新生儿胆道闭锁诊断标志物的应用

摘要

本发明公开了新生儿胆道闭锁诊断标志物在制备评估和诊断新生儿胆道闭锁的工具中的应用。所述诊断产品可以为医疗器械、试剂盒、试纸和医疗装置等。本发明还提供了检测所述生物标志物的试剂盒及其使用方法。本发明提供了新生儿胆道闭锁风险早期筛查和区别于其他原因导致的胆汁瘀积的诊断的有效手段，提高了新生儿胆道闭锁诊断效率和诊断准确性，为及时采取治疗措施争取时间，有利于提高新生儿胆道闭锁的治疗效果和预后。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医疗技术领域，具体涉及可用于评估新生儿胆道闭锁风险的诊断标志 物及其在监测、筛查和诊断新生儿胆道闭锁领域的应用，本发明还涉及检测所述诊断标志物的 方法和装置。

背景技术

胆道闭锁(Biliary atresia，BA)新生儿期发生的进行性、特发性肝外胆管系统疾病，是一 种破坏性的新生儿胆管炎症纤维阻塞，影响着不同长度的肝内和肝外胆管，是新生儿阻塞性黄 疸最主要原因，也是小儿肝移植最主要原因，约60％儿童肝移植是由此引起的。诊断为先天性 胆道闭锁的患儿，如不得到及时治疗，80％以上将在1岁以内因肝功能衰竭而死亡。许多患儿 往往在确诊胆道闭锁时即已存在严重的肝脏纤维化，并且很快发展成为肝硬化，最终导致肝功 能衰竭。因此，胆道闭锁的尽早诊断就愈发显得迫切。肝门空肠吻合术(Kasai根治术)是胆 道闭锁的首选治疗方案。手术时间对于Kasai手术的疗效有很大影响。研究发现，在出生后 30或45天内进行Kasai手术，其术后黄疸消失率和五年的自体肝生存率显著升高，对肝移植 的需求显著降低。但不幸的是目前胆道闭锁不能及时诊断，一般手术的时间都到了2个月后。 胆道闭锁的早期筛查和诊断对患者意义重大，可节省患者宝贵的治疗时间并提高预后。目前临 床常用的术前诊断方法包括肝活检、胰胆管造影、肝胆造影和十二指肠管检查等。但这些技 术存在一定局限性。影像学检查中，异常胆囊(胆囊缩小，收缩差)和肝门部纤维块是超声检查 胆道闭锁患儿肝脏的特征性表现[Ta等。利用肝门纤维块及胆囊长度诊断胆道闭锁。儿科影像 学，2000,30(2):69-73]，但肝门部纤维块不一定在每个患儿中均出现，并且超声检查因不同 医生、机器等观察结果差异较大。因此文献中报道诊断胆道闭锁的敏感性与特异性各不相同。 近期，有Meta分析报道，胆囊闭锁和肝门部纤维块的特异性均可达到99％，然而相对应的敏 感性为28％和80％。

3个月龄以内的婴儿胆管直径小、胆管内液体少，磁共振胰胆管成像检查诊断胆道闭 锁的高假阳性率不可避免。此外，胆道闭锁的病理特征为小胆管增生、胆栓形成、毛细胆管和 肝细胞胆汁淤积、汇管区或小叶周围纤维化，早期尚可见肝小叶结构。因此，临床应用于鉴别 胆道闭锁与其他新生儿胆汁淤积症时，因检测准确性低或过程复杂导致胆道闭锁诊断和治疗的 延迟。在疾病早期，BA的临床表现、生物化学指标、影像学和组织学特征与其它胆汁淤积疾 病存在重叠性，鉴别诊断过程曲折、复杂且费用高昂，容易导致诊断延迟和增加了患者家庭的 经济负担。肝活检和十二指肠管检查将涉及不必要的手术，并给疑似患儿带来额外伤害。因此 探索简单、特异性诊断方法从未停止，探索简单有效的诊断生物标志物对胆道闭锁的早期筛查 和诊断具有重要意义。

现有的胆道闭锁筛查和诊断血清学指标包括：①血清总胆红素，直接胆红素；其作为最初筛查 指标。新生儿血清总胆红素>2.0mg/dL(42–51μmol/L)，或直接胆红素>1.0mg/dL(17μmol/L) 需进行胆道闭锁排查，但对于诊断胆道闭锁特异性差；②GGT：大样本调查研究表明，不同年 龄组中，胆道闭锁组GGT含量均明显高于其他胆汁淤积疾病组[Chen X等。γ-GT与年龄结合 诊断胆道闭锁的价值。儿科胃肠病学与营养学，2016,63(3):370-373]。Liu等人在“γ-GT 对早期诊断胆道闭锁的价值”中报道GGT>300U/L时，其诊断胆道闭锁的精确度为60％-85％ 诊断。GGT是胆道闭锁最常用的筛查指标，但临床病例中不同患儿之间差异较大，准确性受到 局限；③其他指标：血清胆酸、凝血酶原浓度、血小板测定影响因素较多。

现有技术中对新生儿胆道闭锁诊断的生物标志物进行了探索。中国专利文献CN101221129B公开了磺酸化胆汁酸酶荧光毛细分析法及酶荧光定量试剂盒，适用于肝胆疾病 的快速筛查和诊断，尤其适用于新生儿期黄疸、先天性胆道闭锁症的早期发现。CN108267585A 公开了生物样品中的MMP-7作为诊断标志物。CN102818866B公开了血清中牛磺鹅去氧胆酸和 鹅去氧胆酸的比值作为新生儿胆道闭锁的诊断标志物。

本发明针对现有技术之不足，探索便捷、可靠的能够评估新生儿胆道闭锁风险的方法 或途径，为临床新生儿胆道闭锁快速、高效地筛查和诊断提供可行方案。

发明内容

本发明提供了一种能够便利、可靠、高效地对新生儿胆道闭锁风险进行评估、筛查和/ 或诊断的技术方案。本发明提供了生物标志物用以评估新生儿胆道闭锁风险，本发明还提供了 新生儿胆道闭锁风险的评估方法。本发明提供了生物标志物用于制备评估新生儿胆道闭锁风险 的产品、方法或装置，可用于临床筛查新生儿胆道闭锁高风险患者。

本发明提供的评估新生胆道闭锁风险的所有技术方案，可根据评估结果决定是否采取 进一步的临床诊断和治疗措施。基于本文提供的构思、方法和数据，本发明使新生儿胆道闭锁 的早期快速筛查成为可能。

本发明探索了胆红素及其代谢产物与新生儿患有胆道闭锁风险的关联性。本发明通过 测定健康新生儿和患有胆道闭锁新生儿血液样本中胆红素及其代谢产物，确定了胆红素及其代 谢产物与新生儿胆道闭锁风险是相关的。结合生物信息学方法，将本发明生物标志物的水平与 检测对象胆道闭锁的风险相关联。作为示例，采用胆红素单葡萄糖醛酸酯作为生物标志物，检 测健康新生儿和新生儿胆道闭锁患者的检测样本中的胆红素单葡萄糖醛酸酯的含量，确定截断 值(cutoff值)；当检测对象同样的检测样本中的胆红素单葡萄糖醛酸酯的含量高于截断值时， 提示检测对象具有胆道闭锁高风险，提示了进一步临床诊断和治疗的必要性。

本发明提供了与新生儿胆道闭锁有关的生物标志物，以及进一步提供所述生物标志物 在新生儿胆道闭锁风险评估、筛查和/或诊断的应用，以及进一步提供一种评估新生儿胆道闭 锁风险的工具和方法，以及进一步更具体地提供所述生物标志物在制备新生儿胆道闭锁风险评 估的诊断产品的应用及相关诊断产品和使用方法。

本发明描述生物标志物筛查和验证的研究过程和结果。本发明通过定量测定胆红素及 其组分的含量在正常新生儿、胆道闭锁新生儿和其他原因导致的胆汁瘀积疾病新生儿血液样本 中含量的不同，发现可将胆红素单葡萄糖醛酸酯定量检测值作为风险评估的指标用以区分正常 新生儿、疑似胆道闭锁新生儿和其他原因导致的胆汁瘀积疾病新生儿。基于此创造性研究成果， 发明人进一步探索将胆红素单葡萄糖醛酸酯含量作为检测指标用于临床新生儿胆道闭锁的早 期筛查与诊断的应用途径，从而使新生儿出生后快速、便捷、高效地进行胆道闭锁的筛查，对 于高风险患儿迅速采取进一步医疗措施成为可能。

发明人提出胆红素单葡萄糖醛酸酯可以作为诊断标志物用于临床新生儿胆道闭锁的快 速筛查的方法；以及作为示例之一，发明人提出胆红素单葡萄糖醛酸酯作为诊断标志物，可用 于制备新生儿胆道闭锁风险评估的适当的诊断产品，该诊断产品以胆红素单葡萄糖醛酸酯作为 定量检测指标，包含胆红素单葡萄糖醛酸酯定量检测试剂，以及任选地，可包含对受试体的血 液样本进行处理的试剂及其他检测试剂。

基于以上发现和构思，本发明第一方面提供胆红素单葡萄糖醛酸酯作为诊断标志物在 制备用于评估新生儿胆道闭锁风险的诊断装置中的应用，其特征在于，所述诊断装置对胆红素 单葡萄糖醛酸酯进行定量检测。

在一些具体的实施方式中，所述诊断装置选自医疗器械、试剂盒、试纸和检测装置。

在一些具体的实施方式中，所述诊断装置以新生儿为检测对象，采用检测对象的血液 样本进行检测。所述血液样本选自检测对象的全血、血浆、血清和干血斑。

在一些具体的实施方式中，提供了优选的检测样本，其特征在于，所述检测方法的检 测样本分配于含有第一稳定剂和第二稳定剂的体系。

所述第一稳定剂选自在非极性介质中具备一定溶解度的抗氧化剂。所述第一稳定剂可 选自丁基羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)、没食子酸丙酯(PG)、叔丁基对苯二酚(TBHQ) 中之一种或几种的组合。

所述第二稳定剂选自在极性介质中具备一定溶解度的抗氧化剂，作为具体实施方式， 所述第二稳定剂选自抗坏血酸。作为优选实施例，所述含有第一抗氧化剂和第二抗氧化剂的体 系包含第一稳定剂二丁基羟基甲苯(BHT)和第二稳定剂抗坏血酸。

作为具体实施方式，所述第一稳定剂和第二稳定剂在体系中含量的重量比例范围为1： 1-1：50，优选1：10-1：45，进一步优选1：20-1：40，进一步优选1：30-1：40。

在一些具体的实施方式中，所述检测样本选自生物样本的有机溶剂分散体系。所述有 机溶剂分散体系的有机溶剂选自甲醇，乙醇，丙酮，丙二醇，乙腈中之种或几种的组合。所述 生物样本可选自全血、血浆、血清和干血斑。所述生物样本分散于有机溶剂分散体系后，经离 心后取上清液按照本发明提供的检测方法进行检测。

在一些具体的实施方式中，生物样本可按照以下方式进行处理：在生物样本中加入牛 磺酸胆红素作为内标，再加入含第一稳定剂和第二稳定剂的有机溶剂分散体系，避光震荡，离 心，取上清液进行检测。

在一些优选的实施方式中，含第一稳定剂和第二稳定剂的有机溶剂分散体系可以是 BHT和抗坏血酸的甲醇-乙腈混合溶液；作为具体实施方式，所述第一稳定剂和第二稳定剂在 体系中含量的重量比例范围为1：1-1：50，优选1：10-1：45，进一步优选1：20-1：40，进一步优选1：30-1：40。

优选地，振荡和离心在0-10℃进行，可选0℃、4℃、10℃；震荡条件为1000-2000rpm, 优选1400-1500rpm,振荡时间10-30分钟，优选15-25分钟；离心力100000-250000g，离心时 间10-30分钟。

在一些具体的实施方式中，所述诊断装置可任选地联合检测对象的其他检测指标评估 新生儿胆道闭锁风险，其他检测指标选自游离胆红素、胆红素双葡萄糖醛酸酯、胆绿素、γ- 谷氨酰转移酶、MMP-7和其他直接或间接地对新生儿胆道闭锁有诊断能力的指标之一种或几种 用于所述应用目的。

本发明第二方面提供一种用于评估新生儿胆道闭锁风险的试剂盒，其特征在于，包含 胆红素单葡萄糖醛酸酯定量检测试剂。所述定量检测试剂包括胆红素单葡萄糖醛酸酯质控品和 内标准品。

一些具体的实施方式中，所述胆红素单葡萄糖醛酸酯质控品为胆红素单葡萄糖醛酸酯 标准品分配于包含有第一稳定剂和第二稳定剂的体系中。优选地，所述第一稳定剂选自丁基羟 基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)、没食子酸丙酯(PG)、叔丁基对苯二酚(TBHQ)中之一种 或几种的组合。优选地，所述第二稳定剂选自抗坏血酸。

一些具体的实施方式中，优选地，所述第一稳定剂和第二稳定剂的体系为含有二丁基 羟基甲苯(BHT)和抗坏血酸的有机溶剂分散体系。优选地，所述有机溶剂分散体系的有机溶剂 选自甲醇、乙醇、丙酮、丙二醇和乙腈中之一种或几种的组合。

在另一些具体的实施方式中，所述体系为固体体系，所述固体体系包括固体载体。优 选地，所述固体载体为滤纸片，优选地，选自分析滤纸、定性分析滤纸和慢速定量无灰滤纸。 所述滤纸片作为固体载体时，其优选经过以下预处理：在含有第一稳定剂和第二稳定剂的有机 溶剂分散体系中浸泡后阴干。

所述的试剂盒用于评估新生儿胆道闭锁风险的试剂盒的使用方法，包括，

(1)以新生儿作为检测对象获得测试样本；

(2)采用定量检测方法测定测试样本中生物标志物的表达水平；

(3)分析所述生物标志物的表达水平以进行风险评估，所述分析可以是与定量检测方 法的截断值比较，该风险评估结论可以用于检测对象胆道闭锁风险高低的评估。

可选地，在步骤(3)风险评估时，可任选地联合检测对象的其他检测指标评估新生儿 胆道闭锁风险，其他检测指标选自游离胆红素、胆红素双葡萄糖醛酸酯、胆绿素、γ-谷氨酰 转移酶、MMP-7和其他直接或间接地对新生儿胆道闭锁有诊断能力的指标之一种或几种。

所述定量检测方法为如上任一所述的液相色谱串联质谱的定量检测方法。

所述测试样本选自检测对象的全血、血浆、血清和干血斑。

本发明第三方面提供一种评估新生儿胆道闭锁风险的方法，包括：

(1)以新生儿作为检测对象获得测试样本；

(2)采用定量检测方法测定测试样本中诊断标志物的表达水平；所述诊断标志物包括胆 红素单葡萄糖醛酸酯，及任选地联合检测对象的其他检测指标评估新生儿胆道闭锁 风险，其他检测指标选自游离胆红素、胆红素双葡萄糖醛酸酯、胆绿素、γ-谷氨 酰转移酶、MMP-7和其他直接或间接地对新生儿胆道闭锁有诊断能力的指标之一种 或几种；

(3)分析所述诊断标志物的表达水平以进行风险评估，所述分析可以是与定量检测方法 的截断值(cutoff值)比较，该风险评估结论可以用于检测对象胆道闭锁风险高低的评估；

(4)根据评估结论将检测对象分为高风险组和低风险组，其中高风险组提示有必要进行 进一步临床诊断以确定检测对象是否具有胆道闭锁。

优选地，步骤(3)所述定量检测方法的截断值系采用步骤(2)所述定量检测方法，事先对健康新生儿测试样本中的生物标志物水平与胆道闭锁新生儿测试样本中相应的生物标 志物水平，进行统计分析确定的值。

优选地，所述测试样品选自全血、血浆、血清或干血斑。

优选地，所述定量检测方法选自如上任一所述的液相色谱串联质谱的定量检测方法。 检测方法。

本发明第四方面提供一种利用胆红素单葡萄糖醛酸酯的表达水平用于预测新生儿胆道 闭锁风险的装置，其包括：

(1)用于接收检测对象的检测样品的模块；

(2)检测诊断标志物表达水平的数据的模块；其中诊断标志物至少包括胆红素单葡萄糖醛 酸酯，任选地包括测试样本中的游离胆红素、胆红素双葡萄糖醛酸酯、胆绿素、γ-谷氨酰 转移酶、MMP-7和其他对胆道闭锁有诊断能力的临床指标相结合；

(3)基于向数据库输入诊断标志物的表达水平来产生风险评分的模块，所述数据库包含与 检测样本和检测方法相关的对照表达谱；所述对照表达谱根据检测样本和检测方法而事先 得出，可表达为检测的诊断标志物的截断值；进行风险评估是将测试样本中生物标志物的 表达水平与高效液相色谱串联质谱作为检测方法的截断值相比较，高于截断值可认为是检 测对象具有胆道闭锁的高风险。

所述工具选自诊断产品和分析测试装置。

本发明所述“诊断产品”可以是医疗器械、试剂盒、试纸和医疗装置等。如本领域一般技术人 员所知，所述医疗器械、试剂盒等定义与当地相关法律法规和政策的规定有关，其在不同国家 地区有不同分类方法和含义。本发明所述医疗器械、试剂盒、试纸等名词，仅为说明本发明诊 断标志物的应用形式，并非当地定义之下的含义；只要与本发明目的相一致，所述诊断产品可 以为经相关当地注册的医疗产品，也可以是一般技术人员以临时应用的方式和形式进行使用的 产品或产品组合。

本文所述的“测试样本”可包括来源于检测对象的体液、血液、血浆、血清。优选血液、血浆、血清样本。以及作为本发明的突出效果，发现可以在通过检测对象的少量测试样本， 例如足跟血或指尖血，或以足跟血或指尖血制备的干血斑来检测本发明提供的生物标志物。

本发明所述“血液样本”可以是采自检测对象的全血、血浆、血清、足跟血或指尖血或临床常规使用的干血斑，所述干血斑可采自检测对象的足跟血或指尖血。

作为本发明示例之一，本发明提供用于评估新生儿胆道闭锁风险的试剂盒，包含胆红 素单葡萄糖醛酸酯定量检测试剂，如质控品、内标准品和内标稀释液。作为一种实施方式，所 述质控品包括含胆红素单葡萄糖醛酸酯质控品，所述内标准品包括牛磺酸胆红素标准品，所述 内标稀释液包括含2,6-二-叔-丁基-4-甲基苯酚的甲醇乙腈溶液。以及可进一步包括含乙酸 铵和乙酸的水溶液。

作为本发明示例之一，采用新生儿足跟或指尖取血制备的干血斑作为检测样本，在本 发明实施例检测条件下，当胆红素单葡萄糖醛酸酯含量大于2.5μM时，可认为受试体具有新 生儿胆道闭锁的高度风险。作为具体实施方式之一，申请人在实施例所述的检测条件下，将受 试体血液样本中胆红素单葡萄糖醛酸酯含量大于2.5μM时作为截断值(也称cutoff值)可快 速进行新生儿胆道闭锁风险的检测和评估。实施例中的Cutoff值是在所述检测方法、检测条 件和标准品等条件下确定的标准。本领域内一般技术人员根据本发明的启示，筛选、优化胆红 素单葡萄糖醛酸酯的定量检测方法，包括但不限于高效液相联用色谱技术，例如，气相色谱- 质谱检测技术，在本发明启示下，也可通过优化确定基于其检测方法和检测条件的cutoff值， 进行新生儿胆道闭锁风险的评估。在前述不同检测方法的cutoff值的筛查中，本发明检测方 法亦可作为参照和对比，尤其是在缺乏临床样本的情形下确定其他检测方法cutoff值。因此 以胆红素单葡萄糖醛酸酯含量作为检测指标评估新生儿胆道闭锁风险，不论其检测方法和 cutoff值的差异，均应理解为在本发明教导下，本领域一般技术人员可实现的范围内。

本发明提出的技术方案可有效评估新生儿胆道闭锁风险，能够实现临床上新生儿胆道 闭锁早早期筛查。在临床使用时，通过定量测定新生儿血液样本中的生物标志物的含量，可快 速筛查具有胆道闭锁高风险的新生儿。本发明生物标志物作为新生儿胆道闭锁筛查的标志物， 也可任选地联合其他检测指标和检测手段，进一步评估新生儿胆道闭锁风险，以及在诊断过程 中，任选地联合其他检测指标和检测手段。其他检测指标选自γ-谷氨酰转移酶、MMP-7和临 床指标。

本发明采用高效液相色谱-串联质谱定量检测血液样本中的胆红素及其代谢产物作为 新生儿胆道闭锁诊断标记物。血液样本可选自全血、血浆、血清和干血斑。干血斑采自新生儿 足跟血或指尖血。作为实施方案之一，发明人探索了以干血斑作为检测样本的诊断产品。干血 斑取样便利，有利于新生儿出生后迅速进行胆道闭锁的筛查，进一步有利于新生儿出生后迅速 进行胆道闭锁筛查的大面积推广。从另外一方面，即使需要重新取样，因干血斑的制备技术成 熟，取样方便，对新生儿创伤小或几无创伤，即使在需要重复检测时，也是尤其有利的。

本发明首次提出本发明生物标志物作为新生儿胆道闭锁筛查和风险评估的诊断标记物 的应用，可用于评估新生儿胆道闭锁风险，临床可用于在早早期即筛查新生儿胆道闭锁风险和 进一步诊断，为新生儿胆道闭锁患儿争取最佳手术时间，提高手术预后。

本发明采用高效液相色谱-串联质谱定量检测血液样本中的本发明生物标志物作为新 生儿胆道闭锁诊断标记物，具有取样便利，高效、检测结果可靠的优点。本发明检测方法可采 用全血、血清、血浆作为检测生物样本，也可以通过指尖或足跟采血制备的干血斑作为检测样 本进行检测。除此之外，本发明提供的高效液相-质谱定量检测方法较传统生化法具有高准确 性，低检测限的特点。

本文引用的所有参考文献都通过对其全文的引用并入本文并用于所有目的，其程度相 当于明确并单独指出将每个出版物或专利或专利申请通过对其全文的引用并入本文并用于所 有目的。此外，本文引用的CAS号通过对其完整引用并入本文并用于所有目的，其程度相当于 明确并单独指出将每个这类号对其完整引用并入本文并用于所有目的。

除非另外定义，在此使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属技术领域的一般 技术人员通常理解一样的含义。如本说明书及所附权利要求中使用的，单数形式“一”及“该” 包括多于一个的所提及对象，除非内容明确指示不同于此的含义。例如，提及“组分”时包括 一个或一个以上的组分的组合等。

为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下结合附图并通过实施例对 本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限 定本发明。

附图说明

附图1为胆红素及其代谢产物的色谱图，由图中可知各目标检测物能够被有效分离。

附图2为甲酸铵-甲酸系统作为流动相A的液相色谱图，由图中可知各目标检测物能够被 有效分离。

附图3为三氟乙酸系统作为流动相A的液相色谱图，由图中可知各目标检测物能够被有 效分离。

附图4高效液相色谱串联质谱检测目标成分时根据质控品制备的标准曲线。

附图5为各代谢物区分胆道闭锁新生儿和正常新生儿对照的ROC曲线下面积。

附图6为一组散点图，显示了在胆道闭锁新生儿和正常新生儿检测样本中胆红素单葡 萄糖醛酸酯水平的差异和胆红素单葡萄糖醛酸酯在区分胆道闭锁新生儿和正常新生儿对照的 ROC曲线下面积。

附图7为一组散点图，显示了在胆道闭锁新生儿和其他婴儿胆汁淤积检测样本中胆红 素单葡萄糖醛酸酯水平的差异和胆红素单葡萄糖醛酸酯在区分胆道闭锁新生儿和其他婴儿胆 汁淤积的ROC曲线下面积。

具体实施方式

人体血液中的主要胆红素包括4种胆红素组分，即α、β、γ、δ胆红素(bilirubin IXα，Bα；bilirubinβ-monoglucuronide，BMG；bilirubinγ-diglucuronide，BDG； δ-bilirubin，Bδ)。其中α胆红素是未结合胆红素(unconjugated bilirubin，UCB)，β、 γ、δ胆红素是结合胆红素(conjugated bilirubin，CB)。正常情况下，肝细胞内的α胆红 素主要有两个来源，一是通过肝细胞基底膜上的有机阴离子转运多肽转运体从外周血摄取转运 进入肝细胞，二是由肝细胞内的血红素氧化降解产生。肝细胞内98％～99％α胆红素经葡萄糖醛酸转移酶1A1(UDP-glucuronosyltransferase 1A1，UGT1A1)的葡萄糖醛酸化作用，分别与一个或二个葡萄糖醛酸结合，转化为β或γ胆红素，经毛细胆管膜上的多药耐药相关蛋白2(multidrug resistance-associated protein，MRP2)转运体排出至胆管。而病理性胆汁淤 积时，肝细胞分泌的胆汁不能正常进入胆管，从而引起外周血胆汁酸和结合胆红素蓄积、升高。

发明人发现现有技术中未有披露结合胆红素以及结合胆红素相关组分与新生儿胆道闭 锁的关联性进行研究，也未对其作为标志物评估新生儿胆道闭锁风险进行探索；现有技术中也 未对结合胆红素及结合胆红素各组分用于新生儿胆道闭锁诊断提供技术方案或技术启示。

发明人通过大量实验研究和探索了结合胆红素及结合胆红素相关代谢产物与新生儿胆 道闭锁的关联性，以及探索了其在临床新生儿胆道闭锁风险评估领域的应用。

发明人首先探索了对胆红素各组分进行定量检测的技术方案。在实施例中，包括选取 液相条件、设定质谱条件、制备标准溶液、优化分析方法、绘制标准曲线、样品前处理等研究 工作，实现了胆红素各成分的定性定量检测。以下通过实施例进行说明。

本文实施例中所采用的试剂来源如下：

双牛磺酸胆红素二钠盐：货号201102，采购自Sigma-Aldrich中国

胆绿素：货号30891，采购自Sigma-Aldrich中国

游离胆红素：货号B4126，采购自Sigma-Aldrich中国

甲醇：货号900688，采购自Sigma-Aldrich中国

乙腈：货号900667，采购自Sigma-Aldrich中国

2,6-二-叔-丁基-4-甲基苯酚(BHT)：货号B1378，采购自Sigma-Aldrich中国

乙酸铵：货号73594，采购自Sigma-Aldrich中国

乙酸：货号45754，采购自Sigma-Aldrich中国

甲酸铵：货号70221，采购自Sigma-Aldrich中国

甲酸：货号5330020050，采购自Sigma-Aldrich中国

三氟乙酸：货号302031，采购自Sigma-Aldrich中国

三氯乙酸货号T6399，采购自Sigma-Aldrich中国

胆红素单葡萄糖醛酸酯，申请人实验室自制，CAS号:27071-67-6，分子式:C39H44N4O12， 平均分子量:760.786，纯度:≥90％

胆红素双葡萄糖醛酸酯，申请人实验室自制，CAS号:17459-92-6，分子式:C45H52N4O18， 平均分子量:936.921，纯度:≥90％

实施例1液相色谱-串联质谱方法的建立和优化

在本实施例中，以示例目的描述了基于液相色谱-串联质谱对生物样本中胆红素各成分 进行定性定量检测方法的建立过程，包括选取液相条件、设定质谱条件、制备标准溶液、优化 分析方法、绘制标准曲线。本实施例检测方法具有高灵敏度和高选择性，抗干扰能力强，可以 成为胆红素各成分定性定量分析的有效工具。

胆红素样品中含有多种成分。发明人通过研究发现当液相色谱的流动相A的pH值为 3-4.5时，胆红素样品中的主要成分游离胆红素、胆绿素、胆红素单葡萄糖醛酸酯和胆红素双 葡萄糖醛酸酯能够得到很好的分离，适用于较广色谱柱，尤其是C8、C18硅胶柱，以及对柱温、 进样量具有良好的适用性。

质谱可选用四级杆质谱、飞行时间质谱、离子肼质谱和高分辨轨道肼质谱；所述质谱 的条件和设定质谱定性定量检测模式包括：选择电喷离子源(ESI)，根据检测目标化合物的 响应选择离子扫描模式；选择多反应监测方法(MRM)，设定多反应监测模式参数。

一、检测条件研究

仪器与试剂：乙腈(色谱纯级别)，甲醇(色谱纯级别)，异丙醇(色谱纯级别)， 乙酸铵(色谱纯级别)，乙酸(色谱纯级别)，手动或自动移液器(10-200μL、100-1000μL)， 均为市售购得。

液相条件1：流动相A：乙酸铵+乙酸调节pH3.5的超纯水溶液，流动相B：乙腈：甲醇：异丙醇＝8:1:1，柱温：40℃，色谱柱：Acquity BEH C18(2.1*50mm,1.7μm)，进样量：5μL。

液相条件2：流动相A：甲酸铵+甲酸调节pH4.5的超纯水溶液，流动相B：乙腈：甲醇：异丙醇＝8:1:1，柱温：40℃，色谱柱：Acquity BEH C18(2.1*50mm,1.7μm)，进样量：5μL。

液相条件3：流动相A：三氟乙酸铵调节pH3的超纯水溶液，流动相B：乙腈：甲醇：异丙醇＝8:1:1，柱温：40℃，色谱柱：Acquity BEH C18(2.1*50mm,1.7μm)，进样量：5μL。

仪器与试剂：乙腈(色谱纯级别)，甲醇(色谱纯级别)，异丙醇(色谱纯级别)，乙酸铵(色谱纯级别)，乙酸(色谱纯级别)，手动或自动移液器(10-200μL、100-1000μL)，均 为市售购得。

液相条件：流动相A：77mg乙酸铵+250μL乙酸调节pH3-4.5的超纯水溶液，流动相B：乙腈：甲醇：异丙醇＝8:1:1，柱温：40℃，色谱柱：Acquity BEH C18(2.1*50mm,1.7μm)， 进样量：5μL。高效液相色谱的程序如下表1所示。

表1 高效液相色谱程序

设置质谱条件：如表2所示，选择电喷雾电离源(ESI)，根据化合物的响应，选择合适的离子扫描模式，采用正离子模式下多反应监测方法(MRM)采集模式，设定多反应监测模式参数；扫描时间为0.4-4min。采用半自动进样方式，将标准溶液分别注入离子源，选取对应的母离子峰，对其子离子进行二级质谱分析，得到碎片离子信息，建立所述化合物的MRM质谱检测方法。

表2 胆红素及其代谢产物的MRM质谱检测参数

上述方案中所述质谱分析过程中，离子源温度为150℃，毛细管电压为3000伏,脱溶 剂气温度为500℃，脱溶剂气流速为1000升/小时,碰撞气为氩气。

在上述检测条件下，三种不同的液相条件下，胆红素各成分检测典型色谱图分别如附 图1、附图2和附图3所示。

制备标准溶液

采用上述液相条件1。

(1)游离胆红素标准溶液配制：称取适量的游离胆红素,加入氯仿,配制成浓度为1mg/mL的母液。

(2)胆红素单葡萄糖醛酸酯标准溶液配制：称取适量的胆红素单葡萄糖醛酸酯，加入 50％的甲醇溶液，配制成浓度为1mg/mL的母液。

(3)胆红素双葡萄糖醛酸酯标准溶液配制：称取适量的胆红素双葡萄糖醛酸酯，加入 50％的甲醇溶液，配制成浓度为1mg/mL的母液。

(4)胆绿素标准溶液配制：称取适量的胆绿素，加入甲醇，配制成浓度为1mg/mL的母液。

(5)混合标准品母液：用含1％BHT的甲醇，配置混合标准品，含游离胆红素、胆红素单葡萄糖醛酸酯、胆红素双葡萄糖醛酸酯和胆绿素的浓度均为50μmol/L。

(6)混合标准品溶液：用含1％BHT的甲醇，稀释混合标准品母液依次得到20、4、1、0.2μmol/L的混合标准品溶液。

(7)将上述步骤中配制好的标准母液按比例稀释后配成如下浓度的标准溶液，进样体 积1μl，以峰面积对目标物的含量绘制标准曲线，得到标准曲线如图4所示。

实施例2血液样品中胆红素的定性定量测定

取样：取3个检测对象的血清、血浆和全血样本，各样本分为3份如血清01、血清02、血清03等共9份生物样本。

生物样本处理：

血清01：取20微升样本，各加入10微升牛磺酸胆红素作为内标，再加入80微升含1mg/ml BHT和200mmol/L抗坏血酸甲醇：乙腈(体积比1:1)溶液，10℃避光1450rpm振荡20分钟。4℃ 离心力18000g离心20分钟。取60微升上清液到96孔板中，作为检测样本进行高效液相色谱串联 质谱检测。

血清02：取20微升样本，各加入10微升牛磺酸胆红素作为内标，再加入80微升含1mg/ml BHT和175mmol/L抗坏血酸的甲醇：乙腈(1:1)溶液，10℃避光1450rpm振荡20分钟。4℃离心 力18000g离心20分钟。取60微升上清液到96孔板中，作为检测样本进行高效液相色谱串联质谱 检测。

血清03：取20微升样本，各加入10微升牛磺酸胆红素作为内标，再加入80微升含1mg/ml BHT和204mmol/L抗坏血酸的甲醇：乙腈(1:1)溶液，10℃避光1450rpm振荡20分钟。4℃离心 力18000g离心20分钟。取60微升上清液到96孔板中，作为检测样本进行高效液相色谱串联质谱 检测。

血浆01：取20微升样本，各加入10微升牛磺酸胆红素作为内标，再加入80微升含含1mg/ml BHT和180mmol/L抗坏血酸的甲醇：乙腈(1:1)溶液，10℃避光1450rpm振荡20分钟。4℃ 离心力18000g离心20分钟。取60微升上清液到96孔板中，作为检测样本进行高效液相色谱串联 质谱检测。

血浆02：取20微升样本，各加入10微升牛磺酸胆红素作为内标，再加入80微升含1mg/ml BHT和160mmol/L抗坏血酸的甲醇：乙腈(1:1)溶液，10℃避光1450rpm振荡20分钟。4℃离心 力18000g离心20分钟。取60微升上清液到96孔板中，作为检测样本进行高效液相色谱串联质谱 检测。

血浆03：取20微升样本，各加入10微升牛磺酸胆红素作为内标，再加入80微升含1mg/ml BHT和170mmol/L抗坏血酸的甲醇：乙腈(1:1)溶液，10℃避光1450rpm振荡20分钟。4℃离心 力18000g离心20分钟。取60微升上清液到96孔板中，作为检测样本进行高效液相色谱串联质谱 检测。

全血01：取20微升样本，各加入10微升牛磺酸胆红素作为内标，再加入80微升含1mg/ml BHT和200mmol/L抗坏血酸的甲醇：乙腈(1:1)溶液，10℃避光1450rpm振荡20分钟。4℃离心 力18000g离心20分钟。取60微升上清液到96孔板中，作为检测样本进行高效液相色谱串联质谱 检测。

全血02：取20微升样本，各加入10微升牛磺酸胆红素作为内标，再加入80微升含1mg/ml BHT和206mmol/L抗坏血酸的甲醇：乙腈(1:1)溶液，10℃避光1450rpm振荡20分钟。4℃离心 力18000g离心20分钟。取60微升上清液到96孔板中，作为检测样本进行高效液相色谱串联质谱 检测。

全血03：取20微升样本，各加入10微升牛磺酸胆红素作为内标，再加入80微升含1mg/ml BHT和190mmol/L抗坏血酸的甲醇：乙腈(1:1)溶液，10℃避光1450rpm振荡20分钟。4℃离心 力18000g离心20分钟。取60微升上清液到96孔板中，作为检测样本进行高效液相色谱串联质谱 检测。

将以上经处理的样品，按照实施例1中LC-MS/MS条件进样检测；以内标校正、外标法定 量，检测结果如下表3。

表3 测量指标及测量结果

实施例3干血斑中胆红素成分的定性定量测定

干血斑样本制备

新生儿出生4天内采集指尖血制备干血片样本。步骤如下：

a)滤纸片预处理：将903滤纸片在含1mg/mL BHT和200mmol/L抗坏血酸的乙醇溶液中重 复浸泡2分钟，取出沥干，然后自然阴干滤纸片，备用。

b)准备：取合适试管，加适量稀释液。取微量吸管和乳胶吸头相连，检查连接处是否 漏气，或取一次性微量吸管(虹吸原理)，采血针，75％的乙醇或碘伏，棉签等备 用。

c)按摩：轻轻按摩左手无名指指端尺侧肌肉较多的中心部位，使局部组织自然充血。 避免使用手指侧面或指尖。

d)消毒：用75％乙醇或碘伏棉签擦拭采血部位，待其自然干燥。

e)针刺：用左手拇指、食指和中指固定采血部位使皮肤和皮下组织绷紧，右手持一次 性消毒采血针自指端腹尺侧刺入，深度2-3mm，立即出针。

f)拭血：待血液自然流出后，用无菌干棉球(棉签)擦去第一滴血。

g)吸血：用一次性微量吸管吸血或将血滴加在滤纸片上，然后用无菌干棉球(棉签) 压住伤口止血，如血流不畅，可用左手自采血部位远端向指端稍施压使血液流出。

h)收集好样本后立即做好患者标识，避免混淆。

i)阴凉处避光干燥4小时,放入铝箔袋中,4℃保存。

干血斑样品前处理

用打孔取样器在干血斑中取3粒干血斑，加入20微升纯水，用振荡器在1450rpm，10℃ 下振荡20min，加入10微升内标(牛磺酸胆红素)以及80微升含1mg/ml BHT和200mmol/L抗坏血 酸的甲醇：乙腈(1:1)溶液，后继续用振荡器在1450rpm，10℃下振荡20min，在离心力18000g,4℃ 下离心20min，取60微升上清液于96孔板，进样。

高效液相-串联质谱测定

测定条件如实施例1所示，测定的含量如下表4所示，方法学参数如表5所示。

表4 测量指标及含量测量结果

表5 方法学参数

实施例4稳定的胆红素定量检测试剂

本发明提供了稳定的胆红素定量检测试剂，包含胆红素标准品，所述胆红素标准品分 配于含有第一稳定剂和第二稳定剂的体系；所述胆红素包括游离胆红素、胆绿素、胆红素单 葡萄糖醛酸酯和胆红素双葡萄糖醛酸酯中之一种或几种。本实施例目的是示例性地提供一种稳 定的胆红素定量检测试剂，并对其制备方法和稳定性进行了研究。

稳定的胆红素定量检测试剂制备

滤纸片预处理：将分析滤纸片在含1mg/mL BHT和200mmol/L抗坏血酸的乙醇溶液中重复 浸泡2分钟，取出沥干，然后自然阴干滤纸片，4℃保存。

定量检测试剂制备：精确称取游离胆红素、胆绿素、胆红素单葡萄糖醛酸酯和胆红素 双葡萄糖醛酸酯分别溶解于乙醇，用一次性微量吸管吸取溶液分别滴加在滤纸片上，阴凉处避 光干燥4小时,放入铝箔袋中,4℃保存。

稳定性研究：采用实施例1测定条件，对放置如下天数的样品进行定量检测，结果如表 6。

表6

实施例5胆红素含量检测试剂盒

本发明提供了可用于胆红素定量检测的试剂盒，所述试剂盒的检测指标包括游离胆红 素、胆绿素、胆红素单葡萄糖醛酸酯和胆红素双葡萄糖醛酸酯中任一种的含量或几种的含量 或其总和。本实施例目的是示例性地提供一种胆红素含量检测试剂盒。

包含胆红素标准品，所述胆红素标准品分配于含有第一稳定剂和第二稳定剂的体系； 所述胆红素包括游离胆红素、胆绿素、胆红素单葡萄糖醛酸酯和胆红素双葡萄糖醛酸酯中之 一种或几种。本实施例目的是示例性地提供一种稳定的胆红素定量检测试剂，并对其制备方法 和稳定性进行了研究。

本实施例试剂盒组成如表7所示。

表7

其中所述含胆红素标准品的滤纸按照以下方法制备：

将分析滤纸片在含1mg/mL BHT和200mmol/L抗坏血酸的乙醇溶液中重复浸泡2分钟，取 出沥干，然后自然阴干滤纸片，4℃保存。精确称取游离胆红素、胆绿素、胆红素单葡萄糖醛 酸酯和胆红素双葡萄糖醛酸酯分别溶解于乙醇，用一次性微量吸管吸取溶液分别滴加在滤纸片 上，阴凉处避光干燥4小时,放入铝箔袋中,4℃保存。

实施例6新生儿胆道闭锁的筛查

本发明提供的技术方案使胆红素定量检测方法成为可能。所述胆红素含量检测方法和 胆红素含量检测试剂盒，可用于分别或同时测定几种胆红素、及任何检测目的的对游离胆红素、 胆绿素、胆红素单葡萄糖醛酸酯和胆红素双葡萄糖醛酸酯的定量检测。其可应用于与医疗相关 的诊断、风险评估等可用于对这些检测指标或一种或几种敏感的任何疾病或症状的诊断、风险 评估和药物治疗效果评估。

本实施例采用本发明技术方案应用于新生儿胆道闭锁筛查进行说明；同理可应用于其 他可能导致胆红素成分变化的疾病或症状的筛查、诊断、风险评估和治疗药物效果的监测。例 如，这些疾病或症状选自新生儿胆道闭锁，婴儿肝炎综合征、巨细胞病毒性肝炎、胆总管囊肿， α1抗胰蛋白酶缺乏疾病，Alagille综合症、囊性纤维化、全胃肠外营养相关的胆汁淤积等。

本实施例对正常新生儿和胆道闭锁新生儿血液样本中胆红素及其代谢产物的含量进行 了研究。本实施例中，采集了取自临床的新生儿胆道闭锁患者39例和正常新生儿对照300例的 血液样本，所采用的血液样本为出生4天内制备的干血斑。

干血斑样品制备

a)滤纸片预处理：将903滤纸片在含1mg/mL BHT和200mmol/L抗坏血酸的乙醇溶液中重 复浸泡2分钟，取出沥干，然后自然阴干滤纸片，备用。

b)准备：取合适试管，加适量稀释液。取微量吸管和乳胶吸头相连，检查连接处是否 漏气，或取一次性微量吸管(虹吸原理)，采血针，75％的乙醇或碘伏，棉签等备 用。

c)按摩：轻轻按摩左手无名指指端尺侧肌肉较多的中心部位，使局部组织自然充血。 避免使用手指侧面或指尖。

d)消毒：用75％乙醇或碘伏棉签擦拭采血部位，待其自然干燥。

e)针刺：用左手拇指、食指和中指固定采血部位使皮肤和皮下组织绷紧，右手持一次 性消毒采血针自指端腹尺侧刺入，深度2-3mm，立即出针。

f)拭血：待血液自然流出后，用无菌干棉球(棉签)擦去第一滴血。

g)吸血：用一次性微量吸管吸血或将血滴加在滤纸片上，然后用无菌干棉球(棉签) 压住伤口止血，如血流不畅，可用左手自采血部位远端向指端稍施压使血液流出。

h)收集好样本后立即做好患者标识，避免混淆。

i)阴凉处避光干燥4小时,放入铝箔袋中,4℃保存。

干血斑样品前处理

用打孔取样器在干血斑中取3粒干血斑，加入20微升纯水，用振荡器在1450rpm，10℃ 下振荡20min，加入10微升内标(牛磺酸胆红素)以及80微升含1mg/ml BHT和200mmol/L抗坏血 酸的甲醇：乙腈(1:1)溶液，后继续用振荡器在1450rpm，10℃下振荡20min，在离心力18000g,4℃ 下离心20min，取60微升上清液于96孔板，进样。

高效液相-串联质谱测定

测定条件如实施例1所示。测定结果显示，在胆道闭锁婴儿中，胆红素单葡萄糖醛酸酯 的均值为28μmol/L，最大值为82μmol/L，最小值为2.9μmol/L；在正常婴儿中，胆红素单葡 萄糖醛酸酯的均值为1.25μmol/L，最大值为3.10μmol/L，最小值为0.02μmol/L。取胆红素 单葡萄糖醛酸酯作为诊断指标，当截断值为2.5μmol/L时，得到胆红素单葡萄糖醛酸酯诊断胆 道闭锁的灵敏度为100％，特异性为95.2％。因此胆红素单葡萄糖醛酸酯的上调，有望作为新生 儿胆道闭锁的特征性检测指标，如附图5和附图6所示。

附图5为各代谢物区分胆道闭锁新生儿和正常新生儿对照的ROC曲线下面积。

附图6为一组散点图，显示了在胆道闭锁新生儿和正常新生儿检测样本中胆红素单葡萄 糖醛酸酯水平的差异。

实施例7胆道闭锁患者和其他胆汁淤积疾病患者的区分

本实施例采集26例胆道闭锁新生儿和40例其他疾病导致的胆汁淤积新生儿的血清样 本，按照实施例1高效液相色谱串联质谱方法检测血清样本中的胆红素单葡萄糖醛酸酯的含量。 检测结果显示，胆道闭锁患儿中胆红素单葡萄糖醛酸酯含量显著高于其他胆汁淤积婴儿(图5， P<0.0001)；其ROC曲线下面积达到0.90(95％CI＝0.83-0.97)，取截断值>75μmol/L，按照实 施例1中检测条件，其灵敏度达到84.6％(65.1％-95.6％)，特异性达到82.5％(67.2％-92.7％)， 因此胆红素单葡萄糖醛酸酯可以作为初步区分胆道闭锁和其他婴儿胆汁淤积症的诊断标记物。

实施例8胆红素单葡萄糖醛酸酯作为诊断标志物用于制备诊断工具

以上实施例发现可将胆红素单葡萄糖醛酸酯定量检测值作为指标用以区分正常新生儿、 胆道闭锁新生儿和其他原因导致的胆汁瘀积疾病新生儿。基于此创造性研究成果，本实施例的 目的是示例性地提供将胆红素单葡萄糖醛酸酯含量作为检测指标用于临床新生儿胆道闭锁的 早期筛查与诊断的应用途径。新生儿出生后如能快速、便捷、高效及相对准确地进行胆道闭锁 的筛查，对于高风险患儿迅速采取进一步医疗措施，将具有非常重要的意义。

为此，发明人基于应用目的，提出胆红素单葡萄糖醛酸酯可以作为诊断标志物用于制 备适当的工具，所述工具以胆红素葡萄糖醛酸酯作为诊断标志物，以其表达水平作为判定测试 对象胆道闭锁风险高低。所述工具可以是诊断产品或分析测试产品，作为具体实施例，本实施 例提供试剂盒作为诊断产品的一个示例，其包含胆红素单葡萄糖醛酸酯定量检测试剂，以及任 选地，还可包含对胆红素其他代谢成分进行定量检测的试剂，以及进一步包含对受试体的血液 样本进行处理的试剂，以及可进一步包含用于高效液相色谱串联质谱检测方法的检测试剂，如 内标准品，内标准品稀释液，应用于高效液相色谱的流动相试剂。

发明人探索了优选方案，所述试剂盒以干血斑作为检测样本。干血斑取样便利，有利 于新生儿出生后迅速进行胆道闭锁的筛查，进一步有利于新生儿出生后在早早期迅速进行胆道 闭锁筛查的大面积推广。从另外一方面，即使需要重新取样，因干血斑的制备技术成熟，取样 方便，对新生儿创伤小或几无创伤，即使在需要重复检测时，也是尤其有利的。

试剂盒通常包括至少一个用于保存标准品的容器。这个容器可能是单格的也可能是多 格的。例如，这个容器可以是一个多孔板(比如96孔板)，或其他类似的容器。在一些试剂盒中，这个容器也同样适合于诊断标志物在测定时使用。在一些试剂盒中，这个容器可以用 于标准品检测或者待测样本中生物标志物的仪器分析，如高效液相色谱串联质谱分析。

以下试剂盒作为具体实施方式之一：

表8 试剂盒组成

实施例9试剂盒的应用

本发明进一步研究了和验证了诊断试剂盒的应用。

本实施例中，发明人按照实施例1方法，采集已经被临床确诊的30例新生儿胆道闭锁 患者和562例正常新生儿的出生4天内制备的干血斑，结合实施例1中检测方法，以实施例3 中试剂盒所包含试剂检测干血斑中的胆红素单葡萄糖醛酸酯的含量。

检测结果如下表9所示，当取cutoff>2.5μmol/L(图7A)，其灵敏度达到100％(88.43％-100％)，特异性达到98.74％(97.42％-99.49％)(图7B)。可见新生儿干血斑中的胆红 素单葡萄糖醛酸酯的含量可以作为新生儿胆道闭锁风险评估的标志物是可靠的，实施例试剂盒 可用于评估新生儿胆道闭锁风险。

表9

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员， 在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明 的保护范围。