一株促进兰科种子萌发的膨大革孔菌菌株及其应用

摘要

本发明提供了一株促进兰科种子萌发的膨大革孔菌(Coriolopsis strumosa)菌株及其应用，属于共生真菌技术领域。本发明提供的菌株Epi910来自树兰种子组培萌发过程中的真菌，通过对从培养基、原球茎中分离获得的菌株ITS、nLSU等片段测序比对结果结合形态特点，鉴定为膨大革孔菌。菌株Epi910以菌丝团形式定殖于树兰、硬叶兰的种子和原球茎细胞内，同时通过共生萌发试验，验证Epi910与胶膜菌具有类似的功能，可促进包括树兰和硬叶兰在内的兰科植物种子萌发形成幼苗。膨大革孔菌‑兰科植物种子共生萌发体系，可作为胶膜菌属真菌之外新的共生模式，为全面解析真菌‑兰科植物共生机制提供新的研究对象。

说明书

技术领域

本发明属于共生真菌技术领域，具体涉及一株促进兰科种子萌发的膨大革孔菌菌株及其应用。

背景技术

兰科(Orchidaceae)植物是被子植物中较为进化的类群之一，其种子微小、没有胚乳，仅为构造简单的种皮包裹着一个未发育成熟的胚，缺乏萌发所需的营养。自然条件下兰科植物种子需与真菌建立共生关系，依靠真菌为其提供营养和信号物质，以促进萌发与幼苗形成。自身繁殖率低加之近年来栖息地环境破坏导致兰科植物资源更加濒危，而通过筛选适合的真菌进行种子的共生萌发可以有效地实现兰科植物的种质保育及濒危种类野生居群的生态恢复。

目前，兰科植物共生真菌研究主要集中在胶膜菌科(Tulasnellaceae)、角担菌科(Ceratobasidiaceae)和蜡壳耳目(Sebacinales)这3大类群，开发共生真菌的新类群或对现有类群的功能研究验证，对拓宽兰科植物共生真菌的范围及对兰科植物保育均具有重要意义。

革孔菌属(Coriolopsis)属于多孔菌科，现有研究发现，该属真菌多含漆酶等木质纤维素降解酶类，与多孔菌科其他物种一同在森林生态系统的物质循环和能量流动方面起着重要作用，未发现其在兰科植物共生萌发中有作用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一株促进兰科种子萌发的膨大革孔菌菌株Epi910及其应用，可有效促进树兰、硬叶兰的种子萌发。

本发明提供了一株促进兰科种子萌发的膨大革孔菌(Coriolopsis strumosa)菌株Epi910，所述菌株Epi910的ITS序列如SEQ ID NO：1所示，所述菌株Epi910的nLSU序列如SEQ ID NO：2所示，所述菌株Epi910的nSSU序列如SEQ ID NO：3所示，所述菌株Epi910的mtSSU序列如SEQ ID NO：4所示，所述菌株Epi910的EF1-α序列如SEQ ID NO：5所示，所述菌株Epi910的RPB1序列如SEQ ID NO：6所示，所述菌株Epi910的RPB2序列如SEQ ID NO：7所示。

优选的，所述菌株Epi910与树兰(Epidendrum radicans)种子或硬叶兰(Cymbidium bicolor)种子共生时，所述菌株Epi910的菌丝定殖在树兰种子或硬叶兰种子细胞内部。

优选的，所述菌株Epi910的保藏编号为CGMCC No.21081。

本发明提供了所述膨大革孔菌菌株Epi910在兰科植物种子萌发中的应用。

优选的，所述兰科植物种子包括树兰种子和硬叶兰种子。

优选的，所述兰科植物种子萌发时所用培养基包括OMA培养基。

优选的，所述膨大革孔菌菌株Epi910联合胶膜菌(Tulasnella sp.)菌株Pap12在兰科植物种子萌发中的应用。

本发明提供的促进兰科种子萌发的膨大革孔菌(Coriolopsis strumosa)菌株Epi910，经过多片段分子鉴定，结果表明，除RPB1外，ITS、nLSU、nSSU、mtSSU、EF1-α、RPB2片段均与膨大革孔菌相似度较高，同时联合ITS和nLSU片段构建系统发育树，结果表明Epi910与膨大革孔菌完全聚成一个分枝，支持强度为100％，因此，本发明结合分子鉴定和形态特点，初步鉴定菌株Epi910为膨大革孔菌。兰科植物种子共生萌发实验表明，Epi910可有效促进树兰、硬叶兰种子萌发，菌丝在树兰种皮未破裂时即以菌丝团形式定殖在种子细胞内。Epi910可以促进树兰种子萌发，但共生萌发效率低于在MS1培养基上非共生萌发和与胶膜菌属菌株Pap12共生萌发效率；但显著高于在不接菌的OMA培养基上萌发效率。硬叶兰种子与Epi910共生萌发效率与MS1培养基上非共生萌效率接近，显著高于胶膜菌属菌株Pap12共生效率。然而Epi910对石斛兰种子萌发的促进作用不显著，在与石斛兰共生萌发中仅观察到菌丝附着在种皮上，未见菌丝定殖在细胞内部。可见膨大革孔菌菌株Epi910能够有效促进包括树兰、硬叶兰等兰科种子萌发而对石斛兰种子萌发无促进作用。

本发明提供了所述膨大革孔菌菌株Epi910在兰科植物种子萌发中的应用。实验证明，菌株Epi910对兰科植物种子萌发的促进是具有选择性的，对树兰和硬叶兰种子的共生萌发中能促进种子萌发至幼苗，而在与石斛兰种子共生萌发中难以形成幼苗，而对照菌株(胶膜菌属真菌)可有效促进树兰、硬叶兰和石斛兰种子萌发。

附图说明

图1为膨大革孔菌菌株Epi910菌落形态；

图2为基于ITS和nLSU序列联合构建的膨大革孔菌及相关真菌的最大似然树，分支点上的数值为Bootstrap法重复1000次评估得到的各节点的支持率，仅显示Bootstrap≥50％；

图3为不同兰科植物与菌株Epi910共生萌发情况，其中图3A为Epi910与树兰种子共生萌发，菌丝团在种胚中形成情况；图3B为Epi910菌丝团在树兰细胞中定殖；图3C为Epi910在树兰原球茎中定殖；图3D为Epi910与硬叶兰种子共生萌发，菌丝团在种胚中形成情况；图3E为Epi910菌丝团在树兰细胞中定殖；图3F为Epi910在硬叶兰原球茎中定殖；图3G为Epi910菌丝围绕在石斛兰种子周围；图3H为Epi910与树兰共生萌发的幼苗；图3I为Epi910与树兰共生萌发的幼苗；标尺＝5m；

图4为不同菌株与兰科种子萌发效果比较，其中图4A为不同菌株与树兰种子萌发结果；图4B为不同菌株与硬叶兰种子萌发结果；图4C为不同菌株与石斛兰种子萌发结果。

生物材料保藏信息

膨大革孔菌(Coriolopsis strumosa)菌株，本发明所述的膨大革孔菌菌种保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2020年月03日。地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，生物保藏编号为CGMCC No.21081，菌株编号为Epi910。

具体实施方式

本发明提供了一株促进兰科种子萌发的膨大革孔菌(Coriolopsis strumosa)菌株Epi910，所述菌株Epi910的ITS序列如SEQ ID NO：1所示，所述菌株Epi910的nLSU序列如SEQ ID NO：2所示，所述菌株Epi910的nSSU序列如SEQ ID NO：3所示，所述菌株Epi910的mtSSU序列如SEQ ID NO：4所示，所述菌株Epi910的EF1-α序列如SEQ ID NO：5所示，所述菌株Epi910的RPB1序列如SEQ ID NO：6所示，所述菌株Epi910的RPB2序列如SEQ ID NO：7所示。经比对，结果表明，除RPB1外，其余6个基因片段均与膨大革孔菌相似度最高。鉴于革孔菌属提交序列多集中在ITS和nLSU片段，故联合ITS和nLSU片段构建系统发育树，结果表明Epi910与膨大革孔菌完全聚成一个分枝，支持强度为100％。同时还观察菌株Epi910的菌落及菌丝形态学特点，菌株Epi910在PDA培养基上形成的菌落为圆形，生长迅速，正面呈白色，具有大量气生菌丝，菌落边缘整齐且菌丝较薄；菌落背面呈白色，随着培养时间的延长菌落背面部分区域变为褐色；菌丝的生长速度0.27±0.03mm/h，直径2.07±0.20μm。在OMA培养基上菌丝极为稀薄，培养30～50d后可产生淡褐色菌核。结合分子和形态特点，初步鉴定菌株Epi910为膨大革孔菌。

在本发明中，所述菌株Epi910与树兰种子或硬叶兰种子共生时，优选所述菌株Epi910以菌丝团形式定殖在树兰或硬叶兰的种子或圆球茎细胞内部。然而所述菌株Epi910与石斛种子共生时，未见菌丝定殖在细胞内部。菌株Epi910可有效促进树兰、硬叶兰种子萌发，但对石斛兰种子萌发的促进作用不显著，表明菌株Epi910对兰科植物种子萌发的促进具有选择性。本发明将所述菌株Epi910进行生物保藏，保藏编号优选为CGMCC No.21081。

本发明提供了所述膨大革孔菌菌株Epi910在兰科植物种子萌发中的应用。所述兰科植物种子优选包括树兰种子和硬叶兰种子。当菌株Epi910与树兰共生萌发时，共生萌发40～60d，叶片伸长并分化出根，形成幼苗。所述兰科植物种子萌发时所用培养基优选包括OMA培养基。Epi910可以促进树兰种子萌发，但共生萌发效率低于在MS1培养基上非共生萌发和与胶膜菌属(Tulasnella sp.)菌株Pap12共生萌发效率；但显著高于在不接菌的OMA培养基上萌发效率。当菌株Epi910与硬叶兰种子共生萌发时，共生萌发180d时，形成幼苗。硬叶兰种子与Epi910共生萌发效率与MS1培养基上非共生萌效率接近，显著高于胶膜菌属菌株Pap12共生效率。同时，菌株Epi910不能与石斛兰种子共生萌发中形成幼苗，而胶膜菌属菌株Pap12能促进与石斛兰种子萌发，并分化出原生分生组织，部分原球茎叶片伸长。

鉴于胶膜菌(Tulasnella sp.)菌株Pap12既能有效促进包括树兰、硬叶兰和石斛兰种子共生萌发及形成幼苗，同时经实验验证，胶膜菌属真菌与膨大革孔菌菌株Epi910进行共生培养时不会发生拮抗作用，因此，本发明提供了所述膨大革孔菌菌株Epi910优选联合胶膜菌(Tulasnella sp.)菌株在兰科植物种子萌发中的应用。所述胶膜菌菌株优选为胶膜菌菌株Pap12。

下面结合实施例对本发明提供的一株促进兰科种子萌发的膨大革孔菌菌株及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1材料与方法

1.1供试菌株

菌株Epi910分离自无菌萌发过程中树兰原球茎。2018年9月培养在OMA培养基上的树兰种子相较其它种子提前萌发，通过原球茎组织切片法在PDA培养基上分离真菌，经纯化获得菌株Epi910，转接至PDA试管4℃保存。

胶膜菌属(Tulasnella)真菌Pap12(GenBank登录号：MT804628)，分离自兜兰属(Paphiopedilum sp.)植物根部，可促进树兰(Epidendrum radicans)、硬叶兰(Cymbidiumbicolor)和石斛兰(Dendrobium sp.)种子萌发。

1.2植物材料

分别收集硬叶兰、树兰和石斛兰蒴果用于共生萌发。

收获蒴果要求：种子成熟，果荚健康未开裂，表面无明显病虫害；收获之后用75％乙醇擦拭表面，于4℃保存，3d内播种。

1.3培养基

真菌培养基：PDA培养基，200.0g/L去皮土豆+20.0g/L葡萄糖+15.0g/L琼脂，自然pH值。

共生萌发培养基：OMA培养基，3.0g/L燕麦粉+6.0g/L琼脂，自然pH值。

非共生萌发培养：MS1培养基，MS+0.5mg/L 6-BA+10.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂，pH值6.3。

1.4菌株鉴定

1.4.1真菌DNA提取：将真菌接种至铺有玻璃纸的PDA固体培养基上培养7d，用无菌牙签刮取少量菌丝，采用植物基因组快速提取试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)提取真菌基因组DNA，用于PCR扩增。

1.4.2PCR扩增及测序：参考Ji et al.(2019)PCR引物和扩增程序，共扩增7个基因片段(表1)。采用40μLPCR扩增反应体系：模板2.0μL，10×Ex TaqBuffer4.0μL，dNTPMixture 3.0μL，引物(10μmol/L)各0.4μL，TaKaRa Ex Taq 0.3μL，剩余用ddH

1.4.3系统发育分析：将Epi910的ITS序列在GenBank进行比对，确定菌株所在属。从NCBI核酸数据库下载同属主要物种ITS和nLSU序列，使用megaX软件通过最大似然法构建系统发育树，采用TN93+G+I模型，以Boletopsis leucomelaena作为外类群。

2结果与分析

2.1菌株Epi910的分离与菌落特征

无菌萌发过程中被真菌污染的树兰种子在原始培养皿中萌发较为整齐，培养80d后，部分原球茎已分化出叶片，对原球茎进行徒手切片发现有真菌定殖于原球茎基部细胞内，真菌特异性染色表明该真菌以菌丝团的形式定殖于树兰原球茎细胞内部。经分离纯化获得菌株Epi910。

菌株Epi910在PDA培养基上形成的菌落为圆形，生长迅速，正面呈白色，具有大量气生菌丝，菌落边缘整齐且菌丝较薄(图1A)；菌落背面呈白色，随着培养时间的延长菌落背面部分区域变为褐色；菌丝的生长速度0.27±0.03mm/h，直径2.07±0.20μm。在OMA培养基上菌丝极为稀薄，培养30-50d后可产生淡褐色菌核(图1B)。

2.2 Epi910菌株系统发育分析

菌株Epi910基因组DNAPCR产物序列在NCBI核酸数据库比对结果显示(表1)，除RPB1外，所有片段均与膨大革孔菌相似度最高。革孔菌属提交序列多集中在ITS和nLSU片段，故联合ITS和nLSU片段构建系统发育树(图2)，结果表明Epi910与膨大革孔菌完全聚成一个分枝，支持强度为100％，初步鉴定菌株Epi910为膨大革孔菌。

表1菌株Epi910 PCR扩增DNA序列BLAST比对结果

实施例2

1.兰科植物种子共生萌发

将收集到的蒴果去除果柄及残留的附着物，自来水下冲洗1min，滤纸吸干多余水分后转移到超净工作台内。75％乙醇浸泡消毒30s，无菌水冲洗3次，滤纸吸干水分，用无菌手术刀剖开果皮，用镊子挑取种子均匀撒在培养基上。

分别将培养7d的菌株Epi910和Pap12切取小块置于播种后的OMA培养基中央；同时将种子接种在不接菌的OMA培养基和MS1培养基上作为对照。每处理接种10皿，每种兰花播种3个蒴果。将培养皿封口后于培养室进行培养，光照周期16h/8h(光/暗)，温度25.0±2.0℃。每周观察并拍照，记录种子萌发情况。随机抽取共生萌发的原球茎在PDA培养基上进行组织切片培养，分离内生真菌扩增ITS片段，确定原球茎内仅有目的菌株定殖，未被其他真菌污染。

兰科植物种子萌发不同阶段形态特征的划分参考Stewart&Zettler(2002)，分为6个阶段：0级：种子未萌发；1级：种胚吸水膨胀，表皮毛或假根出现；2级：种胚继续膨大，种皮破裂；3级：原生组织出现；4级：分化出叶；5级：叶继续伸长，形成幼苗。种子萌发情况统计参考(Meng et al.2019)：分别用0、1、(2+3)和(4+5)阶段来统计不萌发、种子萌发(G)、原球茎(P)和幼苗(S)数量，计算种子总数(t)。发芽种子(G)、原球茎(P)和幼苗(S)的百分比分别计算如下：G＝100×(G+P+S)/t，P＝100×P/t，S＝100×S/t。树兰、硬叶兰和石斛兰统计时间分别为共生萌发后60d、180d和120d。

所得结果经反正弦平方根转换后，用SPSS 19.0.0软件在P<0.05水平上对数据进行单因素方差(ANOVA)和邓肯(Duncan)多重范围检验，结果表示为平均值±标准偏差。

1.1真菌定殖部位观察

收集萌发至第2至4级的兰科植物原球茎制作徒手切片，显微镜下观察菌丝在原球茎中的定殖部位。

1.2真菌特异性染色观察

参考Yamamoto et al.(2017)方法，进行真菌特异性染色，观察真菌在细胞内部定殖情况。收集萌发至第0-4级原球茎，FAA溶液中固定至少24h，取出原球茎用蒸馏水冲洗去除FAA。将冲洗后的原球茎放入10％(W/V)KOH溶液121℃高压灭菌20min后用2％(V/V)HCl溶液中和5min，将原球茎转移至10％(V/V)派克黑墨水染色液(10％墨水，3％乙酸)，100℃煮沸30min，吸去染色液，100％乳酸脱水，4℃保存。显微镜下观察菌丝团在原球茎中的定殖情况及细胞内菌丝团定殖情况，并进行显微拍照。

2.兰科植物种子与菌株Epi910共生萌发结果

Epi910可有效促进树兰、硬叶兰种子萌发，但对石斛兰种子萌发的促进作用不显著。菌丝在树兰种皮未破裂时即以菌丝团形式定殖在种子细胞内(图3A、图3B)；在与石斛兰共生萌发中仅观察到菌丝附着在种皮上(图3G)，未见菌丝定殖在细胞内部。

树兰种子与Epi910共生萌发10d后，可观察到种胚变绿膨大，呈圆球状，种子萌发至1级，真菌特异性染色可观察到菌丝已定殖在树兰细胞中(图3A、图3B)；接种后20d，种胚继续膨大，形成原球茎，萌发至2级；共生萌发30d时原球茎体积继续增大并开始逐渐在尖端分化出原生分生组织，萌发至3级(图3C)；共生萌发40～60d，叶片伸长并分化出根，形成幼苗(图3H)。Epi910可以促进树兰种子萌发，但共生萌发效率低于在MS1培养基上非共生萌发和与胶膜菌属菌株Pap12共生萌发效率；但显著高于在不接菌的OMA培养基上萌发效率(图4A)。

硬叶兰种子与Epi910共生萌发50d后，可观察到种胚变绿膨大；约90d时形成原球茎，部分原球茎分化出盾片，萌发至3级，可观察到菌丝定殖在硬叶兰细胞中(图3D、图3E)；约120d时，原球茎体积继续增大并开始逐渐在尖端分化出原生分生组织，萌发至4级(图3F)；约180d时，形成幼苗(图3I)。硬叶兰种子与Epi910共生萌发效率与MS1培养基上非共生萌效率接近，显著高于胶膜菌属菌株Pap12共生效率(图4B)。

石斛兰种子与Epi910共生萌发约30d，可观察到种胚变绿膨大；接种后90d，种胚继续膨大，突破种皮，少量形成原球茎，真菌特异性染色观察到菌丝围绕在种子/原球茎周围(图3G)，未见菌丝进入细胞；同时期在MS1培养基和与菌株Pap12共生萌发的种子已萌发至第4～5阶段，分化出原生分生组织，部分原球茎叶片伸长。石斛兰种子与Epi910共生萌发效率与MS1培养基上非共生萌效率接近，但显著高于在不接菌的OMA培养基上萌发效率(图4C)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国林业科学研究院林业研究所

<120> 一株促进兰科种子萌发的膨大革孔菌菌株及其应用

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<212> DNA

<213> Coriolopsis strumosa

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attgacgctg agaaacgaag gttagggtag gaaataggat tagatacccc ggtactcctt 360

tctgtaaacg atgaatggta gtcattagtt ttataactag agacgaagtt aacacaataa 420

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<400> 5

ccaggccgac tgcgctatcc tcatcatcgc tggtggtacc ggcgaattcg aggcaggtat 60

ttccaaggat ggccagaccc gcgagcacgc cctcctcgcc tacactctcg gtgttaggca 120

gcttatcgtc gctgtcaaca agatggacac gaccaaggtg cgtctctagc gctgtgcttt 180

tgattgtcag gttcatcttg actgatgttg gtctgcagtg gtctgaggac cgtttcaacg 240

agatcatcaa ggagacgtcc accttcatca agaaagtcgg cttcaacccg aagtcgatcg 300

cgttcgtccc catctctggc tggcacggtg acaacatgtt ggaggagtcc accaagtaag 360

ttatgcattg tgtatgctcg ccccacctgc tcatattctc ttcagcatgc cctggtacaa 420

gggttggagc agggaggcga agtctggtac cgtcaagggc aagacgctcc tcgatgccat 480

tgacgctatc gagccccccg tccgtcc 507

<210> 6

<211> 1241

<212> DNA

<213> Coriolopsis strumosa

<400> 6

ttcattgtga aagtgaagaa gattttggag tgtatatgtg taaactgtgg tcgtctaaag 60

gctgatagcg tgagtgacct cttctttcgt ccctctcgtt tcgcacccca ccacccaatt 120

ttctgggggc tctctcctgt atcatggaga accccaaacc cgaactgcgt tagttctcga 180

caatcgaggc gttcttccac ccgtgacggg ggccgcgcgc gttttcggtc gcttgatcgc 240

cgcgtggtcc actgcacacg tccggtcatg gttggacacg cggttcgtgg tgaaatgggg 300

gctgagcgag gagtgcggaa aaaacaagag tagttggctc cttgtgggct actctgatgg 360

atggccaact gcacttgctg tgacgcagat tgagtgacat gttgtatgcc tggcacttga 420

gactcggttg tcgtagcccc ctgttgtatc cttttcgctg ttgtactgtc cgttctagat 480

gcagacagca agctgtctcg tcttctgagt ttcactcgct gacatcttga tcttcatgtc 540

tccttgctca cacggccgtg ctcgtcatcg tcttcgtgat gtaagtccga ctctaccttc 600

gcggaccgga ttcggcacat tcgcgacccg aaagcacgta tgcaagccgt ctggaactat 660

tgcaaaagca agatgatttg cgagacggat gaacccaagg aggataacga aggtggtgat 720

ccagaagagc ctaagaaggg ccatggcggt tgtggggcgc atcagcctca aatcaggaag 780

gagggactga agcttttcgt ccaatacaag cgtgggaagg acgaggacga ggtgtgtaat 840

ctgtcgtctt ctcagctcat acctcattca ttgtttgcag gatatgaaga atcttcagcc 900

agacaagcga ttgtttcccc ctcatgaggt ctatactgcg ttgaagaagg tctctgatgc 960

ggaccttcac ctccttggac tctcggtcga ctatgcccga ccagagtgga tgattctgac 1020

tgtgcttccc gtccctcctc cgcctgtaag gccaagtata gcagtggacg gcggaacgat 1080

gcggagtgaa gatgatctga cttacaagtt gggcgacatc atcaaggcct ctgcgaatgt 1140

tcggcgatgt gaacaggagg gagcacccgc tcatgtcatc aatgagtttg agcagttgct 1200

gcaggtgtgt atcgtcctgg agcaactaat aacctgtctg a 1241

<210> 7

<211> 1126

<212> DNA

<213> Coriolopsis strumosa

<400> 7

ttggcgatct cttccgcatg ctcttccgca agcttacaaa ggaagtctac cgttacctcc 60

aaaaggcagg ttccgtttgc ttgacagttt gtctaaccat ttctcaacat catcgcattt 120

agtgcgttga gacccataag gagttcaacc tatcgcttgc agtcaagcac aacaccatta 180

ccaatggtct caagtactcg cttgccacgg gtaactgggg cgaccagaag aagaccatgt 240

cggccaaggc aggggtgtct caagttctta accgttacac ttacgcgtcg acattgtcac 300

atctgcgtcg gtgtaacacg cctctcggtc gtgaagggaa gatcgcgaag cctcgtcagc 360

ttcacaacac tcattgggga atggtatgtc ccgcggaaac tccggaagga caagcatgtg 420

gcctcgtcaa gaacctttcg ctcatgtcct gcatctctgt cggcactctg tcagcccctg 480

tgatcgagtt cttggaggag tggggtcttg aatcgttgga ggagaacgct catgcgtcaa 540

caccgtgtac aaaggtgttc gtgaacggtg tctggatggg tgttcatcga gacccggtca 600

gtctcgtcaa gaccctcaga aagctccgtc gcaaggacga catcaactgc gaggtgtcag 660

tggtccgtga cattcgtgag cgcgagctcc gtttatacac agatgctggg cgcgtatgcc 720

gacctctctt catcgttgag aatcagcaac tcctcgttca gaagagacat atcgagaatc 780

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gtgtcatcga gttgctggat gccgaagaag aggagactgt catgatctgt atgacacctg 900

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aggttagact gtttgcatat ctttcattgc agtatgctta cacaca 1126

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tcctccgctt attgatatgc 20

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tactaccacc aagatct 17

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<212> DNA

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gtacccgctg aacttaagc 19

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ccaagcttga attcgtagtc atatgcttgt ctc 33

<210> 13

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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cccgtgttga gtcaaatta 19

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cagcagtcaa gaatattagt caatg 25

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gcyccygghc aycgtgaytt yat 23

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gaktgtcckg gwcattttgg 20

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cngcdatntc rttrtccatr ta 22

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gaygaymgwg atcayttygg 20

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cccatrgctt gyttrcccat 20