术领域

本发明属于种植作物基因工程技术领域，具体涉及一种基于不同基因型玉米种氮效率差异遗传特性的评价方法，并进一步公开其在玉米作物种植领域的应用。

背景技术

近年来，我国水稻、小麦、玉米、大豆、高粱等粮食产品价格已高于国际市场价格的10％-70％。为提高粮食作物的产量，针对我国土壤普遍存在缺氮这一限制高产的原因，人们长期通过不断增加化肥尤其氮肥的施用量来达到提高产量的目的，但随着农田氮肥的过量施用导致肥料利用率下降和地下水硝酸盐污染等问题的加剧，人们开始从粮食作物氮效率等方面寻找解决途径，即从作物入手，研究其在减少氮肥投入条件下，充分利用作物生长季中的矿化氮，提高对土壤氮素的高效吸收利用率。

作物氮效率包括氮吸收效率和氮利用效率两个方面，目前关于作物氮效率差异的相关研究报道较多。现已发现小麦、水稻等作物基因型间对氮素的吸收、利用均存在显著差异(董桂春等,2009；张国平,1996)，这种差异不仅表现在不同品种对氮素吸收能力的不同，而且也表现在植株体内氮素转运和分配的差异(郭松等,2018)。针对玉米氮素吸收与氮素利用率，前人从品种、基因型和遗传等方面开展了大量研究。刘梅等(2017)对1989-2013年中国主推玉米品种的产量以及氮素利用的研究发现，近代玉米品种的籽粒产量、氮素积累量、根系氮素吸收效率、氮素利用效率以及氮素收获指数均高于早期品种，且在低氮条件下优势更明显。国外学者研究发现，与1940-1990年间的老玉米品种相比，1991-2011年间的新玉米品种产量增加25％，而氮素积累量仅增加12％，表明从老品种到新品种演变过程中玉米氮利用效率有所提高，却是以降低籽粒氮浓度为代价(Ciampitti and Vyn,2012)。也有其他研究者发现，玉米籽粒氮浓度随着玉米产量增加而下降(Ciampitti and Vyn,2014；Hou et al.,2012)；玉米育种进程中提高品种的绿熟性可以显著增加玉米产量和氮吸收效率，但显著降低了叶片的氮转移效率，导致籽粒氮浓度下降，进而阻碍高产和氮高效利用的协同提高(Mi et al.,2003；Pommel et al.,2006)。可见，如何在提高产量的同时进一步提高玉米营养器官中氮素的转运效率，是摆在育种及营养生理学基础研究面前的一个尚未解决的难题。

目前，解决这一难题的重要途径之一即是研究探明不同基因型玉米品种或育种材料氮效率差异的遗传特性和生理机制，为玉米育种家有效挖掘养分高效利用的遗传潜力探明方向。郭松等研究发现，中度绿熟玉米品种先玉335相对于持绿玉米品种NE9，具有较强的氮素吸收能力和更高的花后叶片氮转移效率，具有籽粒产量高和籽粒氮素积累强的特点(郭松等,2018)。而申请人在先研究也发现保绿型品种登海605与鲁单818的籽粒产量和籽粒氮浓度均显著高于黄熟型品种鲁单981与青农105(薛艳芳等,2017)；保绿型玉米品种具有较高的氮代谢酶活性，生育后期有较强的氮素吸收和同化能力，但其氮素转移量、转移率和氮素收获指数则显著低于黄熟型玉米品种(刘春晓等,2014)。可见，基于不同基因型玉米杂交种的氮效率特征及其生理机制尚未有较为一致的结论。鉴于自交系是玉米新品种选育和品种特性的源头，保绿型与黄熟型玉米品种间氮素效率的差异也根源于其亲本自交系。但是，对于杂交种与其亲本自交系氮素效率的内在遗传关系尚不明确，有必要深入研究不同基因型玉米品种(杂交种与其亲本自交系)氮效率的分子机制。

由于植物叶片中的蛋白质会随着叶片衰老而发生降解，产生的氨基酸进一步转化并伴随体内氮的再转移，为籽粒和其他库提供氮源。国外学者研究中发现，在所有的叶绿体蛋白中，Rubisco是灌浆期衰老叶片中蛋白质水解和氮转移的主要蛋白(Mae T et al.,1993)，ZmSee2β则是玉米叶片中协同衰老的蛋白酶-豆荚蛋白的基因，它在叶片氮的利用和分配中具有重要作用(Donnison I S,et al.,2007)。国内学者通过分析49个玉米自交系的See2β基因序列发现，在几个关键自交系中有See2β基因的等位变异，这些等位变异有可能用于玉米氮高效的遗传改良(Zhang et al.,2012)。最新研究也确认ZmSee2β是控制玉米叶片中氮素转移效率的重要基因，且中度绿熟玉米品种先玉335叶片氮转移效率高可能是因为控制蛋白质降解的ZmSee2β基因表达能力强，促进了叶片中蛋白质的降解速度(郭松等,2018)。因此，研究不同基因型玉米杂交种或自交系氮素转运与利用特性，从溯源的角度同步研究保绿型与黄熟型玉米杂交种及其亲本自交系的氮效率特征，并借助分子生物学手段探析其氮效率差异和相关基因的表达关系，明确基因型间氮效率差异的遗传特性及生理机制，对于提高不同品种玉米作物的氮效率具有积极的意义。

发明内容

为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种基于不同基因型玉米种氮效率差异遗传特性的评价方法，以研究不同基因型玉米杂交种及其亲本自交系氮素吸收、转运与分配能力的差异，分析其氮效率相关基因的表达水平，从分子机制和溯源角度探析其氮效率差异的遗传特性及生理机制；

本发明所要解决的第二个技术问题在于提供上述方法在玉米作物种植领域的应用。

为解决上述技术问题，本发明所述的一种基于不同基因型玉米种氮效率差异遗传特性的评价方法，包括如下步骤：

(1)选择不同品种的玉米种子及其亲本自交系种子进行栽培种植，并按照常规方式施加基肥、种肥及追肥处理；

(2)自出苗开始观察植株生长发育状况，于吐丝期挂牌标记同一天开花的植株；

(3)分别测定各植株的如下性能参数：测定生物量、产量及其构成，测定根系特征及其氮吸收竞争力参数并分析玉米基因型间氮效率差异，测定蛋白质和氨基酸浓度并进行基因表达分析；测定与氮代谢相关的酶活性。

具体的，所述步骤(1)中，所述玉米种子包括保绿型玉米杂交种和/或黄熟型玉米杂交种。

更优选的，所述步骤(1)中，所述玉米种子包括保绿型玉米杂交种登海605、鲁单818，和/或，黄熟型玉米杂交种鲁单981、青农105。

具体的，所述步骤(1)中，所述栽培种植步骤为箱式土柱栽培方式。

具体的，所述箱式土柱栽培步骤中，每个土柱种植1-2株，并设置选定杂交种各自单播，其父母本自交系各自单播与两者混播处理，并设置不同氮素水平的平行试验组，生长期间保持充足的水分供应，其它管理同高产田。

具体的，所述步骤(2)中，还包括在种植期间采用人工套袋饱和授粉的方式，即在开花期将所有雌穗套袋，吐丝散粉期统一给第一果穗授粉进行自交。

具体的，所述步骤(3)中，所述测定生物量、产量及其构成步骤具体包括：

在吐丝期和生理成熟期按照常规方法采集植株生物量，分为根、茎、叶、穗轴(含苞叶)、粒，并采用H

在成熟期各处理选长势一致的植株，进行考种并测定其产量。

具体的，所述步骤(3)中，所述测定根系特征及其氮吸收竞争力参数并分析玉米基因型间氮效率差异包括：测定植株的根长、根表面积、根径等，用根系扫描仪(Epson,Japan)扫描，并用根系分析软件(RHIZO 4b,Australia)进行数据分析获得相关参数；留存根样，测定并计算单位根重、单位根表面积氮吸收量；各参数计算公式如下：

(a)地上部植株氮累积量＝秸秆氮累积量+籽粒氮累积量；

(b)花后氮吸收量＝成熟期地上部植株氮累积量-开花期地上部植株氮累积量；

(c)灌浆期内氮向籽粒的转移量＝开花期地上部植株氮累积量-成熟期秸秆氮累积量；

(d)氮转移效率(％)＝灌浆期内氮向籽粒的转移量/开花期地上部植株氮累积量×100％；

(e)花前地上部植株氮累积比例(％)＝开花期地上部植株氮累积量/成熟期地上部植株氮累积量×100％；

(f)花后地上部植株氮累积比例(％)＝花后氮吸收量/成熟期地上部植株氮累积量×100％；

(g)氮输出量对籽粒氮累积的表观贡献率(％)＝灌浆期内氮向籽粒的转移量/籽粒氮累积量×100％；

(h)花后氮吸收量对籽粒氮累积的表观贡献率(％)＝(成熟期籽粒氮累积量–灌浆期内氮向籽粒的转移量)/成熟期籽粒氮累积量×100；

(i)氮收获指数(％)＝成熟期籽粒氮累积量/成熟期地上部植株氮积量×100％；

(j)氮肥利用率(％)＝(施氮区吸氮量-无氮区吸氮量)/施氮量×100％；

(k)氮肥农学效率(kg/kg)＝(施氮区产量-无氮区产量)/施氮量。

具体的，所述步骤(3)中，所述测定蛋白质和氨基酸浓度及基因表达分析包括：选择不同氮素水平的保绿型与黄熟型各1个杂交种及其亲本自交系实验组，在吐丝期和灌浆期上午9点至12点，剪刀迅速取下3片穗位叶，用锡箔纸包好置于液氮中保存，室内测定蛋白质和氨基酸浓度以及提取RNA做基因表达分析；

蛋白浓度的测定方法为考马斯亮蓝法，用牛血清蛋白作标准溶液；总氨基酸的测定用茚三酮和醋酸锂，用亮氨酸作标准溶液，计算蛋白质降解率：

蛋白质降解率(％)＝(吐丝期可溶性蛋白浓度-灌浆期可溶性蛋白浓度)/吐丝期可溶性蛋白浓度×100％。

基因表达分析步骤用Trizol总RNA提取试剂盒提取玉米叶片RNA，将去除基因组DNA的RNA反转录获得cDNA，以ZmACT1和ZmTUB为内参基因进行q-PCR，分析ZmSee2β基因的表达水平。

具体的，所述步骤(3)中，所述测定与氮代谢相关的酶活性包括：于成熟期，每个处理用剪刀迅速取下2片穗位叶，并利用吐丝期和灌浆期采集的部分穗位叶鲜样，分别测取硝酸还原酶(NR)、谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酸脱氢酶(GDH)活性。

本发明还公开了所述基于不同基因型玉米种氮效率差异遗传特性的评价方法在玉米作物种植领域的应用。

本发明所述基于不同基因型玉米种氮效率差异遗传特性的评价方法，通过研究不同基因型玉米杂交种及其亲本自交系氮素吸收、转运与分配能力的差异，进而分析不同基因型品种氮效率相关基因的表达水平，从分子机制和溯源角度探析其氮效率差异的遗传特性及生理机制，为不同基因型玉米品种的高质量种植提供理论指导。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，

图1为本发明采用的箱式土柱栽培田间示意图。

具体实施方式

实施例1

在前期研究基础上，选择不同基因型玉米杂交种及其亲本自交系为供试材料。具体选用保绿型玉米杂交种登海605与其亲本自交系(母本DH351，父本DH382)、鲁单818与其亲本自交系(母本lx9801，父本Qxh0121)和黄熟型玉米杂交种鲁单981与其亲本自交系(母本Q319，父本lx9801)、青农105与其亲本自交系(母本LN287，父本LN518)为供试材料。

试验方法为箱式土柱栽培试验，并设计试验方案如下：采用箱式土柱栽培，土柱为56cm×28cm×90cm和28cm×28cm×90cm两种，由PVC板制成，下封底且其一侧面可拆卸。土柱置于事先挖好深1m的方形土坑内，内外装土后浇水充分沉实，间距1m，土坑周围设置保护行，土柱用土为40cm农田表土层，土壤混匀过筛，并与干净河沙按4：1(体积)进行混匀。

如图1所示的箱式土柱栽培田间示意图，每个土柱种植1株玉米种，分别设置4个杂交种各自单播，8个父母本自交系各自单播与两者混播处理。设置各处理组的施氮水平为：N0(不施氮)、N1(施纯氮7.2g N·plant

所有处理磷、钾肥一次性基施，每株用量为P

自出苗开始观察植株生长发育状况，于吐丝期挂牌标记同一天开花的植株，为避免花粉直感，采用人工套袋饱和授粉。开花期将所有雌穗套袋，吐丝散粉期统一给第一果穗授粉进行自交。

测试项目与分析方法如下：

(1)生物量、产量及其构成

在吐丝期和生理成熟期按照常规方法采集植株生物量，分为根、茎、叶、穗轴(含苞叶)、粒，并采用H

表1不同基因型玉米品种生物量及产量

(2)根系特征及玉米基因型间氮效率差异

测试特包括根长、根表面积、根径等，用根系扫描仪(Epson,Japan)扫描，并用根系分析软件(RHIZO 4b,Australia)进行数据分析获得相关参数；留存根样，测定并计算单位根重、单位根表面积氮吸收量。

根据上述测试结果进行计算玉米基因型间氮效率差异分析，计算公式如下：

(a)地上部植株氮累积量＝秸秆氮累积量+籽粒氮累积量；

(b)花后氮吸收量＝成熟期地上部植株氮累积量-开花期地上部植株氮累积量；

(c)灌浆期内氮向籽粒的转移量＝开花期地上部植株氮累积量-成熟期秸秆氮累积量；

(d)氮转移效率(％)＝灌浆期内氮向籽粒的转移量/开花期地上部植株氮累积量×100％；

(e)花前地上部植株氮累积比例(％)＝开花期地上部植株氮累积量/成熟期地上部植株氮累积量×100％；

(f)花后地上部植株氮累积比例(％)＝花后氮吸收量/成熟期地上部植株氮累积量×100％；

(g)氮输出量对籽粒氮累积的表观贡献率(％)＝灌浆期内氮向籽粒的转移量/籽粒氮累积量×100％；

(h)花后氮吸收量对籽粒氮累积的表观贡献率(％)＝(成熟期籽粒氮累积量-灌浆期内氮向籽粒的转移量)/成熟期籽粒氮累积量×100％；

(i)氮收获指数(％)＝成熟期籽粒氮累积量/成熟期地上部植株氮积量×100％；

(j)氮肥利用率(％)＝(施氮区吸氮量-无氮区吸氮量)/施氮量×100％；

(k)氮肥农学效率(g/g)＝(施氮区产量-无氮区产量)/施氮量；

各参数计算结果见下表2。

表2不同基因型玉米品种氮素利用效率

从上表1-2中检测数据可知，本发明方法通过对作物特性的测定进而计算得到其氮肥利用效率等参数，有助于判定不同基因型玉米作物的氮效率差异，为不同基因型玉米品种的高质量种植提供理论指导。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。