硫代二甲基胂酸致人角质形成细胞恶性转化细胞株及其应用

摘要

本发明公开了一种硫代二甲基胂酸致人角质形成细胞恶性转化细胞株及其应用，属于模型构建技术领域。本发明通过硫代二甲基胂酸对人角质形成细胞进行连续染毒培养，构建了一种无机砷代谢物硫代二甲基胂酸(DMMTAV)致人角质形成细胞恶性转化细胞模型，有助于识别鉴定砷甲基化代谢物的致癌性，说明了砷代谢物硫代二甲基胂酸(DMMTAV)低剂量长期暴露会引起皮肤细胞发生恶性转化，为砷致癌机制的研究提供了新的细胞模型基础和新的研究思路。

说明书

技术领域

本发明涉及一种硫代二甲基胂酸致人角质形成细胞恶性转化细胞株及其应用，属于模型构建技术领域。

背景技术

无机砷及其化合物是人类确定致癌物，我们过去常常认为无机砷在机体内的代谢是一个解毒的过程，然而近年来的研究发现其在代谢过程中会生成高毒性的产物硫代二甲基胂酸(DMMTA

目前，砷致癌机制的研究主要应用无机砷慢性染毒构建的体外细胞恶转模型，细胞恶转化模型是较好的研究致癌物致癌机制的材料。但是无机砷慢性染毒构建的体外细胞恶转模型有其局限性，没有充分考虑砷在体内的代谢转化和代谢产物的高毒性。此外，由于人体细胞的基因组比较稳定且具有有效的DNA修复机制，对外来损伤有较强的抵抗力，尤其对致癌物的损伤不如一些动物细胞敏感，相对于动物细胞来说比较难转化，目前还没有报道硫代二甲基胂酸细胞恶转化模型。

发明内容

为解决上述问题，本发明构建了一种无机砷代谢物硫代二甲基胂酸致人角质形成细胞恶性转化细胞模型，有助于识别鉴定砷甲基化代谢物的致癌性，也为砷致癌机制的研究提供了新的思路和模型基础。

本发明的第一个目的是提供一种硫代二甲基胂酸致人角质形成细胞恶性转化细胞株，于2020年12月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.21419，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明的第二个目的是提供一种转构建硫代二甲基胂酸致人角质形成细胞恶性转化细胞株的方法，具体包括采用含有0.5～1.0μM硫代二甲基胂酸的培养基对人角质形成细胞进行连续染毒培养，每隔20～30h进行换液，细胞融合度达到75～85％进行传代扩增，传代培养至30～40代获得所述的硫代二甲基胂酸致人角质形成细胞恶性转化细胞株。

进一步地，所述的硫代二甲基胂酸通过如下方法制备得到：

S1、将二甲基胂酸和硫酸钠溶于水中，缓慢加入浓硫酸，二甲基胂酸、硫酸钠和浓硫酸的摩尔比1:1.5～2:1.5～2，搅拌混匀10～24h；

S2、搅拌后向混合溶液中加入盐酸溶液进行脱水反应，反应后使用氯仿萃取；

S3、向S2步骤得到的有机相中加入饱和食盐水，收集下层清液；

S4、向下层清液中加入无水氯化钙，收集上清液，加热去除水分得到固体；

S5、采用己烷对S4步骤得到的固体进行重结晶，去除己烷后，得到所述的硫代二甲基胂酸。

进一步地，所述的重结晶是在0～4℃条件下静置10～20h。

进一步地，所述的培养基为DMEM高糖完全培养基。

进一步地，所述的DMEM高糖完全培养基中含有80～120μg/ml链霉素、80～120U/ml青霉素和8～12％胎牛血清。

进一步地，所述的应用中还包括采用检测细胞的MMP-9分泌情况、细胞迁移能力或软琼脂克隆形成能力，提示细胞发生恶性转化。

本发明的第三个目的是提供所述的硫代二甲基胂酸致人角质形成细胞恶性转化细胞株在作为硫代二甲基胂酸致癌机制研究的细胞模型中的应用。

本发明的第四个目的是提供所述的硫代二甲基胂酸致人角质形成细胞恶性转化细胞株在筛选或评估治疗无机砷导致的癌症的药物中的应用。

本发明的有益效果：

本发明构建了一种无机砷代谢物硫代二甲基胂酸(DMMTA

生物材料保藏：

硫代二甲基胂酸致人角质形成细胞恶性转化细胞株，于2020年06月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.19650，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

附图说明

图1为不同浓度(0-2μM)的DMMTA

图2为1.0μM的DMMTA

图3为1.0μM的DMMTA

图4为1.0μM的DMMTA

图5为1.0μM的DMMTA

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1：

无机砷代谢物硫代二甲基胂酸(DMMTA

确定合适的染毒剂量:不同浓度(0-2μM)的DMMTA

实施例2：

准备2皿正常的HaCaT细胞(O代细胞)，一皿用含1.0μM DMMTA

实施例3：

通过检测基质金属蛋白酶-9(MMP-9)，细胞倍增时间，细胞迁移能力以及细胞锚着独立生长的变化来鉴定细胞是否发生恶性转化。图2反映的是不同代数HaCaT细胞MMP-9的分泌变化，从中可以看出染毒培养至21，28，35代时，MMP-9的分泌相比传代对照组明显增加。图3反映的是不同代数HaCaT细胞倍增时间变化，从中可以看出染毒培养至28，35代时，细胞的倍增时间明显缩短。图4是用划痕实验检测染毒培养至35代时，HaCaT细胞迁移能力的变化，可以看出染毒培养至35代时，细胞的迁移能力明显增强。图5是用软琼脂克隆实验观测染毒培养至35代时细胞锚着独立生长的变化，可以看出传代对照组细胞在软琼脂中仅有个别微小集落形成，而染毒35代细胞能在软琼脂中形成明显的克隆集落，其克隆形成率明显高于传代对照组细胞。以上所述的细胞MMP-9的分泌情况，细胞倍增时间，细胞迁移能力以及软琼脂克隆形成能力都是常用的鉴定体外细胞恶性转化的指标。根据上述的实验结果，说明长期暴露于1.0μM硫代二甲基胂酸(DMMTA

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。