CYBB基因外显子表达变异在辅助鉴定慢性肉芽肿病中的应用

摘要

本发明公开了CYBB基因外显子表达变异在辅助鉴定慢性肉芽肿病中的应用。本发明提供了检测待测人基因组中CYBB基因第11号外显子是否缺失或突变或表达水平的物质在制备辅助检测待测人是否患有慢性肉芽肿病产品中的应用。本发明首次发现CYBB基因的第11外显子的缺失或表达水平与慢性肉芽肿病相关，同时本发明首次设计了用于检测CYBB基因的第11外显子的缺失或表达水平的引物对，并采用实时荧光定量PCR进行扩增，鉴定该基因的第11外显子是否缺失或表达水平是否变化，从而辅助判断待测人是否患有慢性肉芽肿病。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物医学领域，具体涉及CYBB基因外显子表达变异在辅助鉴定慢性肉芽肿病中的应用。

背景技术

慢性肉芽肿(chronic granulomatous disease)是致死性遗传性白细胞功能缺陷病。临床主要特征为患儿对各种过氧化氢酶阳性菌属，如葡萄球菌、沙雷菌、曲酶属等高度敏感，反复发生慢性细菌感染，感染局部形成慢性肉芽肿，以皮肤、肺及淋巴结广泛肉芽肿性损害为特点。发病多在2岁以内，少数可晚至10岁以后。约75％的病例为X-连锁隐性遗传，其余为常染色体隐性遗传，男女发病比例为9︰1。主要通过四唑氮蓝实验，筛查白细胞功能，再结合相应的X线检查进行确诊。诊断可能要延迟至青春期或成年后才能确诊，且难与G6-PD缺乏症、白细胞谷胱甘肽过氧化酶缺乏症、家族脂色素组织细胞增生症等疾病相鉴别。因此，能及早的应用分子检测手段检查发病原因，及时的进行治疗干预，尽可能的减少患者痛苦是当前科研人员迫不及待的心愿。

目前主要基因检测方法为二代测序，主要包含基因包高通量测序、基因数据分析和疑似致病突变验证三个环节。测序效率高，但是价格昂贵且耗时长(平均1个月出结果)。另外此方法适用于点突变及50bp以内的缺失插入突变(微小突变)以及2个以上外显子水平的缺失检测，不适用单个外显子的缺失、动态突变及复杂重组等特殊类型突变的检测，依据人类基因突变数据库(Human Gene Mutation Database)记录CYBB基因目前的突变种类达到790多种，其中大片段缺失占比达到15.57％。因此，较为准确的鉴定基因拷贝数变化的方法显得尤为重要。

发明内容

本发明一个目的是提供了检测待测人基因组中CYBB基因第11号外显子是否缺失或突变或表达水平的物质的用途。

本发明提供了检测待测人基因组中CYBB基因第11号外显子是否缺失或突变或表达水平的物质在制备辅助检测待测人是否患有慢性肉芽肿病产品中的应用。

上述应用中，所述CYBB基因第11号外显子为X染色体第37665640-37665786位(即序列1第26310-26456位)。

上述应用中，所述物质为如下1)或2)：

1)所示的物质包括对待测人基因组中CYBB基因进行高通量二代测序测序相关试剂或仪器；

2)所示的物质包括扩增待测人基因组中CYBB基因第11号外显子的引物或含有所述引物的PCR试剂或试剂盒。

上述应用中，所述扩增待测人基因组中CYBB基因第11号外显子的引物由如下a和b组成：

a、序列4所示的单链DNA分子或其衍生物；

b、序列5所示的单链DNA分子或其衍生物。

上述2)所示的物质还包括扩增内参基因CSF2RA的引物；

上述扩增内参基因CSF2RA的引物由如下c和d组成：

c、序列8所示的单链DNA分子或其衍生物；

d、序列9所示的单链DNA分子或其衍生物。

上述各单链DNA分子的衍生物为经过1个或几个碱基缺失、突变或取代得到的单链DNA分子。

上述应用为：检测待测人基因组中CYBB基因第11号外显子是否缺失或突变或表达水平，若与不患有慢性肉芽肿病的人相比，待测人的CYBB基因第11号外显子缺失或突变或表达量降低，则待测人候选候选患有慢性肉芽肿病，若与不患有慢性肉芽肿病的人相比，待测人的CYBB基因第11号外显子不缺失或无突变或表达量不降低，则待测人候选不患有慢性肉芽肿病；

在本发明的实施例中，经过测序，待测人CYBB基因第11号外显子全部缺失。

上述检测待测人基因组中CYBB基因第11号外显子是否缺失或突变或表达水平是通过如下方法实现的：

方法A：直接对待测人基因组中的CYBB基因进行高通量二代测序；

方法B：以待测人的基因组为模板，用序列4所示的引物和序列序列5所示的引物组成的引物对进行Q-PCR扩增，以不患有慢性肉芽肿病的人为对照，若待测人的扩增产物表达量低于不患有慢性肉芽肿病的人，则待测人CYBB基因11号外显子有缺失或表达量低；若待测人的扩增产物表达量不低于(等于或高于)不患有慢性肉芽肿病的人，则待测人CYBB基因11号外显子不缺失或表达量不低。

上述Q-PCR扩增使用罗氏LightCycler480实时荧光定量PCR检测仪检测，

其扩增体系中，各个引物的终浓度为200nM；扩增程序如实施例中的表3所示。

本发明另一个目的是提供一种辅助检测待测人是否患有慢性肉芽肿病产品。

本发明提供的产品为上述检测待测人基因组中CYBB基因第11号外显子是否缺失或突变或表达水平的物质。

本发明还有一个目的是提供一种辅助检测待测人是否患有慢性肉芽肿病的试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括扩增待测人基因组中CYBB基因第11号外显子的引物或含有所述引物的PCR试剂。

上述试剂盒中，所述扩增待测人基因组中CYBB基因第11号外显子的引物由如下a和b组成：

a、序列4所示的单链DNA分子或其衍生物；

b、序列5所示的单链DNA分子或其衍生物。

上述各单链DNA分子的衍生物为经过1个或几个碱基缺失、突变或取代得到的单链DNA分子。

上述试剂盒还包括扩增内参基因CSF2RA的引物；所述扩增内参基因CSF2RA的引物有如下c和d组成：

c、序列8所示的单链DNA分子或其衍生物；

d、序列9所示的单链DNA分子或其衍生物。

上述试剂盒还可以包括扩增CYBB基因的第10外显子的引物对和扩增CYBB基因的第12外显子的引物对。

上述扩增CYBB基因的第10外显子的引物对由序列2所示的单链DNA分子和序列3所示的单链DNA分子组成。

本发明首次发现CYBB基因的第11外显子的缺失或表达水平与慢性肉芽肿病相关，同时本发明首次设计了用于检测CYBB基因的第11外显子的缺失或表达水平的引物对，并采用实时荧光定量PCR进行扩增，鉴定该基因的第11外显子是否缺失或表达水平是否变化，从而辅助判断待测人是否患有慢性肉芽肿病。

本发明采用的引物及实时荧光定量PCR方法的有益之处在于：

(1)本发明采用实时荧光定量PCR检测技术，设计了全新的CYBB基因及内参引物用于表达量变化的检测。

(2)本发明进行高通量检测,在同一个PCR板进行检测，采用了8x12的96孔板反应体系，能够准确、快速、高效的进行多个患者样品的表达量检测。

(3)本发明极大的降低了CYBB基因表达量检测的成本，提高了基因表达量检测的准确性。

(4)本发明的原理可以应用到现有的任何荧光实时定量PCR仪器，方便使用，易于大范围内推广。

(5)本发明所述检测方法可以简单快速的检测CYBB基因的表达量，最低检测限为1ng/μL，用时短，从标本送检到得出结果可在3小时以内完成。

总之，使用本发明的引物及实验流程,可在同一个反应条件下同时检测3个与CYBB基因表达量相关的变异，特异性强，用时短，从标本送检到得出结果可在3小时以内完成。40分钟完成40个PCR循环(384孔板)，可应用于相对和绝对定量，结合最新的基于高分辨率熔解曲线的基因扫描，实现准确、快速和经济的检测CYBB基因的拷贝数变异。

本发明采用实时荧光PCR法检测CYBB基因的表达量数变化，实时荧光PCR法灵敏度高，分型准确，操作简便快捷，所用仪器容易普及，易于推广使用，同时也能够对大样本量进行快速检测。

附图说明

图1为患者家系图；

图2为患者二代测序图；

图3为患者家系CYBB基因10、11和12号外显子RT-Qpcr表达量。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、致病突变的获得

1、样品收集

申请人从深圳市儿童医院免疫科收集到慢性肉芽肿家系3人样品(图1，慢性肉芽肿患者、患者父亲和患者母亲)和正常人(非慢性肉芽肿患者或家系的健康男性)的样品，样品具体为待测人员的静脉外周血，所有参与本发明研究的家系成员均签署了知情同意书。

患者信息：男性，反复感染、左腋下包块1年余炎症等症状，住院期间监测血常规白细胞波动于17.11-35.43×10^9/L，CRP波动于43.48-109.05mg/L，体液免疫功能检查，淋巴细胞免疫分析六项等检测结果综合分析后初步怀疑是免疫功能异常，患有慢性肉芽肿，进一步进行基因检测以便确诊。

2、目标区域捕获与高通量测序

1)DNA提取、建库、测序

主要流程是利用捕获芯片将目标区域的DNA片段进行富集后再借助高通量二代测序平台进行测序。本研究采用目标序列捕获芯片(MyGenostics，全外显子探针为P039-Exome，北京迈基诺基因科技股份有限公司)对全基因组范围内约24000个基因的外显子及其上下游50bp区域进行捕获。捕获的具体过程如下：将患者基因组DNA随机打断成片段，与Illumina PE接头寡核苷酸混合物链接，对产物进行链接介导的聚合酶链式反应(ligation-mediated Polymerase chain reaction，LM-PCR)扩增纯化后得到DNA文库，并对其进行质量检测，将上述PCR产物与目标区域捕获芯片进行杂交以富集目标区域序列，借助Illumina Next 500测序平台对捕获的序列进行测序，并对原始数据进行初步处理，包括图像识别和样本区分。

2)生物信息分析

将原始测序数据去除污染和接头序列，然后利用BWA软件(http://bio-bwa.sourceforge.net/)将过滤后的序列比对到NCBI数据库人类基因组参考序列(hg19)上，利用GATK软件(https://software.broadinstitute.org/gatk/)分析得出单核苷酸变异(single nucleotide variation，SNV)和插入缺失突变(inserts and deletions，INDEL)的相关信息。然后通过ANNOVAR软件(http://annovar.openbioinformatics.org/en/latest/)对所有的SNP和INDEL进行注释。筛选掉正常人数据库中频率小于0.05的突变位点，正常人数据库包括千人基因组计划(http://www.1000genomes.or/)、Exome VariantServer(http://evs.gs.washington.edu/EVS)和EXAC(http://exac.broadinstitute.org/)。错义突变使用SIFT(http://sift.jcvi.org/)，PolyPhen-2(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)，MutationTaster(http://www.mutationtaster.org/)和GERP++(http://mendel.stanford.edu/SidowLab/downloads/gerp/index.html)软件进行致病性预测和保守性预测，剪切位点的改变用SPIDEX(http://www.deepgenomics.com/spidex)软件预测有害性，最终的遗传变异的致病性评估主要依据美国医学遗传学及基因组学学会(ACMG)于2015年发布的《序列变异解读标准和指南》。

3)检测结果

通过检索数据库以及文献结合IUIS颁布PID分类标准里的各致病基因表型和临床症状对比，发明人发现，与正常人相比，慢性肉芽肿患者CYBB基因的11号外显子疑似纯合缺失，结果如图2所示，该突变突变造成CYBB编码蛋白截短，而蛋白截短会影响细胞色素B功能，最终使巨噬细胞NADPH氧化酶不能正常工作，患者表现出反复性全身化脓性感染。这个基因都位于X染色体上，属于X连锁隐性遗传。

实施例2、CYBB基因11号外显子缺失的确定及其用于鉴定慢性肉芽肿中的应用

1、Q-PCR引物的设计

依据Human GRCh37/hg19人类基因组版本，CYBB基因对应NM_000397转录本序列(其核苷酸序列为序列1)，设计CSF2RA内参基因和CYBB基因10号外显子(chrX:37664259-37664421)、11号外显子(chrX:37665640-37665786，序列1第26310-26456位)、12号外显子(chrX:37668820-37668944)两端序列分别设计扩增引物，设计原则是位点数在5个以内、片段长度80-200bp、序列的GC含量应在35％-65％,结构预测无特别复杂结构；对应序列引物如下表1：

表1

2、Q-PCR扩增

Realtime PCR具体上机操作，参考Roche 480说明书，分别取实施例1中1的慢性肉芽肿患者及父母基因组DNA作为模板，用表1所示的引物分别进行Q-PCR扩增。实验重复3次，平行组的Cp结果取平均值Avergage Cp。然后用需要检测基因的减去内参基因的得到△Ct值，再用实验组的△Ct减去对照组的△Ct得到△△Ct，利用excel公式”＝POWER(2,-△△Ct)”得到最终结果(此处的△△Ct换为实际数值)。

利用对照人群的CYBB基因某个外显子表达量计算检测对象的CYBB该外显子的相对表达量。

α＝检测对象△△Ct÷对照样品△△Ct

上述Q-PCR扩增体系如下表2所示：

表2

上述Q-PCR扩增的程序如下表3：

表3

结果如图3所示，以正常对照(男性)中CYBB基因各个外显子的表达量为1，其他样本中CYBB基因各个外显子的相对表达量是相对于正常对照(男性)中CYBB基因各个外显子的表达量；横坐标从左到右分为3组，第1组为正常样本、患者10号外显子、患者11号外显子和患者12号外显子，第2组为正常样本、患者之父10号外显子、患者之父11号外显子和患者之父12号外显子，第3组为正常样本、患者之母10号外显子、患者之母11号外显子和患者之母12号外显子；可以看出，先证者(男性，即患者)CYBB基因第11号外显子相对表达量为0,10号外显子和12号外显子相对表达量为1；患者之父为CYBB基因第10号外显子、第11号外显子、第12号外显子的相对表达量均为1；患者之母为女性，含有2个x染色体，各个外显子相对表达量为父亲的2倍。

因此，可以通过检测待测人CYBB基因11号外显子是否缺失或表达水平，辅助判断该人是否患有慢性肉芽肿病，具体如下：

检测待测人基因组中CYBB基因第11号外显子是否缺失或突变或表达水平，若与不患有慢性肉芽肿病的人相比，待测人的CYBB基因第11号外显子缺失或突变或表达量降低，则待测人候选候选患有慢性肉芽肿病，若与不患有慢性肉芽肿病的人相比，待测人的CYBB基因第11号外显子不缺失或无突变或表达量不降低，则待测人候选不患有慢性肉芽肿病。

在本发明的实施例中，经过测序，待测人CYBB基因第11号外显子全部缺失。

上述检测待测人基因组中CYBB基因第11号外显子是否缺失或突变或表达水平是通过如下方法实现的：

方法A：直接对待测人基因组中的CYBB基因进行高通量二代测序；

方法B：以待测人的基因组为模板，用序列3所示的引物和序列序列4所示的引物组成的引物对进行Q-PCR扩增，以不患有慢性肉芽肿病的人为对照，若待测人的扩增产物表达量低于不患有慢性肉芽肿病的人，则待测人CYBB基因11号外显子有缺失或表达量低；若待测人的扩增产物表达量不低于不患有慢性肉芽肿病的人，则待测人CYBB基因11号外显子不缺失或表达量不低。

SEQUENCE LISTING

<110>深圳市儿童医院

<120> CYBB基因外显子表达变异在辅助鉴定慢性肉芽肿病中的应用

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 30840

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

atggggaact gggctgtgaa tgaggggctc tccatttttg tcattgtaag taccaacaag 60

agataagtta taaattctct gacttctcgg ggttatcttg gaactaaaat agaccaaagc 120

ttttttgttc atttgaggaa ttgtgttgaa actgatttac catgtgaacc tatatctatc 180

tgtaaacaga ctgagtccat tcttccaaat tccttaatgg aaagaacata tctgggggct 240

cacttctagc ttacttctga attcctagga ggaataaatt agccagcatt tcgcagaagg 300

agtagaaaat atttcatgct aatgatctct gattctgagt tgtttagtaa tgtttactca 360

gacgcacatg tctatgtgtt tatactactt taaaaatgac aaattgaaat tttataccat 420

tttctaaata aaaaatataa gattgactca tgtatgggaa gtaggccttt atttcagtaa 480

ttacactaaa tataataaaa cttctcaaat ttattttcaa aaacaagtac cttctttttt 540

cagagatcta aacttgagtt atttataaga tttataaaaa ttcaaaagaa cagaattgaa 600

ataagtcatc tagattcata aatatgtagt atgtatattt atatataatt gtatatatat 660

ataaatcaat atagtctgga gaaactatgt aagtaaagat atagctaatt tacaagtgga 720

cagaatgatt tctgtacttt ttaaaacaaa gaaaatcaac tgttctctta aaatggtgtt 780

atcagcaaag caataatgga caaattgggt agatagaaat acgattttta aatagccttt 840

ctaaataacc aatagaagca ttacacagat gttaaaaagt acaattatga atggaatatg 900

aatggagctt ttgtaaaaat ttatcatgaa aaataatgag tctttgagtt ttaaatatag 960

aaagcaatta gtggcacaaa taaaaacaac aaatattttg ttataaaaaa tgtttacgcc 1020

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tcttatcacc atttttaagg gcaaataatt tctatagaaa gtaagttcaa attaaacttt 1140

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ttgggaagtt gctttagcac ttttttcttt gtaaagagag aatattatca agtgtctaga 1320

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ctgggtagtg tgaccacttg atccagtcag tgcttaggat aaaatgaact gtcatgatct 1440

agaaagctgt ttttgttgta aatcccaagc ccctcactat gctcaatatt ctctccttga 1500

agcattaagt aaaactaatc aaggaaaatg gaaggcttgg cattttagct gatgagaatt 1560

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gtgtcatact ggtggaggga aagcaatagt aatatgttcc cttcctttct cattttaagt 1680

ggagtggcct gctatcagct acctatccaa ggttaagcaa aagagagggg aaaaaaaggg 1740

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gagctggctc taagctggtt atatccagct ttgtcactac ctttgtcaaa gttggacttg 1920

gggaagtcct gacccttatc tgactccagt cttgtgtgga atctactgtg gaaatgcgga 1980

aacttcatgc aattatttct gtttgtgcag ctggtttggc tggggttgaa cgtcttcctc 2040

tttgtctggt attaccgggt ttatgatatt ccacctaagt tcttttacac aagaaaactt 2100

cttggggtaa gtataaattc catcccatgc aatattggct ggttcacatt tctcatcaga 2160

cattcttgtt catcttcctg ttagcatttt aaatacatat tctgaccaac ccaaacagta 2220

ccattagcct cactccctcc attgcaactt cctgggcaac agtcacttaa agccttccag 2280

tctgggacca acaaaagtgg ggcagagggc cccagtggca tccttcccca accaagaacc 2340

atgtgccatt gtttagctta aaggagaaat ctaatactca ctctgaaatg gaagggcagg 2400

ttggagcaat ccatccagga gtgacacatg tgggacaagt gggactttcc atattttcta 2460

agtcacctaa ttcctagtac ttttttgcat gaagagctct gctcctaatc acatgttatg 2520

aaatgatctt cagaaaataa atctctctct acatataaag actcgaggaa cttgctcaag 2580

ggccacatct gttgactagg acagtagagt gaaggccctt cagtttcctt gggtccttta 2640

gtattctgag tttccttgaa ctgtcaggcc tcttgcctcc agaagacatc tgttacatca 2700

tgctgaaact atgaattaat tgcttaatat taattattat aagtattata aatcataaat 2760

aaataatttt agcatataat tatgctagat cattataatt gttgttagct tattcacatt 2820

gatgctttct cccgccaaaa tatgcaactt ctttagacat tacaaatata ataattataa 2880

tgccaaagca ttataccata ccaatttaag atactgttaa gatcaattta agtgctaaga 2940

aaatatttaa aatctttaaa agtcttgata cttaactcta gttaatgata tgcaccttaa 3000

gtgttaaaga gaaagtgaac tgttgtctgt aacttacttt gaaatgcatc aaaaattaga 3060

tgagttgatg gatggataca ggaatggata gatagaatgt gataaagcaa gcataaaagg 3120

tataatctgg gagatgaata aacaggtatt tattgtaaat ttccttcaac ttgtctttat 3180

gtttgaacat tttaataata aaatgttgaa ttagggcaaa aggtcaattt cagatgaaaa 3240

caaagggtcc tagctagccc taaaggaaaa ccgttggctc tgaaggacct tcctgtacag 3300

atcacttggt gtctctggtg tgtggcctca tgctaagaac cttggggaag tggggacagg 3360

gcatattctg tgctcaaaaa agtcactctg ctccctttcc cgcctcttct agtcagcact 3420

ggcactggcc agggcccctg cagcctgcct gaatttcaac tgcatgctga ttctcttgcc 3480

agtctgtcga aatctgctgt ccttcctcag gggttccagt gcggtaagag aaaatgtttt 3540

actaagttcc tctaattttc aaaggccatc aagcaaaatg ccctttttta ggtaaaaaca 3600

aatgaatgat ttgggaggat tccagcttct gtagaatact catgagccaa gccattatct 3660

agtatatttc tgtgctattt ggggatggag ctccctaaga caactatttg gaaaacaaat 3720

tttgaaaaaa cacacaaaac cacctatacc tcaacagtag caatgaagta gcacacacgt 3780

acacgtttac acacacacac atatatatat gatagatatg catatataca gagctttagg 3840

aagttgacat gtgatatctg ggagttaatc tttcagtgtc attcaaaaaa atttaagtca 3900

gaggaaatat cttctgtgga taatatctca aggagatgga gtcaatggac agagtcacac 3960

tataatgaat gtaaccaaga agtgttggct tcatggaact ggggagcata gagctttcta 4020

aatgtccaga attcctttga ctctcactcc aacaatttag taagccacta aatgtactgt 4080

gctagaaggg ggaaaaaata agtaggaaga atctctgtaa cccataaaat ggtatacaaa 4140

tttcttacta gtattattgt acaaagatga caaacaagga acttaaaatc tacaagtgta 4200

ctcaaataaa tattatacaa agcaaaatat gatgggttcc acaaagcttt acaaataaaa 4260

tactatgggg aagcaagaga gaagttgtgt caggtggggc agagaatgaa gaagggcatt 4320

ttagagaagg tgacattaga gatgagtata taaaaataag cttctaagag gtgtaaagga 4380

gagagaaagg cattctatgt ggagaagatg gcatggacag aagcacagga aatagtgagg 4440

aaatcgtatt cttgaaggcc aagaattggc atagccttgg cttctctttg tattattatt 4500

ataaatattt ttttgccacc tgtgaccaca ccaaagaggg tagctgggaa aaaagtaggg 4560

attggtgtcc tggtgggacc aattccgtgg ttcattaatg actagtagct tctaggtttt 4620

ttttaaaaaa taaaaggtat agtaagcttt ttgaaaaaaa tacttattaa gtagagatca 4680

cttatggagg acagcagaaa gcaaactact tttgtgggaa tgtagggatt gtacagggca 4740

gatgcctgac ataaggctgg agaaaagagg taggatttta ctggtaaact agaactgcat 4800

atgtatagtt gaggagttca tgcttaattt ggcaattaca gaatatttga aggaggcagt 4860

gaactaaact gtaataacaa gcataacttg ccttgaactc tgcctcattt ttcctagtta 4920

cactaaattc atgctgatcc agagaatttt tttctttaag aacatataac attcaattta 4980

ctaatatagg actagaggct ataatttagc ttttatttta tgacttaact atttacaaaa 5040

taccatttca tcttaaacca actgccaaaa ttgggctctc acaaatctaa agtacaagtt 5100

ggcagaaata actgttacac cttcgcttcc tcagaaaaag aagaatgttg ataaccaatt 5160

taagatgttc cagaaagagt cgtgatatct tcctctgaaa aattctgtga tgaggttcct 5220

ttccttaagc cataaattct atgctacgca atgttgtctt gcaaactgag agctaaccaa 5280

aaccaaaaac taacaacagt acttggtatt aaacattgat tacaaggatt tccaaaaaat 5340

cttccaaatt taagaaatca cagaggtaaa attacactca attgaaagtt ttattaatga 5400

gccacctatt gtaaagtata acgtttaata tatcgtaagt gcccagtgaa catttgctaa 5460

atgaagccca tgcactatag cttatttttg agttgggttc tctatcaccc aggctggagt 5520

gcagtggtac gatcatagct cactgcagcc tggaactcct gggctcaagt gatcatccct 5580

ccttgacttc catacatgtg gggattacag gcatgagtca cctgcctggc gagttccttg 5640

tttctaagga gacacaattc atttttattc tccctacccc cattagaata gtttctattt 5700

agaggaagta aagcctgaga aacaggcaat gttttcacca agatggcctg ttaagaaatc 5760

ttggttagtc tacaagtcca aatttcactg ccggtgagca ccatgtccca tgagcagcac 5820

atgttgtaat gccagctttt atgcctcctg tgacccagga gggaagatct gcatgagagt 5880

ctctaaagac agggatgaaa tgagactgcc cttcaaatcg cagagaagct tggctgtata 5940

actacataga tctttatata aaagaatatg ttttaaaact atcagcaagc aacattcttt 6000

tatagatcaa gcatgtactt tcttctggga ttcctaacct gaaatgtgaa cttttctaat 6060

aaaacttctt ctgtgattgt gattaaaatg agtgagtgtg ctgtaactaa tgttggaaat 6120

catatagctg ccactcattg aagcttaatg gaattcaccg catgaaatct gcacatcaaa 6180

ccagtaaagt gggaacaaaa ttaaatggaa gtgttggcat tcaaacccag gtcattgtgt 6240

ccccagagcc cattcacttt aaatcatgct gccaaaactt cttgaaattg tgctgttgca 6300

gtattatgat cctagaaagc cattatatat atgagtgttt gagcatgcca agtaacctag 6360

actagaaatg acaaggatgt tataaataca aggacttaat agtaggacac tatataagca 6420

aaataaccac gaacttgcat tcagtttcta gaggtctcaa tcattgaaac tttgctttgt 6480

aatccttctg gttacctaga gaaagaaagc cccagggttg cccaccccac cactccagga 6540

aaggtagggg taaaggctct cagactgctt tgttgagaaa aatggagaat gggtgaagct 6600

cagcacacaa aaatctctga ggaagcctta aaaaccccca acttgccatg cagaaactaa 6660

tttctgtctg gatggcagtc ctagtcttaa gatcagaaag aaacaggaag gtgagagggt 6720

gaggttttat ctgttacctt atatagtctg ggagtcagag gcactcagtg tgcctctatc 6780

tttaatcacg tggtctagca ctagtctctt gggctttctg tctcatagtt ttttttttta 6840

gttgaaaaac aggtcaacta acacaaatgt aagaaggcat atgttggtct aaaagtatat 6900

taattgttta agtctgtcaa ttagtgagtt gtcagtcaat aaatatttgt tgagtgccat 6960

ttatgtgcta agcactgggg acatgtggta agtaaagatt aagttataga taggccatga 7020

gcttaaggag cttagagtgt taacaggaga gacagagaat aaatatggaa cttccaaatt 7080

ataaacagtg ctatgcaaat aaggtagtgt tattcatatt tatcagatat tctactgcca 7140

gcaggtgtgg atattactgt caacttactt gcctgagttc tgtagattca aagttggatt 7200

ttgtaatttc tcccagttgc gtataaatat ctaaatcaga tacattgatg gtgcgtgtgg 7260

tgagatcaag tgtacaaaaa gtagagcttt tgagtttctg taaagtgtta caccccataa 7320

aatatgtact tctttttagt tccacttccc attttcttga aatatttttt tcttactcag 7380

tttcaataga gcatagaaat ctgctgaagt gactcaataa tctcccttgc attagaatgg 7440

tagtttattg aaatcgggca aggcttccgg tgacagtaac agagaaactt ccctttagaa 7500

gtcaatggca gaaagtaaag taagttagta aggaagctat ggggcatgat ggcaacgtgg 7560

ataattggga agtggctggc aataatttag aagtaactca aagcatataa atgcaatctg 7620

cctgatgatg gggaacaaaa aattatgggc agtcacagac agtaaagtcc ttccttccta 7680

tgccaccaac cggttgtctc gcctcctttt ttaaggaagt ggtgaggaga tggtattctt 7740

aaaagcccag tatcagcatg acttgtggct tctttttgga tttgtttgcc attcctgtcc 7800

acaccaaaga gggtaggtgg gaaaaattag ggatttgtgc cctgatggtt ggacccactc 7860

cactgatcca ttagttacta gtaatctcac tttttccttt caatataata tatgtgtttt 7920

acattaacta gctttttaaa aattacctat taagatgaaa cagagtatca ttgaatggac 7980

aatgtatttc ccaatcacat ctctccactg ttctggcttt cagttaattt ttctctaagg 8040

atctacagtt aaagctatca gggggcatca acatatatta ttttacattt tttatgatcc 8100

atggtgatta tgatgataag gataggacta tgaagacagt gtatgttcca caacaaaacc 8160

atattcgttt gctttaaatt cggcgtgcag gagccagtga attttcccca aaaaatttca 8220

aaaggatttg tcaacaaata gaaaagaaca gtgtgtggca agtatagaca tgggggtaaa 8280

ttcatctcta taggtttagt atgatcatct ccagttccag ggcatgaaaa tgtacttcat 8340

ttatgcagcc aaataatgat taaaagattt ttttaagtac atgacatact gtttttcaca 8400

caggaagctt acctgctagc tggggagtgc agccttacta actgaaaact taaataatga 8460

tactaaataa catcaaatat tgattaaata cctgtcaatg aatatatgca atagggattt 8520

gagggactaa ctatgataat tatacaggtg aggaaactgg agactgagta tgttgttcga 8580

tgtcacacgg ctaggtggga ggactgggac ccaacatagg tatatctgaa gacaaaactt 8640

gctctgaaat gtgtaattca gtactgcttt ccaaccctac taattctcat tctctgattc 8700

tttggactcc aacctagttt caccactcct gtaaggactg tatcaatcat ctatcgtgta 8760

acaaattacc acaataactt aaaacaaccc ctgtttatta gtttacagtt ctgtaggtca 8820

caagtccagc acccagttgc tgggttctct gctcagagta tcataagact gaaatcaagg 8880

tgttttctgg gctgaattcc cacctggaaa ctctaagtaa aaaccctctt ccaagctcat 8940

tcttgttggc agaattcagt tcattacaga tgtagcacta gaggtccctg tttccttgct 9000

ggtgatcatc tagggtccac tcaaatccta gatgttcctg cattccctgc cacatgccct 9060

cctccacctt ccaaccagca gcagtgcttc aaatctctga cttcctccat ctctgacttc 9120

taaacccaga tttaaagagt tcatgtgatt gggtttgttg gcccagataa tctccctatt 9180

aaagtcaact tgggacttta cctctgcaaa atcccttttg ccatataatg taacaaaatc 9240

acagagtgat gtctcatcat tttcacaggt ccaaactcaa ggggaggaga ttatataagt 9300

cattgggggt cattctagaa ttctgtctac cacaaggact ctcagaaact atagaggaaa 9360

ttaagttgaa atttaagaag ccaaagaaag aaagaaggaa agaaagaaag aaagaaagag 9420

aaagaaagaa aggaagaaag aaagaaagaa aataaataaa taaataaata aataaactat 9480

aaaggaacat ggcaattggg aaacaggaaa aagttatttc ctcaaaattt taaggaatac 9540

aaagtagaaa ataattttca gcacttgtaa tgaacacaaa agacaaggag gctatataag 9600

aaaacaaaga tggtcaactt ttcaacaaca gatcagtaaa atgtatttta caaataaatt 9660

tttatttcaa aaacattaag tttgaaaatt tgtattttac aagtttttat ttcaaatagg 9720

aaaccattgt tttgagagtc tgagtcattg ctcagctcca ctggtgaaca tttaattata 9780

accaatgcat tggtgctcca ccatattccc taagcactgg cacttccaat ccatgcgaca 9840

actgcccttt gcaagcatca ttcactctct gcctggggat tttctttcag ctttctcctg 9900

gggcaagcct gaaatcccag gggattgatg tcctgagagc atccctcaga gcagccctca 9960

gccaatcatg gatggcagtt ggtggttgaa cacccaagct tcttaacccg ttaggtaaaa 10020

accaaagaac gaaacaaaca aagtaaatga ataaaaaacc ctttgggata agttctacac 10080

agtctcccag agttccctgg tgtgatcgag cccaatgata tgatatgatc atggtagctg 10140

atataataat gcactcttca ttaatttcct tcccagtctc atttttaccc tcgttttcta 10200

tgaccacctt ccggatagaa tacttacact taaattcttg tcacaggttt ctaggcactt 10260

agaataatag tgactatatt cctgcatttg gtttggtaga aaagggcatt aaccttttat 10320

agacaaatag acttggatcc cagccaatgt gcaattttag ctttagtttt cttacctgta 10380

aaatgaggac attaagattt accttgttgc attaaatgag taatgattat gggtaaacta 10440

cctagttcac agaaggaatt caataaagca taattttttt atttttcctt tttctggaat 10500

cctcagtgtc ttccttgcta ctatttctgt aatttcaaga acctgacctc atggtttaaa 10560

cttcctgccc tccctagtta tggctaactg agagatagat ggtggagtaa gcacaatttt 10620

ctgtgcaatt atattttcta caaaatcaga gtattttatt aaaaataagt aagccaaata 10680

ttaaacaccc ctatatttaa attgaataaa acatttagaa ccaaatattt taagtacata 10740

aattttcttt ggtacttcac tctcttgttc ttaaagttcc ctgaatctct gtgacagtgc 10800

atttagacta tggaacaaag caaccagagc aagacattgg ccagttttca ggagagccaa 10860

gctctaattc aaccataaat cagtttaaat cagttttttt ctttctttga gcattggcac 10920

gaattgagat tcaaactcac attttctaac atatgtaggt tcgtcaaata cactaaaata 10980

ctgagtacaa tagtattttt aatgccaaag gaaatcatgt aaagtatgaa atatcagaat 11040

gtttatataa actctagtat cagatggcct gagtttaaat cccagctctg caacttatta 11100

gctgtgtgac ctaaggctag gtaaactctc tatccctttg ttttctcatc tgttatgtag 11160

taataataat ggtacctccc ttgtaccatt attgtaagaa ttaaagagtt aatttgatta 11220

ttacattaaa gattaaatta aattaaatat tacatcaatt acattaaaga ttaatgtaag 11280

aattaaatta gtcaatgcat gtaaaacagt tgcagaagct cttggtaaat gttagctatt 11340

gttattttgg ctattagcat ttggtcaatg atctcccctg tgatgttgtt cacctacatg 11400

ggcaggtgta cccttctttc tcctctcata gtgtgtatgt cctagaacag tgttgtttga 11460

aaactattca cttgttctag aactgttcac ttgtctgtgt ccccacttga ctatgaggta 11520

tgtgatgtta atttctacat cctttgttta atgagtaaat taatcagaac tagaaactat 11580

gtagctagat atgttttttg tacaagttta tatttttata cagttaagca atggattcca 11640

gaggagactt tatgtcacca gtatgagaac agaaaacata ccagttaagc cagccatgtc 11700

acttactggc tgtttgacct gaggaagatg actgcatctc tctgaacctc agtttcctca 11760

tttatcaaat agatataatg atacagtttg cagggtggtc atgaaaatta aatgagataa 11820

tatgtatcaa atgtttgaca catagcaagc tttcctgtta acaattacta ttccattctt 11880

tcccccttaa tccaaagtgc tgctcaacaa gagttcgaag acaactggac aggaatctca 11940

cctttcataa aatggtggca tggatgattg cacttcactc tggtaagttt attaaagaaa 12000

acttggaacc agggagttcc ctctattcat agataccttt ttatatagga gatcaaccag 12060

ttttatagtt agattaagtg gtggttggat atgttgtatt tttttaatga gttttgctca 12120

aaagtattta ccacactttc tgccacttca atattaggat ttattccttt aggttttaaa 12180

gcatttttat ttcaggattt tcctataaaa atgaaaatat gccatcagaa aagtcaatcc 12240

tagtgtcctc accctttgct attctttcta gtgtcaaaaa tgttaattca ctcatgaaaa 12300

cttatttatt ctaaaaaaag ttcttggttg catgtgtgaa tttgtggact ttttgcagca 12360

aacctacagg agccatagcc cataaattga gaatccctca agacggtcat tatcagctaa 12420

ataccttcat tattattatt actattgtta ttgttattgc atgtatccat acaatggata 12480

tatatgtgtg tatatagata ttatatgtta ttattaaaat tattagggtg gtagtgtcag 12540

tgcaagaagg gctgtatttg ggacccttat ctaattccac taattcactc aacaaatcat 12600

tcatgtgcca gagaatatat aagcacagtg ataaagcaga cttgtactct gcccttaaaa 12660

agtctgttcc tagcctgagt aaaataggct tagattacag gcatttaact gagtttctct 12720

tctactagta gatctggcag gcttttttag cagtggcaaa taaatagttc aaaagaaata 12780

tatgataaaa tcttgttaga aactggcata gtgtacggat taagagcaca tatttgcgtg 12840

ccagaggtac tggatttgat tcttaactct gctgcttcct agcttgatga ccttgaacaa 12900

ggttttaaag cagtctatgt cccagcttcc tcacctgtaa gatgagctga tattaatagt 12960

acctacatca ttgagtcaat gtaaggatta agtcattgtg aagtacttat aacagtactt 13020

ggcatctagt aagccctatg taagtgttta ttaataaaga atgcaatttt taagacagag 13080

agattcatac cttatggcca taggtttgta tcaattcaat caaatttgtc atctctctct 13140

ggaggtaatt tcagagtcag gttaatgggc cagcaattag gcattcacta catgagtgtt 13200

ttcttgtttg agcccaaata tattatggag agagataatg agagcatatc taaacacctt 13260

cagaaactaa ggctattgtg tagaatctta taacttgatt gagtctttag gagcatatag 13320

ctcaacatct tcatcttaca aattaggaaa ccaagaccag agagttaagt cattttccca 13380

caattacaca actagagagg atcttaccca ctagaattgc cttgtctcct tggttctgga 13440

gacccagttc ttgtctataa gtgtcctggg cctccctttg tctccctgtg gcttatcata 13500

gagtcagagg ctgtcccaga aacccagctt acaataaatt tgttcatacc cttcattctc 13560

tttgtttctc ttctctgccc ttttcagcga ttcacaccat tgcacatcta tttaatgtgg 13620

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ttggagacag gcaaaatgaa agttatctca attttgctcg aaagagaata aaggtaagcc 13740

tctcattatc tgacttagat attctctagg ccattacaat tgaggactag atttcagtga 13800

gtgaagacct ctcctttgcc aaaaaaaaaa aaagttggct aaccatcaga gggacaagtc 13860

tgtaggttac aataatggga gtatagaaaa aaatgtctcc cacactcctc acctcatgtg 13920

tggaggtctc tagatgtttt ccaggtcttt aagctcatcc atgagaatgt gtgcatgtga 13980

agcctggagt aactcaggct tacctgtgac tatgcccacc agtcaaagaa agctgggaac 14040

acatgtctag tcgaacaagg tttggtttat tacttgctac agcaaaagaa atctcacacc 14100

ttgaggaact ctgggcatct caaggggatg taaagtggat ttagaattta ggattctgtt 14160

agatggtttg ggggaggatt taagaatgca aggattttct ctggatcagt tatggtcagg 14220

aattgggggt agttctcaga taaggtatct taattatttt ttctaggagg cagagggaac 14280

agaataggac taagtctata ataggcaaag aagcagtagt cattgtctag gctcagacat 14340

gattttggag tggttttgct tttatctcac tccatcacag tcacagagtg acctcctcag 14400

aagctggtgt tttgtgaaat tatttatgtg aagtagggaa catcctggcc taagtattag 14460

tgtaaggcca gccaccagct gacagttgtg tgatgccttt ttcttttctt accaacaaca 14520

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tcccagcagt tgttgaagct tcctacactc aaagacagaa gctccaagtc ttcatgcacc 14700

caatgacttg ggaagatgac taaatcacat taatatgcac tgaattctaa aaatgttttc 14760

ttgtgtttag aaaacatcct tagttttgga aaaaataatt attattctca gacttacatg 14820

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tttctacaat atattgggta atttttcttt tacattattc attgtttgcc caatgatata 14940

tgagggtggc aacattaaca taactaggta aatctacact atcatgctct attcagttgt 15000

tcctggatca cttttactgt atctatgctc tcctactctt ctaaatgttt tcattttcaa 15060

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acaggataaa ctctaagttg taacttaccc tccagagttg ccttgcagga tcaggctgaa 15300

gctatcccct gtgagactgc ctgatttcac ccccttgctt gacttgtttg tcttttctat 15360

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cagacacttt taggacatcc tgtagttgat tgatttcctt tattttctac ccccttagaa 15600

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gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt ttatatttta cagaaccctg aaggaggcct gtacctggct 15900

gtgaccctgt tggcaggcat cactggagtt gtcatcacgc tgtgcctcat attaattatc 15960

acttcctcca ccaaaaccat ccggaggtct tactttgaag tcttttggta cacacatcat 16020

ctctttgtga tcttcttcat tggccttgcc atccatggag ctgagtgagt gtttaaattc 16080

tgaagtgaag gatttcatgt ccctcaattt ctaggcagga tgctccatta gaggcacagt 16140

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gtcagtttga tagaaaccag tcaacattgg catttttgtt tcatgcaccc atgtaattgc 16260

tattcatggt gaagttatat atagcaagct tgaaaaatac accaaagtct gagtatcttt 16320

gcaaatgtat aaaacatatt gagagcactg gtaggatctg gaacatctgc aatgatatcc 16380

tctatggttt aatcactagt aaattaaaca aacctccaga ctagaagagt taatgattaa 16440

tcagttgaag aggtttgtta tagttcaata agttttgatt taagcccaca gtcatttatt 16500

tgttgtctac catgtatgag gacctatctc aggcactgca ggaaatacaa gcaggaaaaa 16560

tatgtggttg ttgccttcaa acattctaat ataatgaaag tagcagctaa cttctattaa 16620

gggtctgtgc taagggtttg acatgatata tttcttttaa cccccaaaat gtatagattt 16680

ctcactatca ccatttcttg gggatagtaa ttgcagacaa gaaacctgga gctaaaatgt 16740

taaaatatgc agcctaagcc acctctctgg taagtggccc agctgagatt ggagccaggc 16800

agtctaaagc aggctgtgat aaatgttctc ttagagacac acagttcctg gctatgtggt 16860

taggagagtt tgcctgattg gagatcctct ttcataccaa gtttcctttt ttgtgcagtt 16920

tcataccacc tgcacacaaa ggcaggcctg gggaagttcc ctggtgggta tagggctcca 16980

ggaaattagg gttggaggaa gtagaagctc aagactcact ctgcccagag cccagttggt 17040

ggccaagaca tgactgtgaa aaaggggaag ggtggggaaa gctgcattgg gcactgcatt 17100

cttaaactac ttgctgactg tgacccctga taaactcttt gtaagcatgg agaaatcaat 17160

ggagaccaag aatctgatga ctctcttaaa gcactcaaat atctttaaat gggacttagt 17220

cataatcccg tgtttcaggt aatcctagag aagagaaata atttcttccc ctctccaatt 17280

tagtaattcc accactttct gtttgtatgg tttcgcagat actcatcttc ctttgaagca 17340

gacagaggag atatgtttat ctccttctcc acttgaagag aatctgctct ttacactggt 17400

taggtgattt ctcacagtct catggctccg tagcagctga attgggttta aaatgcaggt 17460

ttctggactc ctggtcctgg cattgagaag agaaggagaa aatcagatta ttttcctatc 17520

atttacttac catgggaact taggcatttt gaactttaat agttattttt tggactctta 17580

ctttgtgtct ggcatttttt atacatcatg caaattgctt attataatga acctttaatg 17640

aggtactatt acatctgttt tacagctgaa ggaactgagg ctcagaagaa gttaaataat 17700

ttgcctgagt ccaccaaact agtaaggggt agaaatgaga tttgaaccca agtctgtctg 17760

acacaaaaca caattgtttt caccaaaaca ttctgctttg agttactaaa tcattctgat 17820

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aactgagata atttgtgtaa aatgactttc cccaagcctg gcacatgata agtgctcaat 17940

acatgataat tctcttcccc aagacctaag gatagaaagg agtggttaat gaacttgaat 18000

taaaacattc tcagaataca ccaaatgaca caataaattt taggtctcca aaacaaacct 18060

ttacaatggg ttttctgtgt cttttcttct tatatattct gaagatgctg tcatttatgt 18120

tccttgaagt ctactcaacg ttgggccttc ctctctctat caccaataat tgtcttatga 18180

tttggtagtt gctcaactag catttattga attgaaatga atgggctctg agcaattcaa 18240

ggtacacact attagtgttg atgtctgtga gaatgttata atccctatat agttaagtat 18300

ctcaaactgg tttcaaaatt tggtttgatt tagataattt ccaaacccac aaataaggca 18360

cttcttgtaa gcttcagggc tactgtatat gactgtctca gttgtctact atagtgggtg 18420

cctggccaag gacaataaag ttagcccaca ctttgatgat tgagcccttt gcttatatct 18480

tcataggaag ggtaccattt tctaatttgc acaaaggcac tgtaggggcc agcagtcact 18540

ctgttagatt tgcaattttt ctgcttttgt ttgtttgtaa atgaaaatga tacttgagac 18600

agaagtagaa attctccctt aagagaattt gatccaacac ttaccctcta taatgttaca 18660

tgtaaatatc cctttggtaa ttgcacatat attttttctg ttgctgagtg ttatgcattt 18720

tctttccttt catctattca gagggagcaa taagctatcg cttttaagtg aaaagtacag 18780

ggcctacatc agagcactta aaatatatgc agaatctttt aataaaacaa tttaatttcc 18840

tattactaaa tgatctggac ttacattttt cacccagacg aattgtacgt gggcagaccg 18900

cagagagttt ggctgtgcat aatataacag tttgtgaaca aaaaatctca gaatggggaa 18960

aaataaagga atgcccaatc cctcagtttg ctggaaaccc tcctatggta tgtacaattc 19020

attgttgtta ttacagtttc attactgaca atctttaacc tgtgtctaag aaacatgtac 19080

agatgttata catctatata gatgtccatt acaaatgtca tggaacagct aaaacatgtg 19140

tctacttttc tctgctatac ttattggata gaattgtttc ttgaaaacta agctttgcat 19200

tgttctgtta ttaacatcct gatataaaac ttgggaaaat agtgttttta gaagtgctgt 19260

tttggttcaa gaagttccat ctcttttctt catgacgacg ccagctaatg atttttaggg 19320

ggacacttgg gattccatct tgagctgagt tggatagctc aaataaatca cttataagga 19380

gcaaagggcc tcttcagata ccagcacata atactttcta tacagctttc caatttgaaa 19440

aggaaattga tgaggtggta cataaggcta cctttaggca ttaggagttt tctgtttatg 19500

aggcataaag gaggctggac ggcgaggttc ataccaacat cccaatggca tcatgtggtg 19560

ggcagaagtg tggcaagggt gaccaaggaa atacatggtg aaatactttc ttccttctat 19620

tgggagctct gaagggttcc attttgtgta ttctcataac actgctccat agagtaagat 19680

gtgggccttg taatcttcat atcattttcc ccattggcag atggtatact ttgttggtta 19740

ttgtgctagc cattggtata aaactaggca aaaatcaaca tttgtgcagg gcttctgaag 19800

aggattattt ttttttcctt aggcacagta taacataaag gcaaattttc cattccattt 19860

tctcctttct tttttcctac tctcttagca taggagcact cttactctag acacagcata 19920

ctatatgaag acgtaggatc tttaagcatc ttttcccatt aatggaagca accagacata 19980

tcagtgaatt ggctccacta catgcagaca tcaatagaaa ggataaaaag ggaactgtat 20040

tgccaatcct cttgtgggca ggggaaggca catttcctcg atgacagctg gagtcagagt 20100

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