筛查结直肠癌和晚期腺瘤的试剂盒及其应用

摘要

本发明提供用于进行定量PCR的引物和探针的组合，所述定量PCR可以用于确定有需要的患者中BMP3基因和NDRG4基因的甲基化状态和水平，从而导致诊断有需要的患者中结直肠癌(CRC)和/或晚期腺瘤(AA)的存在或不存在的极高诊断特异性和灵敏度。提供用于进行所述诊断的组合物和方法。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求对2018年5月23日提交的中国专利申请序列号201810502359.7和2018年5月23日提交的中国专利申请序列号201810502387.9的优先权，所述申请出于所有目的通过引用以其整体并入本文。

技术领域

本发明涉及用于筛查结直肠癌和晚期腺瘤的组合物和方法以及其他应用。

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背景技术

结直肠癌(CRC)是世界上第四大常见的癌症，死亡率仅低于肺癌、肝癌和胃癌。CRC造成的年死亡人数接近700,000。CRC是“现代化”的疾病，发达国家的发病率高于发展中国家。在美国，结直肠癌仍是第二大死因(Clinical Interventions in Aging 2016；11:967-976)。在中国，自2000年起，随着人们生活标准的提高，CRC的发生率和死亡率日益增加(CACANCER J CLIN 2016；66:115-132)。患有早期局限性疾病(I期和II期)的患者的5年存活率接近90％，而患有晚期CRC的那些患者的存活率仅为13.1％。晚期CRC患者的治疗成本通常巨大，并且可能只是减轻疾病的症状(Clinical Interventions in Aging 2016；11:967-976)。

CRC的发展是个缓慢的过程，在早期通常无症状并且难以检测，直到肿瘤生长到几厘米大小，其可能阻塞排便并导致痉挛、疼痛或明显出血。CRC的发展经过多步骤过程，涉及随时间积累的一系列组织学、形态学和遗传学变化：即，从健康、增生、小型息肉、大型息肉和腺癌至癌症。息肉是在肠粘膜内局部生长或积累的异常细胞。息肉中的分裂细胞可以积累足够多的遗传变化以穿透肠壁并最终演变为CRC。然而，在超过十年的发展后，仅少数息肉演变为CRC。恶性潜在息肉的两个主要类型是腺瘤和无蒂锯齿状息肉(SSP)，它们各自以不同的风险发展为CRC。腺瘤发展为CRC的风险与其大小相关。通常，腺瘤的大小越大，发展为CRC的潜力越大。晚期腺瘤(AA)是指大小≥1cm或者具有≥25％的任何大小的绒毛状组分或高度发育异常。虽然大多数AA中只有约10％变为癌性，但60％-70％的CRC是从腺瘤发展而来，其余25％-35％的CRC是从SSP发展而来(Clinical Interventions in Aging 2016；11:967-976)。因此，及早发现CRC和AA并去除病灶可以有效阻断CRC的进程，以拯救患者的生命，显著提高患者的5年存活率，并且减少CRC晚期中昂贵的治疗成本，从而大大降低家庭和社会的经济负担。

现在，有几种测试用来检测CRC，主要包括结肠镜检查、乙状结肠镜检查、CT结肠成像术、大便潜血测试(FOBT)和粪便免疫化学测试(FIT)。

结肠镜检查检测CRC的灵敏度＞95％。其筛查间隔为每10年。结肠镜检查的优点是高灵敏度，它可以检查整个结肠，同时去除病灶。然而，它的缺点是侵入性检查，并且肠道准备会引起不适，并且患者需要镇静。在结肠镜检查期间存在肠穿孔和出血的风险。这些限制导致结肠镜检查筛查的低顺应性。

乙状结肠镜检查检测远端结肠的灵敏度高于95％。与FOBT组合，使用乙状结肠镜检查筛查CRC的间隔是每5年。使用乙状结肠镜检查筛查CRC的优点是高灵敏度，无需全身镇静，并且可以在检查期间同时去除病灶。它的缺点是半侵入性检查，检查期间容易引起不适，并且检查成本高。

CT结肠成像术使用辐射使结肠可视化，它的灵敏度＞90％并且每5年进行。它的优点在于，具有高灵敏度，可以观察整个结肠，并且无需镇静。缺点在于，所述测定是半侵入性检查，使得患者在筛查过程期间容易感到不舒服。另外，无法同时去除病灶，并且需要考虑辐射安全性。

总之，上述基于成像检测CRC的测试具有高灵敏度，但是它们昂贵，并且肠道准备容易引起不适和其他副作用。因此，患者顺应性低。另外，这些测定需要专门的设备，以及具有专业技能和丰富经验的医生，这些可能无法获得。因此，总体筛查/检测率低。另外，一些患者不适合进行这些测定。例如，糖尿病患者的肠道准备的成功率较低，并且副作用的风险较高(J Gastrointestin Liver Dis 2010；19:369-372,World J Gastrointest Endosc2013；5:39-46)。

FOBT和FIT分别通过酶反应和免疫化学方法检测患者粪便中的血红蛋白，对CRC检测的灵敏度分别为33％-75％和60％-85％，并且每1年进行所述测试。虽然FOBT和FIT易于推广，是非侵入性的并且成本低，但是癌前病灶的检测率低(Clinical Interventions inAging 2016；11 967-976)。

在息肉发展为CRC期间，在一些基因(如APC、KRAS、p53、BRAF、NDRG4、BMP3等)中，突变和甲基化变化积累(Clinical Interventions in Aging 2016；11:967-976)。因此，检测这些突变或甲基化变化有助于检测CRC和癌前病灶。

Zou等人(Clinical Chemistry 2012；58:2375-383)使用甲基化qPCR检测组织样品中BMP3、NDRG4、VIM和TFPI2基因的甲基化水平。在总共37例CRC组织样品中，测试25例腺瘤组织样品和29例健康人组织样品。在特异性为95％时，BMP3、NDRG4、VIM和TFPI2基因对CRC检测的灵敏度分别为84％、92％、86％和92％，并且对腺瘤检测的灵敏度分别为68％、76％、76％和88％。显示对结肠癌组织中的基因甲基化的检测具有高灵敏度和特异性。然而，组织取样方法难以广泛使用，因为取样过程会对患者身体造成一定损伤。因此，其不适于在一般人群中筛查CRC和癌前病灶。

多靶粪便DNA(mt-sDNA)测试包括肿瘤脱落细胞的甲基化和突变检测以及粪便样品中的血红蛋白检测，所述测试每3年进行筛查，并且具有高灵敏度、非侵入性和易于推广的优点(Clinical Interventions In Aging 2016；11:967-976)。作为筛查方法，mt-sDNA可以及早检测CRC和AA，从而大大提高患者的存活率。Imperiale等人(N Engl J Med 2014；370:1287-97)建立基于mt-sDNA的系统，用于BMP3和NDRG4基因的甲基化检测、KRAS基因的点突变检测和粪便血红蛋白检测，然后根据逻辑回归公式评估CRC和AA的风险。CRC和AA检测的灵敏度分别为92.3％和42.4％，并且特异性为86.6％。

应用mt-sDNA来筛查散发性CRC和AA，与结肠镜检查相比的优点是非侵入性，并且与FOBT和FIT相比的优点是更灵敏，但是AA检测的灵敏度仍然远低于CRC检测的灵敏度(Clinical Interventions in Aging 2016；11:967-976)。

目前，基于mt-sDNA的用于检测CRC或AA的产品如

虽然对检测来自患有CRC和AA的患者的粪便样品中BMP3和NDRG4基因的甲基化的方法进行过多项研究，但是关于亚洲人群的BMP3和NDRG4基因中的高甲基化CpG位点没有详细的综合性研究(ONCOLOGY LETTERS 2014；8:1751-1756；ONCOLOGY LETTERS 2015；9:1383-1387)。此外，由于样本量有限，对亚洲患者的BMP3和NDRG4基因甲基化的先前研究无益于鉴定与CRC和AA最相关的甲基化位点。因此，仍然需要确定亚洲人群的BMP3和NDRG4基因的高甲基化CpG位点的确切位置，以及基于这些甲基化CpG位点设计并优化试剂盒，从而使对AA的检测更灵敏。

发明内容

本公开文本提供由BMP3和NDRG4基因的启动子区域中的高甲基化CpG位点构成的DNA序列。

本公开文本还提供用于检测BMP3或NDRG4基因的甲基化的优选引物和探针，以及其用于检测BMP3和NDRG4基因二者的甲基化的组合。

本公开文本还提供用于检测亚洲人群的CRC和AA的试剂盒。由BMP3和NDRG4基因的启动子区域中的高甲基化CpG位点构成的DNA序列可以用作亚洲人群的CRC和/或AA检测的标记。

与其他引物和探针相比，用于检测BMP3和/或NDRG4基因的甲基化水平的优选引物对和探针具有显著更高的检测肿瘤组织(如CRC和AA，且尤其AA)的灵敏度和特异性。另外，本公开文本的这些优选引物和探针的组合还实现显著更高的检测肿瘤组织(如CRC和AA，且尤其AA)的灵敏度和特异性。

还提供基于上述优选引物和探针组合的用于检测亚洲人群的CRC和AA的试剂盒。

在一些实施方案中，所述试剂盒包含：(1)引物对和探针与相应qPCR试剂的优选组合；(2)用于检测KRAS基因编码区中的七种突变的引物和探针和相应的qPCR试剂；(3)用于检测粪便中的血红蛋白的试剂。

在一些实施方案中，根据逻辑回归公式对使用所述试剂盒从测定获得的结果进行校正和分析。在一些实施方案中，使用所述公式来计算用于确定CRC和/或AA的存在或不存在的值。在一些实施方案中，所述公式是P＝e

本公开文本提供用于检测有需要的患者中结直肠癌(CRC)或晚期腺瘤(AA)的存在或不存在的试剂盒。有需要的患者是怀疑患有CRC和/或AA的患者，如具有患上CRC和/或AA的至少一种体征的患者，或具有发生CRC和/或AA的风险的患者，或进行了常规医疗检查但在其他方面没有体征或风险的受试者。

在一些实施方案中，试剂盒包含a)第一引物对和第一探针，其用于检测从患者获得的生物样品中BMP3基因的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态或水平。在一些实施方案中，第一引物对和第一探针各自包含与SEQ ID NO.:1相同、互补、或在严格杂交条件下杂交的至少16个核苷酸的连续序列。

在一些实施方案中，试剂盒包含b)用于检测从患者获得的生物样品中NDRG4基因的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态或水平的第二引物对和第二探针。在一些实施方案中，第二引物对和第二探针各自包含与SEQ ID NO.:2相同、互补或在严格杂交条件下杂交的至少16个核苷酸的连续序列。

在一些实施方案中，第一引物对和第一探针选自：

i)包含SEQ ID NO.:3的正向引物、包含SEQ ID NO.:4的反向引物和包含SEQ IDNO.:5的探针；

ii)包含SEQ ID NO.:9的正向引物、包含SEQ ID NO.:10的反向引物和包含SEQ IDNO.:11的探针；以及

iii)包含SEQ ID NO.:15的正向引物、包含SEQ ID NO.:16的反向引物和包含SEQID NO.:17的探针；

在一些实施方案中，其中第二第一引物对和第二探针选自：

iv)包含SEQ ID NO.:6的正向引物、包含SEQ ID NO.:7的反向引物和包含SEQ IDNO.:8的探针；

v)包含SEQ ID NO.:12的正向引物、包含SEQ ID NO.:13的反向引物和包含SEQ IDNO.:14的探针；以及

vi)包含SEQ ID NO.:18的正向引物、包含SEQ ID NO.:19的反向引物和包含SEQID NO.:20的探针。

在一些实施方案中，所述试剂盒包含：

i)包含SEQ ID NO.:3的正向引物、包含SEQ ID NO.:4的反向引物和包含SEQ IDNO.:5的探针，其用于检测从所述患者获得的生物样品中BMP3基因的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态或水平，以及

ii)包含SEQ ID NO.:6的正向引物、包含SEQ ID NO.:7的反向引物和包含SEQ IDNO.:8的探针，其用于检测从所述患者获得的生物样品中NDRG4基因的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态或水平。

在一些实施方案中，所述试剂盒包含：

i)包含SEQ ID NO.:9的正向引物、包含SEQ ID NO.:10的反向引物和包含SEQ IDNO.:11的探针，其用于检测从所述患者获得的生物样品中BMP3基因的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态或水平，以及

ii)包含SEQ ID NO.:12的正向引物、包含SEQ ID NO.:13的反向引物和包含SEQID NO.:14的探针，其用于检测从所述患者获得的生物样品中NDRG4基因的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态或水平。

在一些实施方案中，所述试剂盒包含：

i)包含SEQ ID NO.:15的正向引物、包含SEQ ID NO.:16的反向引物和包含SEQ IDNO.:17的探针，其用于检测从所述患者获得的生物样品中BMP3基因的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态或水平，以及

ii)包含SEQ ID NO.:18的正向引物、包含SEQ ID NO.:19的反向引物和包含SEQID NO.:20的探针，其用于检测从所述患者获得的生物样品中NDRG4基因的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态或水平。

在一些实施方案中，第一探针和第二探针二者包含荧光供体和受体荧光团。

在一些实施方案中，第一探针和第二探针是

在一些实施方案中，所述试剂盒还包含：

(1)用于检测所述患者中KRAS基因中至少一种突变的存在或不存在的构件；以及

(2)用于检测从所述患者获得的生物样品中血红蛋白的存在或不存在的构件。

在一些实施方案中，用于检测患者中KRAS基因中至少一种突变的存在或不存在的构件包含能够在聚合酶链式反应(PCR)中扩增KRAS基因的外显子12和/或外显子13区域的至少一对引物。

在一些实施方案中，用于检测生物样品中血红蛋白的存在或不存在的构件包含抗血红蛋白抗体。

在一些实施方案中，引物能够扩增包含选自以下的至少一个KRAS突变的KRAS基因区域：G12D、G12V、G12C、G13D、G12A、G12R、G12S和G13C。

在一些实施方案中，抗体是胶体金缀合的抗体。

在一些实施方案中，试剂盒还包含用于扩增内部质量控制基因的构件。内部对照可以检测(1)来自样品或提取方法的污染抑制，(2)检测仪器故障，(3)化学失效(例如，过期或降解的试剂盒或组分，或假的试剂组合)，以及(4)人为失误。在一些实施方案中，内部对照基因是阳性对照，如阳性对照样品中已经确定具有甲基化的基因。在一些实施方案中，内部对照基因是阴性对照，如阴性对照样品中已经确定没有甲基化的基因。

在一些实施方案中，试剂盒还包含用于使用试剂盒和/或解释通过使用试剂盒获得的测试结果的说明。

在一些实施方案中，试剂盒还包含用于检测由抗体和生物样品中的血红蛋白形成的复合物的构件。

在一些实施方案中，从患者获得的生物样品是粪便样品。

在一些实施方案中，试剂盒还包含亚硫酸氢盐试剂，以及适合于将亚硫酸氢盐试剂与患者的生物样品或从生物样品获得的多核苷酸混合的容器。

在一些实施方案中，代替使用亚硫酸氢盐，试剂盒还包含甲基化敏感性限制性酶试剂。

在一些实施方案中，所述试剂盒还包含：(1)用于检测生物样品中的BMP3甲基化的阳性标准品和阴性标准品，以及(2)用于检测生物样品中的NDRG4甲基化的阳性标准品和阴性标准品。

在一些实施方案中，用于检测BMP3甲基化的阳性标准品包含以下的多核苷酸序列：

GTTAGTTTGGTCGGGTGTTTTTAAAAATAAAGCGAGGAGGGAAGGTATAGATAGATTTTGAAAATATTCGGGTTATATACGTCGCGATTTATAGTTTTTTTTTAGCGTTGGAGTGGAGACGGCGTTCGTAGCGTTTTGCGCGGGTGAGGTTCGCGTAGTTGTTGGGGAAGAGTTTATTTGTTAGGTTGCGTTGGGTTAGCGTAGTAAGTGGGGTTGGTCGTTATTTCGTTGTATTCGGTCGCGTTTCGGGTTTCGTGCGTTTTCGTTTTAG(SEQ ID NO:67)；

在一些实施方案中，用于检测BMP3甲基化的阴性标准品包含以下的多核苷酸序列：

GTTAGTTTGGTTGGGTGTTTTTAAAAATAAAGTGAGGAGGGAAGGTATAGATAGATTTTGAAAATATTTGGGTTATATATGTTGTGATTTATAGTTTTTTTTTAGTGTTGGAGTGGAGATGGTGTTTGTAGTGTTTTGTGTGGGTGAGGTTTGTGTAGTTGTTGGGGAAGAGTTTATTTGTTAGGTTGTGTTGGGTTAGTGTAGTAAGTGGGGTTGGTTGTTATTTTGTTGTATTTGGTTGTGTTTTGGGTTTTGTGTGTTTTTGTTTTAG(SEQ ID NO:68)；

在一些实施方案中，用于检测NDRG4甲基化的阳性标准品包含以下的多核苷酸序列：

TGAGAAGTCGGCGGGGGCGCGGATCGATCGGGGTGTTTTTTAGGTTTCGCGTCGCGGTTTTCGTTCGTTTTTTCGTTCGTTTATCGGGTATTTTAGTCGCGTAGAAGGCGGAAGTTACGCGCGAGGGATCGCGGTTCGTTCGGGATTAGTTTTAGGTTCGGTATCGTTTCGCGGGTCGAGCGTTTATATTCGTTAAATTTACGCGGGTACGTTTTCGCGGCGTATCGTTTTTAGTT(SEQ ID NO.:69)。

在一些实施方案中，用于检测NDRG4甲基化的阴性标准品包含以下的多核苷酸序列：

TGAGAAGTTGGTGGGGGTGTGGATTGATTGGGGTGTTTTTTAGGTTTTGTGTTGTGGTTTTTGTTTGTTTTTTTGTTTGTTTATTGGGTATTTTAGTTGTGTAGAAGGTGGAAGTTATGTGTGAGGGATTGTGGTTTGTTTGGGATTAGTTTTAGGTTTGGTATTGTTTTGTGGGTTGAGTGTTTATATTTGTTAAATTTATGTGGGTATGTTTTTGTGGTGTATTGTTTTTAGTT(SEQ ID NO.:70)。

还提供检测有需要的患者中结直肠癌(CRC)或晚期腺瘤(AA)的存在或不存在的方法。

在一些实施方案中，所述方法包括a)从患者的生物样品获得基因组DNA。

在一些实施方案中，所述方法还包括b)用一种或多种试剂处理a)的基因组DNA或其片段，以将其未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或在杂交特性方面与胞嘧啶可检测地不同的另一种碱基。

在一些实施方案中，所述方法还包括c)使处理的基因组DNA或其处理的片段与用于检测患者中编码骨形态发生蛋白3(BMP3)的基因的甲基化位点的存在或不存在的第一引物对接触。在一些实施方案中，所述方法还包括使处理的基因组DNA或其片段与用于检测患者中编码NDRG家族成员4蛋白(NDRG4)的基因的甲基化位点的存在或不存在的第二引物对接触。

在一些实施方案中，第一引物对包含与SEQ ID NO.:1相同、互补、或在严格杂交条件下杂交的至少9个核苷酸的连续序列。在一些实施方案中，第二引物对包含与SEQ IDNO.:2互补或在严格杂交条件下杂交的至少9个核苷酸的连续序列。

在一些实施方案中，将处理的基因组DNA或其片段通过第一引物对或第二引物对扩增以产生至少一种扩增物，或者不进行扩增。

在一些实施方案中，所述方法还包括d)基于患者中所述扩增物的存在或不存在、BMP3基因和NDRG4基因的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态或水平，确定患者中CRC或AA的存在或不存在。

在一些实施方案中，使用定量PCR扩增样品中的甲基化BMP3基因。在一些实施方案中，使用定量PCR扩增样品中的甲基化NDRG4基因。

在一些实施方案中，所述方法还包括使用引物扩增参考基因(也称为归一化子、持家基因或内源对照)。在一些实施方案中，使用定量PCR扩增样品中的参考基因。

在一些实施方案中，第一引物对和第一探针选自：

i)包含SEQ ID NO.:3的正向引物、包含SEQ ID NO.:4的反向引物和包含SEQ IDNO.:5的探针；

ii)包含SEQ ID NO.:9的正向引物、包含SEQ ID NO.:10的反向引物和包含SEQ IDNO.:11的探针；以及

iii)包含SEQ ID NO.:15的正向引物、包含SEQ ID NO.:16的反向引物和包含SEQID NO.:17的探针。

在一些实施方案中，第二第一引物对和第二探针选自：

iv)包含SEQ ID NO.:6的正向引物、包含SEQ ID NO.:7的反向引物和包含SEQ IDNO.:8的探针；

v)包含SEQ ID NO.:12的正向引物、包含SEQ ID NO.:13的反向引物和包含SEQ IDNO.:14的探针；以及

vi)包含SEQ ID NO.:18的正向引物、包含SEQ ID NO.:19的反向引物和包含SEQID NO.:20的探针。

在一些实施方案中，所述方法包括使用

i)包含SEQ ID NO.:3的正向引物、包含SEQ ID NO.:4的反向引物和包含SEQ IDNO.:5的探针，其用于检测从所述患者获得的生物样品中BMP3基因的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态或水平，以及

ii)包含SEQ ID NO.:6的正向引物、包含SEQ ID NO.:7的反向引物和包含SEQ IDNO.:8的探针，其用于检测从所述患者获得的生物样品中NDRG4基因的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态或水平。

在一些实施方案中，所述方法包括使用

i)包含SEQ ID NO.:9的正向引物、包含SEQ ID NO.:10的反向引物和包含SEQ IDNO.:11的探针，其用于检测从所述患者获得的生物样品中BMP3基因的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态或水平，以及

ii)包含SEQ ID NO.:12的正向引物、包含SEQ ID NO.:13的反向引物和包含SEQID NO.:14的探针，其用于检测从所述患者获得的生物样品中NDRG4基因的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态或水平。

在一些实施方案中，所述方法包括使用

i)包含SEQ ID NO.:15的正向引物、包含SEQ ID NO.:16的反向引物和包含SEQ IDNO.:17的探针，其用于检测从所述患者获得的生物样品中BMP3基因的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态或水平，以及

ii)包含SEQ ID NO.:18的正向引物、包含SEQ ID NO.:19的反向引物和包含SEQID NO.:20的探针，其用于检测从所述患者获得的生物样品中NDRG4基因的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态或水平。

在一些实施方案中，第一探针和第二探针二者包含荧光供体和受体荧光团。在一些实施方案中，第一探针和第二探针是

在一些实施方案中，所述方法还包括检测从患者获得的生物样品中KRAS基因的至少一个突变的存在或不存在的步骤。

在一些实施方案中，所述方法还包括检测从患者获得的生物样品中血红蛋白的存在或不存在的步骤。在一些实施方案中，检测生物样品中血红蛋白的存在或不存在的步骤包括使用抗血红蛋白抗体。在一些实施方案中，抗体是胶体金缀合的抗体。

在一些实施方案中，检测患者中KRAS基因中至少一种突变的存在或不存在的步骤包括使用能够在聚合酶链式反应(PCR)中扩增KRAS基因的外显子12和/或外显子13区域的至少一对引物。在一些实施方案中，引物能够扩增包含选自以下的至少一个KRAS突变的KRAS基因区域：G12D、G12V、G12C、G13D、G12A、G12R、G12S和G13C。

在一些实施方案中，通过选自以下的一对或多对引物扩增突变体KRAS基因：

(1)包含SEQ ID NO.:35的正向引物G12D-F，和包含SEQ ID NO.:42的反向引物Kras-R；

(2)包含SEQ ID NO.:36的正向引物G13D-F，和包含SEQ ID NO.:42的反向引物Kras-R；

(3)包含SEQ ID NO.:37的正向引物G12V-F，和包含SEQ ID NO.:42的反向引物Kras-R；

(4)包含SEQ ID NO.:38的正向引物G12C-F，和包含SEQ ID NO.:42的反向引物Kras-R；

(5)包含SEQ ID NO.:39的正向引物G12S-F，和包含SEQ ID NO.:42的反向引物Kras-R；

(6)包含SEQ ID NO.:40的正向引物G12A-F，和包含SEQ ID NO.:42的反向引物Kras-R；以及

(7)包含SEQ ID NO.:41的正向引物G12R-F，和包含SEQ ID NO.:42的反向引物Kras-R。

在一些实施方案中，用于qPCR的KRAS探针包含SEQ ID NO.:46。

在一些实施方案中，在定量PCR(qPCR)中进行BMP3基因的扩增，并且所述方法还包括扩增第一参考基因(即，第一参考基因)以将BMP3扩增的Ct值确定为ΔCt1。

在一些实施方案中，在定量PCR(qPCR)中进行NDRG4基因的扩增，并且所述方法还包括扩增第二参考基因(即，第二参考基因)以将NDRG4扩增的Ct值确定为ΔCt2。

在一些实施方案中，在定量PCR(qPCR)中进行突变体KRAS基因的扩增，并且所述方法还包括扩增第三参考基因(即，第三参考基因)以将突变体KRAS扩增的Ct值确定为ΔCt3。

在一些实施方案中，第一参考基因与第二参考基因是相同的。在一些实施方案中，相同的参考基因是B2M基因。

在一些实施方案中，第三参考基因是ACTB基因。在一些实施方案中，用于扩增ACTB基因的qPCR引物包含SEQ ID NO.:43和44，并且探针包含SEQ ID NO.:46。

在一些实施方案中，所述方法包括使用(1)用于检测样品中的BMP3甲基化的阳性标准品和阴性标准品，以及(2)用于检测样品中的NDRG4甲基化的阳性标准品和阴性标准品。

在一些实施方案中，用于检测BMP3甲基化的阳性标准品包含以下的多核苷酸序列：

GTTAGTTTGGTCGGGTGTTTTTAAAAATAAAGCGAGGAGGGAAGGTATAGATAGATTTTGAAAATATTCGGGTTATATACGTCGCGATTTATAGTTTTTTTTTAGCGTTGGAGTGGAGACGGCGTTCGTAGCGTTTTGCGCGGGTGAGGTTCGCGTAGTTGTTGGGGAAGAGTTTATTTGTTAGGTTGCGTTGGGTTAGCGTAGTAAGTGGGGTTGGTCGTTATTTCGTTGTATTCGGTCGCGTTTCGGGTTTCGTGCGTTTTCGTTTTAG(SEQ ID NO:67)；

在一些实施方案中，用于检测BMP3甲基化的阴性标准品包含以下的多核苷酸序列：

GTTAGTTTGGTTGGGTGTTTTTAAAAATAAAGTGAGGAGGGAAGGTATAGATAGATTTTGAAAATATTTGGGTTATATATGTTGTGATTTATAGTTTTTTTTTAGTGTTGGAGTGGAGATGGTGTTTGTAGTGTTTTGTGTGGGTGAGGTTTGTGTAGTTGTTGGGGAAGAGTTTATTTGTTAGGTTGTGTTGGGTTAGTGTAGTAAGTGGGGTTGGTTGTTATTTTGTTGTATTTGGTTGTGTTTTGGGTTTTGTGTGTTTTTGTTTTAG(SEQ ID NO:68)；

在一些实施方案中，用于检测NDRG4甲基化的阳性标准品包含以下的多核苷酸序列：

TGAGAAGTCGGCGGGGGCGCGGATCGATCGGGGTGTTTTTTAGGTTTCGCGTCGCGGTTTTCGTTCGTTTTTTCGTTCGTTTATCGGGTATTTTAGTCGCGTAGAAGGCGGAAGTTACGCGCGAGGGATCGCGGTTCGTTCGGGATTAGTTTTAGGTTCGGTATCGTTTCGCGGGTCGAGCGTTTATATTCGTTAAATTTACGCGGGTACGTTTTCGCGGCGTATCGTTTTTAGTT(SEQ ID NO.:69)。

在一些实施方案中，用于检测NDRG4甲基化的阴性标准品包含以下的多核苷酸序列：

TGAGAAGTTGGTGGGGGTGTGGATTGATTGGGGTGTTTTTTAGGTTTTGTGTTGTGGTTTTTGTTTGTTTTTTTGTTTGTTTATTGGGTATTTTAGTTGTGTAGAAGGTGGAAGTTATGTGTGAGGGATTGTGGTTTGTTTGGGATTAGTTTTAGGTTTGGTATTGTTTTGTGGGTTGAGTGTTTATATTTGTTAAATTTATGTGGGTATGTTTTTGTGGTGTATTGTTTTTAGTT(SEQ ID NO.:70)。

在一些实施方案中，所述方法包括扩增质量控制标准品。

在一些实施方案中，检测有需要的患者中结直肠癌(CRC)或晚期腺瘤(AA)的存在或不存在的方法，所述方法包括使用本公开文本的试剂盒。

本公开文本还提供检测有需要的患者中结直肠癌(CRC)或晚期腺瘤(AA)的存在或不存在的方法，所述方法包括：

a)从所述患者的粪便样品获得未处理的基因组DNA；

b)用一种或多种试剂处理a)的基因组DNA或其片段，以将其未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或在杂交特性方面与胞嘧啶可检测地不同的另一种碱基；

c)使用b)的处理的基因组DNA作为模板进行定量PCR(qPCR)，并将所述患者中BMP3基因的Ct值确定为△Ct1；

d)使用b)的处理的基因组DNA作为模板进行qPCR，并将所述患者中NDRG4基因的Ct值确定为△Ct2；

e)使用未处理的基因组DNA作为模板进行qPCR，并将所述患者中突变体KRAS基因的Ct值确定为△Ct3；

f)对所述粪便样品中的血红蛋白进行粪便免疫化学测试并将得分确定为FIT；

g)确定K值，其中K＝a*△Ct1+b*△Ct2+c*△Ct3+d*FIT+X，其中a、b、c、d、X是临床常数；并且

h)确定综合指数P的值，其中P＝e

临床常数a、b、c、d和X可以通过分析患者人群中的临床数据分布来确定。

在一些实施方案中，在P等于或大于预定阈值时，确定患者患有CRC和/或AA，并且在P小于预定阈值时，确定患者是健康的。

在一些实施方案中，预定阈值是从临床数据分布来计算，如从已经确定患有CRC和/或AA的患者和已经确定未患CRC和/或AA的患者获得的临床数据。

在一些实施方案中，用于扩增BMP3基因的qPCR包括第一引物对和第一探针，其中所述第一引物对和所述第一探针选自：

i)包含SEQ ID NO.:3的正向引物、包含SEQ ID NO.:4的反向引物和包含SEQ IDNO.:5的探针；

ii)包含SEQ ID NO.:9的正向引物、包含SEQ ID NO.:10的反向引物和包含SEQ IDNO.:11的探针；以及

iii)包含SEQ ID NO.:15的正向引物、包含SEQ ID NO.:16的反向引物和包含SEQID NO.:17的探针。

在一些实施方案中，用于扩增NDRG4基因的qPCR包括第二引物对和第二探针，其中所述第二引物对和所述第二探针选自：

iv)包含SEQ ID NO.:6的正向引物、包含SEQ ID NO.:7的反向引物和包含SEQ IDNO.:8的探针；

v)包含SEQ ID NO.:12的正向引物、包含SEQ ID NO.:13的反向引物和包含SEQ IDNO.:14的探针；以及

vi)包含SEQ ID NO.:18的正向引物、包含SEQ ID NO.:19的反向引物和包含SEQID NO.:20的探针。

在一些实施方案中，所述方法包括使用

i)包含SEQ ID NO.:3的正向引物、包含SEQ ID NO.:4的反向引物和包含SEQ IDNO.:5的探针，其用于检测所述样品中BMP3基因的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态或水平，以及

ii)包含SEQ ID NO.:6的正向引物、包含SEQ ID NO.:7的反向引物和包含SEQ IDNO.:8的探针，其用于检测所述样品中NDRG4基因的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态或水平。

在一些实施方案中，所述方法包括使用

i)包含SEQ ID NO.:9的正向引物、包含SEQ ID NO.:10的反向引物和包含SEQ IDNO.:11的探针，其用于检测所述样品中BMP3基因的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态或水平，以及

ii)包含SEQ ID NO.:12的正向引物、包含SEQ ID NO.:13的反向引物和包含SEQID NO.:14的探针，其用于检测所述样品中NDRG4基因的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态或水平。

在一些实施方案中，所述方法包括使用

i)包含SEQ ID NO.:15的正向引物、包含SEQ ID NO.:16的反向引物和包含SEQ IDNO.:17的探针，其用于检测所述样品中BMP3基因的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态或水平，以及

ii)包含SEQ ID NO.:18的正向引物、包含SEQ ID NO.:19的反向引物和包含SEQID NO.:20的探针，其用于检测所述样品中NDRG4基因的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态或水平。

在一些实施方案中，第一探针和第二探针二者包含荧光供体和受体荧光团。在一些实施方案中，第一探针和第二探针是

在一些实施方案中，突变体KRAS基因包含选自以下的至少一个KRAS突变：G12D、G12V、G12C、G13D、G12A、G12R、G12S和G13C。

在一些实施方案中，粪便免疫化学测试包括胶体金缀合的抗体。

在一些实施方案中，所述方法的步骤c)和步骤d)包括使用B2M基因作为参考基因。

在一些实施方案中，所述方法包括使用

(1)用于检测所述样品中的BMP3甲基化的阳性标准品和阴性标准品，以及

(2)用于检测所述样品中的NDRG4甲基化的阳性标准品和阴性标准品。

在一些实施方案中，用于检测BMP3甲基化的阳性标准品包含以下的多核苷酸序列：

GTTAGTTTGGTCGGGTGTTTTTAAAAATAAAGCGAGGAGGGAAGGTATAGATAGATTTTGAAAATATTCGGGTTATATACGTCGCGATTTATAGTTTTTTTTTAGCGTTGGAGTGGAGACGGCGTTCGTAGCGTTTTGCGCGGGTGAGGTTCGCGTAGTTGTTGGGGAAGAGTTTATTTGTTAGGTTGCGTTGGGTTAGCGTAGTAAGTGGGGTTGGTCGTTATTTCGTTGTATTCGGTCGCGTTTCGGGTTTCGTGCGTTTTCGTTTTAG(SEQ ID NO:67)。

在一些实施方案中，用于检测BMP3甲基化的阴性标准品包含以下的多核苷酸序列：

GTTAGTTTGGTTGGGTGTTTTTAAAAATAAAGTGAGGAGGGAAGGTATAGATAGATTTTGAAAATATTTGGGTTATATATGTTGTGATTTATAGTTTTTTTTTAGTGTTGGAGTGGAGATGGTGTTTGTAGTGTTTTGTGTGGGTGAGGTTTGTGTAGTTGTTGGGGAAGAGTTTATTTGTTAGGTTGTGTTGGGTTAGTGTAGTAAGTGGGGTTGGTTGTTATTTTGTTGTATTTGGTTGTGTTTTGGGTTTTGTGTGTTTTTGTTTTAG(SEQ ID NO:68)。

在一些实施方案中，用于检测NDRG4甲基化的阳性标准品包含以下的多核苷酸序列：

TGAGAAGTCGGCGGGGGCGCGGATCGATCGGGGTGTTTTTTAGGTTTCGCGTCGCGGTTTTCGTTCGTTTTTTCGTTCGTTTATCGGGTATTTTAGTCGCGTAGAAGGCGGAAGTTACGCGCGAGGGATCGCGGTTCGTTCGGGATTAGTTTTAGGTTCGGTATCGTTTCGCGGGTCGAGCGTTTATATTCGTTAAATTTACGCGGGTACGTTTTCGCGGCGTATCGTTTTTAGTT(SEQ ID NO.:69)。

在一些实施方案中，用于检测NDRG4甲基化的阴性标准品包含以下的多核苷酸序列：

TGAGAAGTTGGTGGGGGTGTGGATTGATTGGGGTGTTTTTTAGGTTTTGTGTTGTGGTTTTTGTTTGTTTTTTTGTTTGTTTATTGGGTATTTTAGTTGTGTAGAAGGTGGAAGTTATGTGTGAGGGATTGTGGTTTGTTTGGGATTAGTTTTAGGTTTGGTATTGTTTTGTGGGTTGAGTGTTTATATTTGTTAAATTTATGTGGGTATGTTTTTGTGGTGTATTGTTTTTAGTT(SEQ ID NO.:70)。

在一些实施方案中，所述方法包括在步骤c)和步骤d)中扩增质量控制标准品。

还提供在有需要的患者中诊断和治疗结直肠癌(CRC)和/或晚期腺瘤(AA)的方法，所述方法包括通过使用本公开文本的试剂盒确定患者中CRC和/或AA的存在或不存在，以及根据所述患者中CRC和/或AA的存在或不存在治疗所述患者。

还提供在有需要的患者中诊断和治疗结直肠癌(CRC)和/或晚期腺瘤(AA)的方法，所述方法包括通过使用本文所述的方法确定患者中CRC和/或AA的存在或不存在，并且根据所述患者中CRC和/或AA的存在或不存在治疗所述患者。

附图说明

图1A至图1D描绘CpG岛预测的结果以及两种基因BMP3和NDRG4的扩增子的相对位置。“Y”、“R”是简并碱基。图1A-BMP3基因的启动子区域的CpG岛预测的结果；图1B-BMP3基因的扩增子的相对位置；图1C-NDRG4基因的启动子区域的CpG岛预测的结果；图1D-NDRG4基因的扩增子的相对位置。

图2A描绘白种人群与亚洲人群中BMP的甲基化CpG位点的差异。图2B描绘白种人群与亚洲人群中NDRG4基因的甲基化CpG位点的差异。

图3A描绘使用优选组1中的引物和探针得到的BMP3的分析灵敏度扩增曲线。图3B描绘使用优选组1中的引物和探针得到的NDRG4的分析灵敏度扩增曲线。图3C描绘使用优选组2中的引物和探针得到的BMP3的分析灵敏度扩增曲线。图3D描绘使用优选组2中的引物和探针得到的NDRG4的分析灵敏度扩增曲线。图3E描绘使用优选组3中的引物和探针得到的BMP3的分析灵敏度扩增曲线。图3F描绘使用优选组3中的引物和探针得到的NDRG4的分析灵敏度扩增曲线。图3G描绘使用比较组1中的引物和探针得到的BMP3的分析灵敏度扩增曲线。图3H描绘使用比较组1中的引物和探针得到的NDRG4的分析灵敏度扩增曲线。图3I描绘使用比较组2中的引物和探针得到的BMP3的分析灵敏度扩增曲线。图3J描绘使用比较组2中的引物和探针得到的NDRG4的分析灵敏度扩增曲线。图3K描绘使用比较组3中的引物和探针得到的BMP3的分析灵敏度扩增曲线。图3L描绘使用比较组3中的引物和探针得到的NDRG4的分析灵敏度扩增曲线。

图4A描绘使用优选组1中的引物和探针得到的BMP3的分析特异性扩增曲线。图4B描绘使用优选组1中的引物和探针得到的NDRG4的分析特异性扩增曲线。图4C描绘使用优选组2中的引物和探针得到的BMP3的分析特异性扩增曲线。图4D描绘使用优选组2中的引物和探针得到的NDRG4的分析特异性扩增曲线。图4E描绘使用优选组3中的引物和探针得到的BMP3的分析特异性扩增曲线。图4F描绘使用优选组3中的引物和探针得到的NDRG4的分析特异性扩增曲线。图4G描绘使用比较组1中的引物和探针得到的BMP3的分析特异性扩增曲线。图4H描绘使用比较组1中的引物和探针得到的NDRG4的分析特异性扩增曲线。图4I描绘使用比较组2中的引物和探针得到的BMP3的分析特异性扩增曲线。图4J描绘使用比较组2中的引物和探针得到的NDRG4的分析特异性扩增曲线。图4K描绘使用比较组3中的引物和探针得到的BMP3的分析特异性扩增曲线。图4L描绘使用比较组3中的引物和探针得到的NDRG4的分析特异性扩增曲线。

图5A至图5C分别描绘使用优选组1、优选组2和优选组3中的引物和探针的扩增曲线，用于检测临床样品中的BMP3甲基化。图5D至图5F分别描绘使用比较组1、比较组2和比较组3中的引物和探针的扩增曲线，用于检测相同测定中的BMP3甲基化。

图6A至图6C分别描绘使用优选组1、优选组2和优选组3中的引物和探针的扩增曲线，用于检测临床样品中的NDRG4甲基化。图6D至图6F分别描绘使用比较组1、比较组2和比较组3中的引物和探针的扩增曲线，用于检测相同测定中的NDRG4甲基化。

具体实施方式

定义

提及“一个实施方案(one embodiment)”、“一个实施方案(an embodiment)”、“一个例子(one example)”和“一个例子(an example)”时表明，如此描述的一个或多个实施方案或一个或多个例子可以包括特定特征、结构、特点、特性、要素或限制，但并非每个实施方案或例子都一定包括该特定特征、结构、特点、特性、要素或限制。另外，重复使用的短语“在一个实施方案中”并不一定是指同一个实施方案，即使它可能是指同一个实施方案。

如本文所用的“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”意指共价连接在一起的至少两个核苷酸。单链的描述也定义互补链的序列。因此，核酸也涵盖所述单链的互补链。核酸的多种变体可以用于与给定核酸相同的目的。因此，核酸也涵盖基本上相同的核酸及其互补体。单链提供可以在严格杂交条件下与靶序列杂交的探针。因此，核酸也涵盖在严格杂交条件下杂交的探针。核酸可以是单链的或双链的，或者可以含有双链和单链序列二者的部分。核酸可以是DNA(基因组DNA和cDNA二者)、RNA或杂合体，其中核酸可以含有脱氧核糖核苷酸与核糖核苷酸的组合，以及包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤的碱基的组合。可以通过化学合成方法或通过重组方法获得核酸。

如本文所用，短语“有需要的受试者”是指动物或人受试者，已知其患有癌症，或者具有患上癌症的风险(例如，遗传上易感的受试者、具有医学和/或家族癌症病史的受试者、已经暴露于致癌物、职业危害、环境危害的受试者)，和/或展现可疑的癌症临床体征(例如，便血或黑粪症、不明原因的疼痛、出汗、不明原因的发热、不明原因的体重减轻直到厌食症、排便习惯的变化(便秘和/或腹泻)、里急后重(tenesmus)(排便不尽感，特别是对于直肠癌)、贫血和/或全身无力)的受试者。另外地或可替代地，有需要的受试者可以是经历常规健康检查的健康人受试者。

如本文所用，术语“约”是指±10％。

短语“本质上由……组成”意指，组合物或方法可以包括另外的成分和/或步骤，但前提是所述另外的成分和/或步骤不会实质性地改变要求保护的组合物或方法的基础和新颖特征。

如本文所用，单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述(the)”包括复数指示物，除非上下文明确另外指明。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可以包括多种化合物，包括其混合物。

如本文所用的“严格杂交条件”意指如下条件：在所述条件下第一核酸序列(例如，探针)将与第二核酸序列(例如，靶标)杂交，如在核酸的复杂混合物中。严格条件是序列依赖性的，并且将在不同情况下是不同的。严格条件可以被选择比特定序列在限定的离子强度pH下的热熔点(T

如本文所用“基本上互补的”意指，第一序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个核苷酸的区域上与第二序列的互补体至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同，或者两个序列在严格杂交条件下杂交。

如本文所用的“基本上相同”意指，第一序列与第二序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个核苷酸或氨基酸的区域上至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同，或者关于核酸，第一序列与第二序列的互补体基本上互补。

如本文所用，术语“诊断”是指将病状或症状归类、确定病状的严重程度(例如，等级或分期)、监测病状进展、预测病状的结果和/或痊愈的前景。

短语“本质上由……组成”意指，组合物或方法可以包括另外的成分和/或步骤，但前提是所述另外的成分和/或步骤不会实质性地改变要求保护的组合物或方法的基础和新颖特征。

1.包含CRC和AA的中国人群中BMP3和NDRG4基因启动子区域中的高甲基化CpG位点的DNA序列

本发明提供由亚洲人群(例如，中国人群)中BMP3和NDRG4基因启动子区域中的详细高甲基化CpG位点构成的DNA序列，所述DNA序列可以用作CRC和AA检测的标记。

在一些实施方案中，提供BMP3基因的天然序列如下(5'至3')，其显示由上标“m”标记的潜在甲基化位点：

GCCAGTTTGGC

在一些实施方案中，提供NDRG4基因的天然序列如下(5'至3')，其显示由上标“m”标记的潜在甲基化位点：

TGAGAAGT

在用一种或多种试剂处理天然基因组DNA或其片段以将其未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶(例如，通过亚硫酸氢盐)或在杂交特性方面与胞嘧啶可检测地不同的另一种碱基之后，BMP3基因的转化的序列如下(5'至3')，其显示由上标“m”标记的潜在甲基化位点：

GTTAGTTTGGT

在用一种或多种试剂处理天然基因组DNA或其片段以将其未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶(例如，通过亚硫酸氢盐)或在杂交特性方面与胞嘧啶可检测地不同的另一种碱基之后，NDRG4基因的转化的序列如下(5'至3')，其显示由上标“m”标记的潜在甲基化位点：

TGAGAAGT

本公开文本的由亚洲人群中BMP3和NDRG4基因启动子区域中的详细高甲基化CpG位点构成的DNA序列特别可用于检测亚洲人群的CRC和/或AA。例如，可以将引物和探针设计为靶向BMP3和/或NDRG4基因中的一个或多个特定甲基化位点，作为工具来确定BMP3和/或NDRG4甲基化状态和水平，从而确定有需要的患者的肿瘤状况。

2.分别用于检测BMP3和NDRG4基因的甲基化的三对优选引物和探针以及相应试剂。

本发明提供三对优选引物和探针，分别用于检测BMP3和NDRG4基因的甲基化水平。将这些引物和探针设计为靶向亚洲人群(例如，中国人群)中的高频甲基化CpG位点。

在与现有商业产品如

引物和探针的序列如下：

本公开文本的寡核苷酸有利地允许从亚洲患者获得的生物样品中BMP3或NDRG4的启动子区域中高甲基化CpG位点的极端特异性扩增。

在一些实施方案中，提供与SEQ ID NO:3至20的序列部分或完全互补的寡核苷酸。

在一些实施方案中，提供与探针序列(如SEQ ID NO:5、11、17、8、14和20)相比具有一个或多个修饰的寡核苷酸。在一些实施方案中，修饰可以发生于SEQ ID NO.:5、11、17、8、14和20中列举的核苷酸序列之一的5'端和/或3'端。

可以用于在核苷酸结构的任何位置修饰核苷酸的修饰的碱基部分的例子尤其包括但不限于：5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基辫苷、肌苷、N-6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基辫苷、5'-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-羟乙酸、假尿嘧啶、辫苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-羟乙酸甲酯、尿嘧啶-S-羟乙酸、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶和2,6-二氨基嘌呤。

可以用于在核苷酸结构的任何位置修饰核苷酸的经修饰糖部分的例子包括但不限于：阿拉伯糖、2-氟阿拉伯糖、木糖和己糖，或者磷酸骨架的经修饰组分，如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硫代磷酰胺酯、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、烷基磷酸三酯、或其甲缩醛或类似物。

在一些实施方案中，SEQ ID NO:5、11、17、8、14和20的序列中的寡核苷酸被非天然核苷酸(如人工核酸)替代。人工核酸包括但不限于肽核酸(PNA)、吗啉代(Morpholino)、锁核酸(LNA)、乙二醇核酸(GNA)和苏糖核酸(TNA)。这些中的每一种通过分子骨架的变化而与天然存在的DNA或RNA相区别。

在一些实施方案中，本公开文本的探针在5'和探针处包含标记。

在一些实施方案中，在探针5'处的标记包含荧光染料，如荧光团。如本文所用，荧光团是可以在光激发后再发射光的荧光化学化合物。荧光团通常含有几个组合的芳香族基团，或者具有若干个π键的平面或环状分子。非蛋白质有机荧光团包括但不限于呫吨衍生物(例如，荧光素、罗丹明、俄勒冈绿(Ore gon green)、曙红和德克萨斯红(Texas red))；青色素衍生物(例如，青色素、吲哚羰花青、氧杂羰花青、硫杂羰花青和部花青)、方酸菁衍生物和环取代的方酸菁(例如，Seta、SeTau和Square染料)、萘衍生物(例如，丹酰和氟硅酸钠(prodan)衍生物)、香豆素衍生物；噁二唑衍生物(例如，吡啶基噁唑、硝基苯并噁二唑和苯并噁二唑)；蒽衍生物(例如，蒽醌，包括DRAQ5、DRAQ7和CyTR AK Orange)；芘衍生物(瀑布蓝(cascade blue)等)、噁嗪衍生物(例如，尼罗红(Nile red)、尼罗蓝(Nile blue)、甲酚紫、噁嗪170等；吖啶衍生物(例如，原黄素、吖啶橙、吖啶黄等)；芳基次甲基衍生物(例如，金胺、结晶紫、孔雀绿)；四吡咯衍生物(例如，卟吩、酞菁、胆红素)。特定例子包括但不限于VIC、PET、德克萨斯红、Cy3、Cy5、FAM(6-羧基荧光素)、HEX(6-羧基-2',4,4',5',7,7'-六氯荧光素)、ROX(5(6)-羧基-X-罗丹明)、JOE(6-羧基-4',5'-二氯-21,71-二甲氧基荧光素)、TET(5'-四氯-荧光素亚磷酰胺)、NED(荧光素苯并呫吨)、TAMRA(6-羧基-N,N,N,N-四甲基罗丹明)、FITC(异硫氰酸荧光素)。可以用于本文公开的探针中的特定荧光团的例子是本领域技术人员已知的，并且包括Nazarenko等人的美国专利号5,866,366中提供的那些，尤其如4-乙酰胺基-4'-异硫氰酰芪-2,2'二磺酸；吖啶和衍生物(如吖啶和异硫氰酸吖啶)、5-(2'-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)、4-氨基-N-[3-乙烯基磺酰基)苯基]萘亚胺-3,5二磺酸酯(萤光黄VS)、N-(4-苯胺基-1-萘基)马来酰亚胺、邻氨基苯甲酰胺；亮黄；香豆素和衍生物，如香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC、香豆素120)、7-氨基-4-三氟甲基香豆素(香豆满(Coumaran)151)；标记红(cyanosine)；4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)；5',5”-二溴焦没食子酚-磺酞(溴邻苯三酚红)；7-二乙基氨基-3-(4'-异硫氰酸基苯基)-4-甲基香豆素；二乙烯三胺五乙酸；4,4'-二异硫氰酰二氢-芪-2,2'-二磺酸；4,4'-二异硫氰酰芪-2,2'-二磺酸；5-[二甲基氨基]萘-1-磺酰氯(DNS，丹酰氯)；4-二甲基氨基苯基偶氮基苯基-4'-异硫氰酸酯(DABITC)；曙红和衍生物，如曙红和异硫氰酸曙红；赤藓红和衍生物，如赤藓红B和异硫氰酸赤藓红；胡米胺(ethidium)；荧光素和衍生物，如5-羧基荧光素(FAM)、5-(4,6-二氯三嗪-2-基)氨基荧光素(DTAF)、2'7'-二甲氧基-4'5'-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、QFITC(XRITC)、-6-羧基-荧光素(HEX)和TET(四甲基荧光素)；荧光胺；IR144；IR1446；异硫氰酸孔雀绿；4-甲基伞形酮；邻甲酚酞；硝基酪氨酸；副蔷薇苯胺；酚红；B-藻红蛋白；邻苯二甲醛；芘和衍生物，如芘、芘丁酸酯和1-芘丁酸琥珀酰亚胺基酯；活性红4(CIBACRON

在一些实施方案中，本公开文本的探针包含荧光供体和受体荧光团。如本文所用，受体荧光团(例如，“荧光淬灭剂”)是从供体荧光团，例如在约400至900nm范围内吸收能量的荧光团。受体荧光团总体上吸收光的波长通常比供体荧光团的最大吸收波长高至少10nm(如高至少20nm)。受体荧光团的激发光谱与供体荧光团的发射重叠，使得供体发射的能量可以激发淬灭剂。可以利用本领域中已知的任何受体荧光团。在特定例子中，受体荧光团是暗淬灭剂，如Dabcyl、QSY7(Molecular Probes)、QSY9(Molecular Probes)、QSY21(Molecular Probes)、QSY33(Molecular Probes)、BLACK HOLE QUENCHERS

在一些实施方案中，本公开文本的引物和探针是基于荧光共振能量转移(FRET)。可以用于检测扩增子的使用FRET的寡核苷酸的例子包括线性寡核苷酸探针，如HybProbe；5'核酸酶寡核苷酸探针，如

在一些实施方案中，用其他功能实体标记本公开文本的引物和/或探针，所述功能实体如生物素、半抗原、抗原、化学基团、放射性物质、酶标记等。标记的扩增产物的检测可以例如使用以下方法来完成：荧光法、化学发光法、光密度测定法、光度测定法、沉淀反应、酶促反应(包括酶强化反应、SPR(“表面等离子体共振”)方法、椭圆偏振法、折射率的测量、反射率的测量和类似方法。

在一些实施方案中，本文所述的引物和探针可以用于定量PCR以确定患者中BMP3和/或NDRG4基因的甲基化状态和水平。在一些实施方案中，可以包括另外的反应以扩增一种或多种参考基因。在一些实施方案中，参考基因是如下患者的基因：其活动不会受CRC和AA的存在或不存在的影响，并且不会受BMP3和NDRG4的甲基化状态和水平的影响。在一些实施方案中，参考基因包括但不限于β-珠蛋白(HBB)、端粒酶(TERT)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、白蛋白(ALB)、β-肌动蛋白(ACTB)、β2微球蛋白(B2M)和T细胞受体γ(TRG)。

在一些实施方案中，使用B2M基因在定量PCR中作为参考基因用于检测BMP3/NDRG4的甲基化状态和水平。

在一些实施方案中，可以引入一种或多种其他对照，包括但不限于无模板对照(用于检测试剂或设备污染以及确认阳性结果)；无扩增对照(用于检测由分解的标记探针产生的背景荧光)；和阳性对照(用于检测抑制剂或故障，以及确认该试剂和设备正在工作)。

在一些实施方案中，使用qPCR确定样品中是否存在甲基化BMP3基因或甲基化NDRG4基因的扩增。通过参考标准曲线或者通过比较Ct值与参考基因的Ct值，对检测到的来自BMP3或NDRG4的探针的信号进行定量。通常使用对持家基因的分析来将结果归一化。循环阈值(Ct)被定义为荧光信号跨过预定阈值(例如，超过背景水平，如超过阴性对照样品中的扩增水平)所需的循环数。在一些实施方案中，所述阈值是通过qPCR仪器的软件或其他合适的方法自动确定的。在一些实施方案中，所述阈值被设定为略高于(例如，高约0.01％、0.1％、1％、5％或10％)阴性对照样品中的终末荧光值。

在一些实施方案中，在与测试样品中的BMP3或NDRG4扩增相关的Ct值不大于(≤)约35、34、33、32、31、30或更小时，将样品确定为含有甲基化BMP3或NDRG4，并且患者患有CRC和/或AA(阳性结果)，否则将样品确定为不含甲基化BMP3或NDRG4，并且患者未患CRC或AA(阴性结果)。对于参考基因扩增，在与样品中的对照基因扩增相关的Ct值不大于(≤)约34、33、32、31、30、29或更小时，将参考基因扩增确定为阳性，否则将参考基因扩增确定为阴性。在将参考基因扩增确定为阴性时，测试结果无效。

在一些实施方案中，将关于BMP3的Ct值与关于参考基因扩增的Ct值相比较之间的差异(ΔCt＝Ct

在一些实施方案中，将关于NDRG4的Ct值与关于参考基因扩增的Ct值相比较之间的差异(ΔCt＝Ct

在与现有商业产品如

如本文所用，术语“灵敏度”是指正确检测给定人群中实际上患有CRC和/或AA的患者时的比率。在一些实施方案中，灵敏度为至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或更高、或100％。在一些实施方案中，人群大小为至少约50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000或更多。

如本文所用，术语“特异性”是指将给定人群中实际上未患CRC或AA的患者正确诊断为未患所述病症时的比率。在一些实施方案中，特异性为至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或更高、或100％。在一些实施方案中，人群大小为至少约50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000或更多。

如实施例中所展示，优选引物和探针在检测BMP3和NDRG4的甲基化方面提供极高灵敏度和特异性，从而导致检测CRC和/或AA方面的极高灵敏度和特异性。例如，使用BMP3基因的三对优选引物和探针进行CRC检测的灵敏度为至少85％；使用NDRG4基因的三对优选引物和探针进行CRC检测的灵敏度为至少90％；使用BMP3基因的三对优选引物和探针进行AA检测的灵敏度为至少66％；使用NDRG4基因的三对优选引物和探针进行AA检测的灵敏度为至少73％。另外，使用BMP3基因的三对优选引物和探针进行CRC和AA检测的特异性为约97％-100％(例如，至少约97.8％)；使用NDRG4基因的三对优选引物和探针进行CRC和AA检测的特异性也为约97％-100％(例如，至少约97.8％)。

3.用于检测患者的CRC和/或AA的三组优选引物-探针组合。

本公开文本还提供三组优选引物和探针组合用于检测BMP3和NDRG4基因的甲基化水平，以确定患者中CRC或AA的存在或不存在。在与现有商业产品如

如实施例中所展示，BMP3和NDRG4引物-探针组的优选组合在检测BMP3和NDRG4的甲基化方面提供极高灵敏度和特异性，从而导致检测CRC和/或AA方面的极高灵敏度和特异性。在一些实施方案中，在同一测定也包括KRAS基因分析和血红蛋白测试时，获得该灵敏度和特异性，如实施例5中所解释。例如，使用与KRAS基因分析和血红蛋白测试组合的BMP3和NDRG4基因的引物和探针的三个优选组合进行的CRC检测的总体灵敏度为至少95％；使用与KRAS基因分析和血红蛋白测试组合的BMP3和NDRG4基因的引物和探针的三个优选组合进行的AA检测的灵敏度为至少93％；使用与KRAS基因分析和血红蛋白测试组合的BMP3和NDRG4基因的引物和探针的三个优选组合进行的CRC+AA检测的灵敏度为至少97％；使用与KRAS基因分析和血红蛋白测试组合的BMP3和NDRG4基因的引物和探针的三个优选组合进行的CRC+AA检测的特异性为至少97％。

4.用于检测CRC和AA的试剂盒

本公开文本提供用于有需要的患者的BMP3/NDRG4甲基化检测和/或CRC/AA检测的试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒特别适合于亚洲患者，如中国患者。

在一些实施方案中，该试剂盒包含：(1)用于检测CRC和AA的三组优选引物和探针组合(表20中的组合编号4、5和7)中的至少一种，和相应的qPCR试剂；(2)用于检测KRAS基因编码区中的七个突变(即，G12D、G13D、G12V、G12C、G12S、G12A和G13R)的构件，如合适的引物和探针，和相应的qPCR试剂；(3)用于检测粪便样品中的血红蛋白的构件，如基于FIT技术的试剂(例如，抗血红蛋白抗体，以及用于检测由抗体和粪便样品中的血红蛋白形成的复合物的试剂)。

在一些实施方案中，试剂盒包含下文中的至少一组优选引物-探针组合：

(1)三组优选引物和探针组合如下：

(2)用于检测BMP3和NDRG4基因的甲基化水平的三重定量PCR试剂。

在一些实施方案中，试剂盒包含用于进行多重PCR的试剂，用于同时检测BMP3和NDRG4的甲基化。在一些实施方案中，多重PCR是定量PCR。

在一些实施方案中，所述试剂包括Taq DNA聚合酶。在一些实施方案中，Taq DNA聚合酶的终浓度为约2U/反应。在一些实施方案中，试剂包括MgCl

(3)用于检测KRAS基因编码区中的七个突变的引物和探针。

在一些实施方案中，试剂盒包含用于检测KRAS基因中的突变的构件。在一些实施方案中，试剂盒包含引物和探针，所述引物和探针被设计用于扩增并检测KRAS基因的开放阅读区中外显子12和外显子13的七个突变体热点(其为G12D、G13D、G12V、G12C、G12S、G12A和G13R)。在一些实施方案中，引物和探针的序列如下：

(4)用于检测KRAS基因的密码子突变的多重定量PCR试剂。

还提供用于检测KRAS基因的所有七个突变的多重定量PCR系统。在一些实施方案中，多重定量PCR反应包含终浓度为2.5U/反应的Taq DNA聚合酶、终浓度为1mM的MgCl

(5)检测粪便中的血红蛋白的试剂盒

在一些实施方案中，试剂盒包含用于检测血红蛋白的试剂。在一些实施方案中，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)定性地测试血红蛋白。

5.逻辑回归模型

在一些实施方案中，在得到BMP3/NDRG4甲基化测试、KRAS突变测试和血红蛋白测试的结果后，对所有结果进行汇编并进行逻辑回归模型，以确定患者中CRC和/或AA的存在或不存在。

在一些实施方案中，所述方法包括计算综合癌症指数值P的值，其中P＝e

在一些实施方案中，K被定义为K＝a*△Ct1+b*△Ct2+c*△Ct3+d*FI T+X，其中a、b、c、d、X是临床常数。△Ct1、△Ct2和△Ct3是BMP3、NDRG4和KRAS的Ct值减去参考基因的Ct值。

在一些实施方案中，在P值等于或大于预定阈值时，测试结果是阳性的，否则是阴性的。阳性结果表明个人可能患有CRC或AA，否则是健康的。

6.治疗方法

在一些实施方案中，本公开文本的方法包括在将患者归类为患有结直肠癌和/或腺瘤之后，治疗有需要的患者。在一些实施方案中，治疗包括但不限于外科手术、化学疗法、发射疗法、免疫疗法、姑息疗法、运动。

如本文所用，短语“治疗方案”是指向有需要的受试者(例如，诊断具有病状的受试者)提供的治疗计划，其指定治疗类型、治疗的剂量、时间表和/或持续时间。所选治疗方案可以是积极治疗方案，预期所述方案会导致最佳临床结果(例如，病状完全治愈)；或者是更温和的治疗方案，所述方案可以减轻病状的症状，但仍导致病状的不完全治愈。应了解，在某些情况下，治疗方案可能与对受试者造成的一些不适或不良副作用(例如，对健康细胞或组织的损害)相关。治疗类型可以包括外科手术干预(例如，去除病灶、患病的细胞、组织或器官)、细胞替代疗法、以局部或全身模式给予治疗性药物(例如，受体激动剂、拮抗剂、激素、化学治疗剂)、暴露于使用外部来源(例如，外粒子束)和/或内部来源(例如，近距离放射疗法)的放射疗法和/或其任何组合。治疗的剂量、时间表和持续时间可以根据病状的严重程度和所选治疗类型而变化，并且本领域技术人员能够调整治疗类型以及治疗的剂量、时间表和持续时间。

在一些实施方案中，治疗包括但不限于氟尿嘧啶、卡培他滨、奥沙利铂、伊立替康、UFT、FOLFOX、FOLFOXIRI和FOLFIRI、抗血管生成药物(如贝伐珠单抗)、以及表皮生长因子受体抑制剂(例如，西妥昔单抗和帕尼单抗)。

7.本发明的优点

不希望受任何具体理论的束缚，本发明至少具有以下优点：

(1)提供中国人群中BMP3和NDRG4基因的启动子区域的详细甲基化CpG位点，并且可以作为用于检测CRC和/或AA的生物标记。

(2)所述试剂盒比基于mt-sDNA的其他类似产品如

(3)与基于mt-sDNA的其他类似产品相比，CRC检测的灵敏度和特异性更高。

(4)与基于mt-sDNA的其他类似产品相比，显著改进AA检测的灵敏度和特异性。

(5)所述方法是非侵入性的并且易于在家取样，从而获得良好的患者顺应性，使得它可以广泛用作CRC和AA筛查方法。所述方法降低亚洲人群中由于CRC所致的发病率和死亡率。

实施例

实施例1

BMP3和NDRG4基因的启动子区域中的甲基化CpG位点分别在中国CRC和AA人群中的发现。

(1)样品收集

从通过结肠镜检查确认患有CRC和AA的患者收集总共191个结肠FFPE组织样品，包括50个结直肠癌组织和49个配对的相邻正常组织、46个腺瘤癌症组织和46个配对的附属正常组织。

(2)DNA提取

用TaKaRa MiniBEST FFPE DNA提取试剂盒(目录号：9782)从FFPE样品提取基因组DNA。详细操作步骤描述如下：

i.用无菌解剖刀切下30mg石蜡切片组织并去除过量石蜡。

ii.将石蜡切片组织置于1.5mL离心管中，并添加500μL缓冲液DP，混合并在水中在80℃下孵育1分钟，然后涡旋10秒。添加180μL缓冲液GL并进行涡旋。

iii.将混合物在室温下以12,000rpm离心1分钟，然后溶液形成两层(上层油相、下层水相)。将20μL蛋白酶K(20mg/mL)和10μL的RNA酶(10mg/mL)添加至下层水相，并通过温和地上下吸移充分混合。谨慎操作以免扰乱分层。然后在56℃下水浴1小时。

iv.将前一步骤的溶液在90℃下孵育30分钟并冷却至室温。然后将200μL缓冲液GB和200μL的100％乙醇添加至溶液，涡旋10秒。在室温下以12,000rpm离心1分钟，然后溶液形成两层(上层油相，下层水相)。

v.将旋转柱置于收集管中，并将前一步骤的下层水相添加至旋转柱中。谨慎操作以免扰乱分层，并在室温下以12,000rpm离心2分钟，然后弃去废料。

vi.将500μL缓冲液WA添加至旋转柱，并在室温下以12,000rpm离心1分钟，然后弃去废料。

vii.将500μL缓冲液WB添加至旋转柱，在室温下以12,000rpm离心1分钟，然后弃去废料。并且重复一次。

viii.将旋转柱置于收集管中，在室温下以12,000rpm离心2分钟。

ix.将旋转柱置于新的1.5mL离心管中，将50-100μL的无菌水或洗脱缓冲液添加至旋转柱膜的中心，然后置于室温下5分钟。

x.在室温下以12,000rpm离心2分钟，并洗脱DNA。

xi.将洗脱的DNA用Nanodrop 2000荧光计定量，并储存在-20℃下备用。

(3)对BMP3和NDRG4基因的启动子区域中的CpG岛的预测以及用于扩增子测序的引物设计。

i.对BMP3和NDRG4基因的启动子区域的CpG岛的预测。

下载BMP3和NDRG4基因的启动子序列，包括转录起始位点(TSS)上游大约1000-1500bp的DNA序列和5'UTR区域。用MethPrimer软件(www.urogene.org/methprimer/)预测所述序列的CpG岛。如图1A至图1D中所示，BMP3基因的三个CpG岛中的两个较大的CpG岛位于TSS上游大约400bp和整个5'UTR区域处(chr4：81951752-81952760)，并且NDRG4基因的仅一个CpG岛位于TSS上游大约500bp和部分5'UTR区域处(chr16：58497061-58497938)。人参考基因组的版本(build)是GRCh37/hg19。

ii.用于扩增BMP3和NDRG4基因的预测的CpG岛的序列的引物设计。

基于要扩增的序列长度和测序的读段长度，分别设计四对和五对引物用于BMP3和NDRG4基因。在相邻的扩增子之间存在尽可能多的重叠，使得两种基因的CpG岛可以被完全测序。两种基因的引物列于表1中，并且两种基因的扩增子的相对位置显示于图1A至图1D中。

表1用于BMP3和NDRG4基因的扩增子测序的引物

如下所述使DNA样品经历亚硫酸氢盐处理。

(4)亚硫酸氢盐处理

i.将提取的DNA置于室温下解冻，并且将DNA浓度稀释至20ng/μL。将40μL稀释的DNA添加至1.5mL离心管，然后添加4μL的3M NaOH溶液，在42℃下孵育20分钟。

ii.添加400μL转化溶液，混合，并在暗中在50℃下孵育16小时。

iii.添加550μL结合溶液，混合，并将溶液转移至DNA纯化柱。以13,000rpm离心90秒并弃去废料。再离心3分钟并弃去废料。

iv.将600μL的90％乙醇添加至DNA纯化柱，以13,000rpm离心90秒，并弃去废料。再以13,000rpm离心15秒。

v.将300μL脱硫溶液(0.3M NaOH的90％乙醇溶液)添加至DNA纯化，将其置于室温中30分钟。以13,000rpm离心90秒并弃去废料。

vi.添加600μL的90％乙醇，以13,000rpm离心90秒，并弃去废料。将此步骤重复一次，并再以13,000rpm离心3分钟。

vii.将DNA纯化柱置于新的1.5mL离心管中，并添加40μL洗脱剂。将所述管在50℃下孵育30分钟，并以13,000rpm离心90秒。将转化的DNA溶液储存在-20℃下备用。

(5)文库制备和扩增子测序

(a)多重PCR扩增

i.如下制备PCR主混合物：

表2

ii.将混合物温和地涡旋并将40μL所述混合物吸移至每个PCR管，然后添加10μL硫酸氢盐处理的DNA。

iii.温和地涡旋并且如下进行PCR扩增：一个在95℃下变性15分钟的循环；35个在94℃下变性30秒、在55℃下退火90秒、并在72℃下延伸90秒的循环；一个在72℃下延伸10分钟的循环；并且最终一直保持在4℃。

iv.将5μL的PCR产物与6X上样缓冲液(TakaRa，目录号：9156)共混，并且与DL2000DNA标记(TakaRa，目录号：3427Q)的对照一起加载至1％(w/v)琼脂糖凝胶，并且在120V下电泳40分钟。

v.如果存在非特异性扩增，则需要在电泳后根据试剂盒说明书(QIAGEN，目录号：28704)回收剩余的45μL的PCR产物。

(b)PCR产物的纯化和定量

用MinElute PCR纯化试剂盒根据试剂盒说明书(QIAGEN，目录号：28004)纯化PCR产物。将纯化的PCR产物用Qubit

(c)衔接子连接

将衔接子用NEBNext快速连接模块(NEB，目录号：E6056L)与纯化的PCR产物连接，并如下制备反应混合物：

表3.用于衔接子连接的反应混合物

将30μL混合物添加至每个PCR管，然后分别添加20μL纯化PCR产物。将溶液温和地混合，在20℃下孵育15分钟并在4℃下保持10分钟。

(d)连接产物的纯化

i.将Agencourt AMpure XP珠(Beckman，目录号：A63882)置于室温下备用。

ii.将PCR管在20℃下以280g离心1分钟，并将50μL连接产物转移至新的96孔PCR板。

iii.将AMpure XP珠涡旋30秒以均匀分散，并将56μL珠添加至PCR板的每个孔。将混合物温和地吸移10次以混合，并在室温下静置5分钟。

iv.将96孔PCR板置于96孔磁性板上，静置2分钟直至上清液澄清为止。将96孔PCR板保持在96孔磁性板上并去除上清液，然后将200μL新鲜制备的80％乙醇添加至每个孔，并在室温下孵育30秒，并且去除上清液。

v.将96孔PCR板保持在96孔磁性板上并将200μL新鲜制备的80％乙醇添加至每个孔。然后在室温下孵育30秒。弃去上清液并用10μL移液管去除残留的乙醇。

vi.将96孔PCR板保持在磁性板上，并使珠自然干燥10分钟。

vii.从磁性板去除96孔PCR板并将27.5μL的10mM Tris(pH 8.5)添加至96孔板的每个孔。温和地上下吸移10次以混合珠与Tris，直至珠充分分散为止。将板在室温下静置2分钟。

viii.将96孔PCR板置于磁性板上并静置2分钟，直至上清液澄清为止。将25μL上清液吸移至新的PCR管并将其储存在-20℃下备用。

(e)PCR扩增和产物纯化

如下制备PCR主混合物并温和地混合。将40μL混合物添加至每个PCR管，然后添加5μL纯化的连接产物。

表4.PCR反应混合物

将PCR管温和地涡旋并短暂离心，并且按以下条件进行PCR反应：一个在98℃下变性30秒的循环；8至15个在98℃下变性10秒并在65℃下延伸75秒的循环；一个在65℃下变性5分钟的循环；并且最终保持在4℃。根据(d)连接产物的纯化来纯化PCR产物。

(f)文库的检测和测序

分别用Qubit

(g)测序数据分析

将原始数据根据样品指标进行多路解编，并将测序读段用SHRiMP V2.04软件映射至BMP3和NDRG4的参考基因序列。基于映射结果鉴定甲基化CpG位点。并且最后，发现与相邻的正常组织相比，在CRC和AA组织处，BMP3和NDRG4基因的26个和39个CpG位点发生高甲基化(p<0.05)，从而表明这些甲基化CpG位点可以是用于早期诊断CRC和AA的DNA生物标记。

表5 CRC组织和相邻正常组织中BMP3基因的CpG位点的甲基化频率。

表6 AA组织和相邻正常组织中BMP3基因的CpG位点的甲基化频率。

表7 CRC组织和相邻正常组织中NDRG4基因的CpG位点的甲基化频率。

表8 AA组织和相邻正常组织中NDRG4基因的CpG位点的甲基化频率。

实施例2

不同种族中与CRC相关的BMP3和NDRG4基因的差异性甲基化CpG位点的比较。

我们分析了TCGA数据库(Illumina人甲基化450数据)中BMP3和NDRG4基因的甲基化微阵列数据，并且发现，在白种人群与亚洲人群之间，在NDRG4基因的启动子区域中存在五个显著不同的甲基化CpG位点(图2和表9)。为了进一步验证差异性甲基化CpG位点，从106名中国CRC和AA患者收集组织和血液样品。提取DNA并用硫酸氢盐处理。对BMP3和NDRG4基因的启动子区域进行扩增和测序。我们分析了测序数据并且确实发现，在TCGA数据库中，亚洲人群的高甲基化CpG位点与白种人群的高甲基化CpG位点不同，并且高甲基化CpG位点在CRC和AA组织样品之间不同。根据这些不同的甲基化CpG位点，我们开发了专门用于亚洲人群(例如中国人群)的CRC和AA筛查的检测试剂盒。

表9白种人群与亚洲人群中BMP3和NDRG4基因的甲基化CpG位点的差异。

实施例3

用于BMP3和NDRG4基因的引物和探针的筛选

(1)BMP3和NDRG4基因的引物和探针的设计和选择。

基于BMP3和NDRG4基因的甲基化CpG位点来设计qPCR引物和探针。鉴定三对优选引物和探针。将优选引物和探针与BMP3和NDRG4基因的几种其他候选引物和探针及阳性对照和阴性对照相比较。引物和探针的信息显示于表10中。

表10优选的和其余的引物和探针的信息

(2)优选引物和探针与BMP3和NDRG4基因的对照和阳性和阴性对照的比较。

通过分别以不同比率将BMP3和NDRG4基因的阳性对照DNA掺加至阴性对照DNA中来形成具有不同甲基化比率的标准样品(表11)。通过分别用BMP3和NDRG4基因的优选和对照引物和探针扩增标准样品DNA来比较分析灵敏度。通过分别用BMP3和NDRG4基因的优选和对照引物和探针扩增BMP3和NDRG4基因的阴性对照DNA来比较分析特异性，并且阴性对照DNA的量为10

表11 BMP3和NDRG4基因的标准样品

根据表5制备主混合物，并且定量PCR反应条件是首先在95℃下变性1分钟，然后进行50个在95℃下变性20秒且在60℃下延伸1分钟的循环。

表12甲基化qPCR试剂的终浓度

如表13和图3A至图3L中所示，使用三对优选引物和探针可以检测到1/10

如表13和图3A至图3L中所示，本发明的优选三对BMP3和NDRG4引物和探针能够稳定检测低至万分之一的甲基化水平，而三对比较引物和探针无法检测万分之一的甲基化水平。

表13 BMP3和NDRG4基因的优选与对照引物和探针的分析灵敏度比较。

Y：检测到，N：未确定

与对照组相比，对于每个优选组合，BMP3和NDRG4的分析灵敏度扩增曲线显示于图3A至图3L中。

如表14和图4A至图4L中所示，BMP3和NDRG4基因的三对优选引物和探针没有不同浓度的未甲基化DNA的扩增信号，而比较引物和探针展现不同程度的非特异性扩增。

表14优选与对照引物和探针之间的分析特异性的比较。

Y：无扩增，N：非特异性扩增

BMP3和NDRG4的分析特异性扩增曲线

实施例4

用BMP3和NDRG4基因的粪便样品进行优选和比较甲基化引物和探针的验证。

用三对优选和比较引物和探针检测81个粪便样品中BMP3和NDRG4基因的甲基化水平。三个比较引物和探针是：

比较1：BMP3正向引物SEQ ID NO.:21、BMP3反向引物SEQ ID NO.:22和BMP3探针SEQ ID NO.:23；NDRG4正向引物SEQ ID NO.:24、NDRG4反向引物SEQ ID NO.:25和NDRG4探针SEQ ID NO.:26；

比较2：BMP3正向引物SEQ ID NO.:27、BMP3反向引物SEQ ID NO.:28和BMP3探针SEQ ID NO.:29；NDRG4正向引物SEQ ID NO.:24、NDRG4反向引物SEQ ID NO.:30和NDRG4探针SEQ ID NO.:26；

比较3：BMP3正向引物SEQ ID NO.:31、BMP3反向引物SEQ ID NO.:32和BMP3探针SEQ ID NO.:33；NDRG4正向引物SEQ ID NO.:24、NDRG4反向引物SEQ ID NO.:34和NDRG4探针SEQ ID NO.:26。

粪便样品的信息显示于表15中。

表15八十一个粪便样品的统计

通过遵循下文所述的方法从样品提取粪便DNA。

(1)粪便DNA的提取

i.将40mL裂解物添加至4-6g粪便样品，并且充分涡旋，然后在50℃下孵育16小时。

ii.然后以5000rpm离心10分钟。在离心前注意称重平衡。在离心结束后，小心地取出离心管并且不要剧烈震荡它。

iii.将9mL上清液吸移至新的50mL离心管中，然后添加1mL提取佐剂、60μL磁珠和10mL异丙醇。涡旋10秒，并且在65℃下孵育20分钟。在孵育期间每5分钟上下混合一次。

iv.在孵育后，将50mL离心管置于磁架上并保持平稳3分钟直至上清液澄清为止，并且弃去上清液。

v.从磁架取出50mL离心管并添加12mL洗涤溶液。涡旋直至磁珠从管壁脱落为止，并保持平稳3分钟，并且将50mL离心管放回磁架保持3分钟，直至上清液澄清为止，并且弃去上清液。

vi.添加15mL的80％乙醇溶液，涡旋直至珠从管壁脱落为止，并保持平稳3分钟。将所述管放回磁架中并保持平稳3分钟直至上清液澄清为止，并且弃去上清液。

vii.将先前步骤重复一次。

viii.吸移底部残留液体，保持管开放，并且在65℃下孵育5分钟。将管从磁架取出，直至珠干燥为止，并且添加1.5mL预加热的洗脱剂Ⅰ。用1000μL移液管将珠从孔吸移至洗脱剂Ⅰ，并且将混合物转移至2mL离心管并关闭盖，然后在65℃下孵育5分钟。

ix.以13000rpm离心3分钟，将600μL上清液吸移至新的1.5mL管，然后添加600μL结合溶液并充分涡旋。

x.将600μL上述混合物转移至DNA纯化柱，以13,000rpm离心1分钟，并弃去废料。

xi.如先前步骤处理剩余混合物，并且以13,000离心2分钟。

xii.将600μL的90％乙醇溶液添加至DNA纯化柱，以13,000rpm离心1分钟并弃去废料。

xiii.将先前步骤重复2次。

xiv.以13,000rpm离心3分钟，并且将DNA纯化柱置于新的1.5mL离心管中。打开DNA纯化柱并且在65℃下孵育5分钟至干燥。

xv.将100μL预加热的洗脱剂Ⅱ滴加至DNA纯化柱中间，关闭盖，然后在65℃下孵育5分钟。以13,000rpm离心2分钟。获得洗脱的DNA溶液并将其储存在2-8℃下备用。长期储存应该保持在-25℃至-15℃。

(2)亚硫酸氢盐处理

根据实施例3的详细操作步骤。

(3)qPCR

如下制备qPCR主混合物：

表16

qPCR反应条件是：一个在95℃下变性2分钟的循环；以及50个在95℃下变性20秒并且在95℃下延伸1分钟的循环。B2M基因作为参考基因用于qPCR反应的质量控制。

(4)结果

如表17中所示，使用BMP3和NDRG4基因的三对优选引物和探针在81个粪便样品中进行CRC和AA检测的灵敏度分别为高达85.0％-95.0％(依据BMP3甲基化的CRC)、66.7％-73.3％(依据BMP3甲基化的AA)、和90.0％-95.0％(依据NDRG4甲基化的CRC)、和73.3％-86.7％(依据NDRG4甲基化的AA)。另外，使用BMP3甲基化数据或NDRG4甲基化数据进行的CRC和AA检测的特异性均为约97.8％-100.0％。

然而，使用BMP3和NDRG4基因的三对比较引物和探针在八十一个粪便样品中进行的CRC和AA检测的灵敏度分别为85.0％-90.0％(依据BMP3甲基化的CRC)、46.7％-60.0％(依据BMP3甲基化的AA)、和90.0％-95.0％(依据NDRG4甲基化的CRC)、和66.7％-73.3％(依据NDRG4甲基化的AA)。另外，使用BMP3甲基化数据或NDRG4甲基化数据进行的CRC和AA检测的总体特异性分别为高达约91.3％-93.5％和93.5％-95.7％。

可以看出，在临床样品的检测方面，尤其对于AA检测，优选引物和探针优于比较引物和探针。

实施例5

BMP3和DNRG4基因的甲基化引物和探针组合的筛选

(1)粪便DNA提取

根据实施例3的方案提取粪便DNA。

(2)BMP3和NDRG4基因的甲基化检测

BMP3和NDRG4基因的引物和探针的组合显示如下。根据实施例3的步骤分别用九种组合进行qPCR。

表19.引物和探针的组合

BMP3和NDRG4基因的九种组合的引物和探针的序列如下：

表20.组合中的引物和探针的序列

用于反应中的qPCR主混合物如下：

表21.用于BMP3/NDRG4的qPCR主混合物

qPCR反应条件是：一个在95℃下变性2分钟的循环；以及50个在95℃下变性20秒并且在60℃下延伸1分钟的循环。

(3)KRAS基因的变体检测

检测KRAS基因的密码子12和13中的七个突变热点。七种突变体是G12D、G13D、G12V、G12C、G12S、G12A和G13R，并且其引物和探针的序列列于表22中。

表22用于检测KRAS基因的七个突变的引物和探针

用于反应中的qPCR主混合物如下：

表23.用于KRAS的qPCR主混合物

qPCR反应条件是：一个在95℃下变性5分钟的循环；以及45个在95℃下变性15秒、在71℃下退火60秒、然后在55℃下延伸50秒的循环。

qPCR的反应质量控制是使用ACTB作为参考基因来进行。

(4)粪便血红蛋白测

用粪便免疫化学测试(FIT)检测粪便血红蛋白，并且结果为阳性或阴性。

(5)用公式产生得分

将BMP3、NDRG4和KRAS基因的qPCR检测的Ct值以及粪便血红蛋白测试的阳性和阴性结果代入如下逻辑回归公式中：

P＝e

其中：P是综合指数，K＝＝a*ΔCt1+b*ΔCt2+c*ΔCt3+d*FIT+X，e是自然常数，a、b、c、d、X是临床常数。ΔCt1、ΔCt2和ΔCt3是靶基因的Ct值减去参考基因的Ct值。

如果P值等于或大于预定阈值，则测试结果为阳性，否则为阴性。阳性结果表明，受试者可能患有CRC或AA。

(6)测试结果

检测实施例3的八十一个粪便样品，并且BMP3和NDRG4基因的引物和探针的不同组合的结果显示于表24中。

可以看出：(1)组合编号4、5和7优于其他六种组合。考虑到所测试的所有引物和探针都是优选的并且优于其他引物和探针(见实施例3)，所述三种特定组合优于BMP3和NDRG4引物/探针的任何已知组合。(2)用于包含BMP3、NDRG4、KRAS基因的CRC和AA检测和粪便血红蛋白检测的试剂盒的灵敏度和特异性显著高于BMP3或NDRG4单基因甲基化检测的灵敏度和特异性。(3)用于亚洲人群(例如，中国人群)的CRC检测的试剂盒的灵敏度和特异性明显优于现有的类似产品，如

本文中引用的每篇专利、专利申请和出版物的公开内容(包括权利要求、附图和/或图式)通过引用以其整体特此并入本文。

除非另外定义，否则本文中的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可以使用与本文所述的那些方法和材料类似或等效的任何方法和材料，但本文描述了优选方法和材料。引用的所有出版物、专利和专利公开案出于所有目的通过引用以其整体并入本文。

仅针对先于本申请的申请日的披露内容提供本文所讨论的出版物。本文中的任何内容都不应视为承认本发明因在先发明而无权早于这个出版物。

尽管已经结合本发明的具体实施方案对本发明进行了描述，但应当理解，能够进行进一步修改，并且本申请意图涵盖对本发明的任何改变、应用或调整，所述改变、应用或调整大体上符合本发明的原理并且包括与本公开文本的此类偏离，所述偏离在本发明所属领域内的已知或习惯实践的范围内，并且可以适用于上文所述的和如下在所附权利要求范围内的实质特征。

序列表

<110> 杭州诺辉健康科技有限公司

李存耀

李慧

郑伟贤

杨蛟

刘刚

吕宁

陈一友

<120> 筛查结直肠癌和晚期腺瘤的试剂盒及其应用

<130> NEWH-017/01WO 333709-2028

<150> CN 201810502387.9

<151> 2018-05-23

<150> CN 201810502359.7

<151> 2018-05-23

<160> 70

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 271

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (12)..(12)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (33)..(33)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (69)..(69)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (80)..(80)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (83)..(83)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (85)..(85)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (106)..(106)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (120)..(120)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (123)..(123)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (127)..(127)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (132)..(132)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (139)..(139)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (141)..(141)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (152)..(152)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (154)..(154)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (189)..(189)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (200)..(200)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (219)..(219)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (227)..(227)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (236)..(236)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (240)..(240)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (242)..(242)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (247)..(247)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (254)..(254)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (258)..(258)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (264)..(264)

<223> 甲基化的

<400> 1

gttagtttgg tcgggtgttt ttaaaaataa agcgaggagg gaaggtatag atagattttg 60

aaaatattcg ggttatatac gtcgcgattt atagtttttt tttagcgttg gagtggagac 120

ggcgttcgta gcgttttgcg cgggtgaggt tcgcgtagtt gttggggaag agtttatttg 180

ttaggttgcg ttgggttagc gtagtaagtg gggttggtcg ttatttcgtt gtattcggtc 240

gcgtttcggg tttcgtgcgt tttcgtttta g 271

<210> 2

<211> 236

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (9)..(9)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (12)..(12)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (18)..(18)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (20)..(20)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (25)..(25)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (29)..(29)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (48)..(48)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (50)..(50)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (53)..(53)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (55)..(55)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (62)..(62)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (66)..(66)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (74)..(74)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (78)..(78)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (85)..(85)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (98)..(98)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (100)..(100)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (109)..(109)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (118)..(118)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (120)..(120)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (122)..(122)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (130)..(130)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (132)..(132)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (137)..(137)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (141)..(141)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (159)..(159)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (165)..(165)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (170)..(170)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (172)..(172)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (177)..(177)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (181)..(181)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (191)..(191)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (202)..(202)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (204)..(204)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (210)..(210)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (216)..(216)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (218)..(218)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (221)..(221)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (226)..(226)

<223> 甲基化的

<400> 2

tgagaagtcg gcgggggcgc ggatcgatcg gggtgttttt taggtttcgc gtcgcggttt 60

tcgttcgttt tttcgttcgt ttatcgggta ttttagtcgc gtagaaggcg gaagttacgc 120

gcgagggatc gcggttcgtt cgggattagt tttaggttcg gtatcgtttc gcgggtcgag 180

cgtttatatt cgttaaattt acgcgggtac gttttcgcgg cgtatcgttt ttagtt 236

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 3

tttgaaaata ttcgggttat atacgtcgc 29

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 4

ataaactctt ccccaacaac tacgcgaa 28

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 5

agcgttggag tggagacggc gttcg 25

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 6

atcgatcggg gtgtttttta ggtttc 26

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 7

ccttctacgc gactaaaata cccgat 26

<210> 8

<211> 31

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 8

cgtcgcggtt ttcgttcgtt ttttcgttcg t 31

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 9

aatattcggg ttatatacgt cgcga 25

<210> 10

<211> 28

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 10

gcaacctaac aaataaactc ttccccaa 28

<210> 11

<211> 26

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 11

tggagtggag acggcgttcg tagcgt 26

<210> 12

<211> 17

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 12

gcgggtgaga agtcggc 17

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 13

gtaacttccg ccttctacgc 20

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 14

taggtttcgc gtcgcggttt tcgtt 25

<210> 15

<211> 27

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 15

aatattcggg ttatatacgt cgcgatt 27

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 16

acttactacg ctaacccaac g 21

<210> 17

<211> 28

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 17

tagcgttgga gtggagacgg cgttcgta 28

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 18

cggttttcgt tcgttttttc g 21

<210> 19

<211> 26

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 19

aacctaaaac taatcccgaa cgaacc 26

<210> 20

<211> 28

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 20

tcgtttatcg ggtattttag tcgcgtag 28

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 21

gagtggagac ggcgttcgta 20

<210> 22

<211> 23

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 22

ccacttacta cgctaaccca acg 23

<210> 23

<211> 26

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 23

cgggtgaggt tcgcgtagtt gttggg 26

<210> 24

<211> 23

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 24

gggtgttttt taggtttcgc gtc 23

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 25

cgtaacttcc gccttctacg c 21

<210> 26

<211> 40

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 26

acgcgactaa aatacccgat aaacgaacga aaaaacgaac 40

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 27

ttaggttgcg ttgggttagc g 21

<210> 28

<211> 22

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 28

actccgaaaa cgcaaaaaac cg 22

<210> 29

<211> 26

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 29

attcggtcgc gtttcgggtt tcgtgc 26

<210> 30

<211> 19

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 30

gacccgcgaa acgataccg 19

<210> 31

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 31

tattcgggtt atatacgtcg c 21

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 32

cttactacgc taacccaacg 20

<210> 33

<211> 26

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 33

cccaacaact acgcgaacct cacccg 26

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 34

tcgcgcgtaa cttccgcctt 20

<210> 35

<211> 22

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 35

aacttgtggt agttggaggt ga 22

<210> 36

<211> 25

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 36

aacttgtggt agttggagct gggga 25

<210> 37

<211> 22

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 37

aacttgtggt agttggagtt gt 22

<210> 38

<211> 22

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 38

aaacttgtgg tagttggggc tt 22

<210> 39

<211> 22

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 39

aaacttgtgg tagttggtgc ta 22

<210> 40

<211> 22

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 40

aacttgtggt agttggagca gc 22

<210> 41

<211> 22

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 41

aaacttgtgg tagttggagc tc 22

<210> 42

<211> 24

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 42

gaatggtcct gcaccagtaa tatg 24

<210> 43

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 43

agggcttctt gtcctttcct t 21

<210> 44

<211> 20

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 44

cgtgctcgat ggggtacttc 20

<210> 45

<211> 26

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 45

aggcaagagt gccttgacga tacagc 26

<210> 46

<211> 27

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 46

cgtgatggtg ggcatgggtc agaagga 27

<210> 47

<211> 20

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 47

agtttggtgt aagttaagag 20

<210> 48

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 48

ctaactctat tttaaacrcc a 21

<210> 49

<211> 23

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 49

gttttaattt ttggaaaagg taa 23

<210> 50

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 50

acctaacaaa taaactcttc c 21

<210> 51

<211> 22

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 51

gaaggtatag atagattttg aa 22

<210> 52

<211> 24

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 52

cacctaacac aactttacra aact 24

<210> 53

<211> 26

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 53

gtatttagtt atggttgggg ygagta 26

<210> 54

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 54

ctcacctact actaccgccc r 21

<210> 55

<211> 25

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 55

aggtttttga gtttttggtt ttttt 25

<210> 56

<211> 20

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 56

ccctccaaac cccctataac 20

<210> 57

<211> 20

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 57

ggatggggat gtttttgtag 20

<210> 58

<211> 20

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 58

rgrgaaacct aaaaaacacc 20

<210> 59

<211> 18

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 59

gyggagyggg tgagaagt 18

<210> 60

<211> 20

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 60

craacaacca aaaacccctc 20

<210> 61

<211> 23

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 61

gttygttygg gattagtttt agg 23

<210> 62

<211> 19

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 62

crcaaacraa aaacraaac 19

<210> 63

<211> 18

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 63

gyggygtttt ygtttttg 18

<210> 64

<211> 20

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 64

cracractaa aaatccccaa 20

<210> 65

<211> 271

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (12)..(12)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (33)..(33)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (69)..(69)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (80)..(80)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (83)..(83)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (85)..(85)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (106)..(106)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (120)..(120)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (123)..(123)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (132)..(132)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (139)..(139)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (141)..(141)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (152)..(152)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (154)..(154)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (189)..(189)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (200)..(200)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (219)..(219)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (227)..(227)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (240)..(240)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (242)..(242)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (247)..(247)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (254)..(254)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (258)..(258)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (264)..(264)

<223> 甲基化的

<400> 65

gccagtttgg ccgggtgttc ccaaaaataa agcgaggagg gaaggtacag acagatcttg 60

aaaacacccg ggccacacac gccgcgacct acagctcttt ctcagcgttg gagtggagac 120

ggcgcccgca gcgccctgcg cgggtgaggt ccgcgcagct gctggggaag agcccacctg 180

tcaggctgcg ctgggtcagc gcagcaagtg gggctggccg ctatctcgct gcacccggcc 240

gcgtcccggg ctccgtgcgc cctcgcccca g 271

<210> 66

<211> 236

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (9)..(9)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (12)..(12)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (18)..(18)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (20)..(20)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (25)..(25)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (29)..(29)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (48)..(48)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (50)..(50)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (53)..(53)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (55)..(55)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (62)..(62)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (66)..(66)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (74)..(74)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (78)..(78)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (85)..(85)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (98)..(98)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (100)..(100)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (109)..(109)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (118)..(118)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (120)..(120)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (122)..(122)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (130)..(130)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (132)..(132)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (137)..(137)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (141)..(141)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (159)..(159)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (165)..(165)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (170)..(170)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (172)..(172)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (177)..(177)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (181)..(181)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (191)..(191)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (202)..(202)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (204)..(204)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (210)..(210)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (216)..(216)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (218)..(218)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (221)..(221)

<223> 甲基化的

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (226)..(226)

<223> 甲基化的

<400> 66

tgagaagtcg gcgggggcgc ggatcgaccg gggtgtcccc caggctccgc gtcgcggtcc 60

ccgctcgccc tcccgcccgc ccaccgggca ccccagccgc gcagaaggcg gaagccacgc 120

gcgagggacc gcggtccgtc cgggactagc cccaggcccg gcaccgcccc gcgggccgag 180

cgcccacacc cgccaaaccc acgcgggcac gcccccgcgg cgcaccgccc ccagcc 236

<210> 67

<211> 271

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 67

gttagtttgg tcgggtgttt ttaaaaataa agcgaggagg gaaggtatag atagattttg 60

aaaatattcg ggttatatac gtcgcgattt atagtttttt tttagcgttg gagtggagac 120

ggcgttcgta gcgttttgcg cgggtgaggt tcgcgtagtt gttggggaag agtttatttg 180

ttaggttgcg ttgggttagc gtagtaagtg gggttggtcg ttatttcgtt gtattcggtc 240

gcgtttcggg tttcgtgcgt tttcgtttta g 271

<210> 68

<211> 271

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 68

gttagtttgg ttgggtgttt ttaaaaataa agtgaggagg gaaggtatag atagattttg 60

aaaatatttg ggttatatat gttgtgattt atagtttttt tttagtgttg gagtggagat 120

ggtgtttgta gtgttttgtg tgggtgaggt ttgtgtagtt gttggggaag agtttatttg 180

ttaggttgtg ttgggttagt gtagtaagtg gggttggttg ttattttgtt gtatttggtt 240

gtgttttggg ttttgtgtgt ttttgtttta g 271

<210> 69

<211> 236

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 69

tgagaagtcg gcgggggcgc ggatcgatcg gggtgttttt taggtttcgc gtcgcggttt 60

tcgttcgttt tttcgttcgt ttatcgggta ttttagtcgc gtagaaggcg gaagttacgc 120

gcgagggatc gcggttcgtt cgggattagt tttaggttcg gtatcgtttc gcgggtcgag 180

cgtttatatt cgttaaattt acgcgggtac gttttcgcgg cgtatcgttt ttagtt 236

<210> 70

<211> 236

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 70

tgagaagttg gtgggggtgt ggattgattg gggtgttttt taggttttgt gttgtggttt 60

ttgtttgttt ttttgtttgt ttattgggta ttttagttgt gtagaaggtg gaagttatgt 120

gtgagggatt gtggtttgtt tgggattagt tttaggtttg gtattgtttt gtgggttgag 180

tgtttatatt tgttaaattt atgtgggtat gtttttgtgg tgtattgttt ttagtt 236