一种鉴定Junior血型基因分型的试剂盒和方法

摘要

本发明公开了一种鉴定Junior血型基因分型的试剂盒和方法，属于血型基因分型技术领域。其中，所述试剂盒包括分别具有SEQ ID No.1~SEQ ID No.30所示核苷酸序列的引物，进一步还可包括分别具有SEQ ID No.31~SEQ ID No.34所示核苷酸序列的引物。利用本发明，不仅可以鉴定Junior血型的基因分型，还能鉴定Jr(a‑)稀有血型，方便、快速、准确，为临床Junior血型鉴定、Jr(a‑)稀有血型筛查等应用提供技术支持。

说明书

技术领域

本发明属于血型基因分型领域，具体地，涉及一种鉴定Junior血型基因分型的试剂盒和方法。

背景技术

Junior血型系统，发现于1970年，被国际输血协会(International Society ofBlood Transfusion，ISBT)编号为ISBT 032。该血型系统目前仅发现唯一一个血型抗原，即Jra抗原，由ABCG2基因(GeneBank Accession Number:NG_032067.2)编码，该基因位于4号染色体，有16个外显子，转录起始位点位于2号外显子。据ISBT统计，Jra抗原为红细胞高频抗原，在超过99.9％的人类红细胞上均有表达，尤其是在欧洲与北美人群中该抗原阴性的Jr(a-)血型极为罕见；但是，在日本等亚洲人群中Jr(a-)血型的出现频率约为0.05％-1.7％，该血型为稀有血型，具有明显的地域性分布特征。

根据2020年4月瑞金医院领衔的ChinaMAP(中国代谢解析计划)联盟在《CellResearch》杂志报道的迄今为止最大规模的中国人基因库研究结果表明，中国人的遗传特征与欧洲、非洲、南亚和拉丁美洲人群之间存在着巨大差异，与非洲人群差距最大，而与东亚尤其是日本人群非常相似，其中中国汉族人群与日本人群聚类极为接近，甚至中国北方汉族人群与日本人群的聚类完全重叠。虽无相关研究报道，但是据此可推测，中国汉族人群中Jr(a-)稀有血型的出现频率也应接近0.05％-1.7％，这一频率接近目前临床输血中除ABO之外最为关注的RhD-(俗称“熊猫血”，出现频率0.3％)血型。其中，亚洲人群中最为常见的Jr(a-)等位基因型为ABCG2*01N.01:c.376C>T(p.Gln126X)。

作为极具免疫原性的血型抗原，Junior血型不合会引发溶血性输血反应和新生儿溶血病，严重时会危及患者生命。因此，日本红十字血液中心在对献血者血型鉴定时，常规检测Junior血型。但是，在我国，由于Jra抗原血清学检测与基因分型均无商品化试剂，也无相关技术方法建立，临床输血中无法对供血者与患者进行Junior血型检测，具有极大的安全隐患。因此，建立Junior血型的鉴定技术，对于保证临床输血安全至关重要。

发明内容

为了解决上述技术问题中的至少一个，本发明旨在基于Junior血型抗原编码基因ABCG2的序列特征，创建一种ABCG2基因编码区测序的方法；同时，基于Jr(a-)血型在亚洲人群中最常见的等位基因型ABCG2*01N.01(c.376C>T(p.Gln126X))，创建一种PCR-SSP快速鉴定Jr(a-)稀有血型的方法，以应用于临床Junior血型鉴定、Jr(a-)稀有血型筛查等应用研究领域。

为实现上述目的，

本发明第一方面提供一种鉴定Junior血型基因分型的试剂盒，包括分别具有SEQID No.1～SEQ ID No.30所示核苷酸序列的引物。其中SEQ ID No.为奇数表示正向引物，SEQ ID No.为偶数表示反向引物。

在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒还包括用于鉴定Jr血型的引物对。在本发明的一些具体实施方案中，所述用于鉴定Jr血型的引物对分别具有SEQ ID No.31和SEQID No.32所示核苷酸序列的引物。进一步地，所述试剂盒还包括用于扩增内参基因的引物对。更进一步地，所述内参基因为ABCG2基因(NG_032067.2)。在本发明的一些具体实施方案中，所述用于扩增内参基因的引物对分别具有SEQ ID No.33和SEQ ID No.34所示核苷酸序列。

本发明的第二方面提供一种鉴定Junior血型基因分型的方法，包括以下步骤：

S1，获得待鉴定样本的核酸样本；

S2，以步骤S1获得的核酸样本为模板，利用分别具有SEQ ID No.1～SEQ ID No.30所示核苷酸序列的引物进行PCR扩增；

S3，对步骤S2获得的PCR扩增产物进行测序，根据测序结果判断Junior血型基因分型。

在本发明的一些实施方案中，所述待鉴定样本为血液样本，包括但不限于血浆、全血。

在本发明的一些具体实施方案中，分别具有SEQ ID No.1～SEQ ID No.30所示核苷酸序列的引物中，SEQ ID No.为奇数表示正向引物，SEQ ID No.为偶数表示反向引物。利用具有SEQ ID No.(2n-1)所示核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID No.2n所示核苷酸序列的反向引物分别进行扩增，其中n＝1～15。

在本发明的一些优选实施方案中，进行PCR扩增的体系为：2×Taq PCR Mastermix(天根生化科技有限公司，KT201)10μL，10μM上下游引物各1μL，50-100ng/μL的基因组DNA 2μL，加ddH

在本发明的一些优选实施方案中，进行PCR扩增条件为：

在本发明的一些实施方案中，所述方法进一步包括：S4，基于PCR-SSP鉴定Jr血型。

在本发明的一些具体实施方案中，利用分别具有SEQ ID No.31和SEQ ID No.32所示核苷酸序列的引物对步骤S1获得的核酸样本进行扩增，若出现阳性条带则为Jr(a+)血型，出现阴性条带则为Jr(a-)血型。进一步地，还利用分别具有SEQ ID No.33和SEQ IDNo.34所示核苷酸序列的引物对步骤S1获得的核酸样本进行扩增，以作为对照。

在本发明的一些优选实施方案中，PCR-SSP方法的PCR扩增体系为：2×Taq PCRMastermix(天根生化科技有限公司，KT201)10μL，10μM Jr376-SSP-F/R各1μL，10μMControl-F/R各1μL，50-100ng/μL的基因组DNA 2μL，加ddH

在本发明的一些优选实施方案中，PCR-SSP方法的PCR扩增条件仍为：

本发明的有益效果

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明首先利用测序技术鉴定Junior血型基因分型，测序技术可以精确获取目的基因核苷酸序列，结合本发明的引物组合，可以用来对某些变异型进行序列测定并/或发现未知突变。

本发明利用PCR-SSP技术鉴定Jr血型，以用于筛查Jr(a-)稀有血型。结合本发明的引物对，利用PCR-SSP技术进行Jr血型鉴定具有很高的灵敏度和特异性，操作简便，适用于在大量人群如献血者人群中进行已知基因型的Jr(a-)稀有血型的筛查。

本发明将测序技术和PCR-SSP技术结合起来，克服了两种技术固有的缺陷，实现了Junior血型基因分型与Jr(a-)稀有血型筛查，填补了Junior血型鉴定的空白。

附图说明

图1示出了本发明实施例1中一个样本的PCR扩增产物的凝胶电泳图。其中，E2～E16分别代表利用引物对Jr-CDS-1F/R、Jr-CDS-2F/R、Jr-CDS-3F/R、Jr-CDS-4F/R、Jr-CDS-5F/R、Jr-CDS-6F/R、Jr-CDS-7F/R、Jr-CDS-8F/R、Jr-CDS-9F/R、Jr-CDS-10F/R、Jr-CDS-11F/R、Jr-CDS-12F/R、Jr-CDS-13F/R、Jr-CDS-14F/R和Jr-CDS-15F/R进行扩增的产物。

图2示出了Jra-血型与Jra+血型(纯合子与杂合子)抗原编码基因ABCG2编码区测序结果。A.Jra-血型ABCG2基因c.376TT位点测序图；B.Jra+血型ABCG2基因c.376CC位点测序图；C.Jra+血型ABCG2基因c.376CT位点测序图。

图3示出了本发明实施例3中一部分深圳地区汉族健康无关个体ABCG2基因PCR-SSP法扩增产物的电泳图。Marker.2000bp DNA Ladder；1.样本1(c.376TT Jra-血型样本)；2&3&52.样本2、3、52均为c.376CT Jra+血型样本；4&5.样本4、5为c.376CC Jra+血型样本。

具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

下述实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均按照《分子克隆实验指南》(第四版)(J.萨姆布鲁克、M.R.格林，2017)一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。其他实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1基于一代测序检测Junior血型编码基因ABCG2的试剂盒和方法

本实施例基于Junior血型抗原编码基因ABCG2的序列特征，建立一种ABCG2基因编码区测序的试剂盒和方法，以应用于临床Junior血型鉴定等应用研究领域。

本实施例采用一套15对ABCG2基因编码区扩增/测序引物，在同一PCR扩增条件下分别特异性扩增ABCG2基因编码区片段，引物序列如表1所示：

表1 Junior血型抗原编码基因ABCG2编码区测序引物

将上述引物制备成试剂盒，可用于鉴定样本Junior血型。

PCR扩增反应体系：

2×Taq PCR Mastermix(天根生化科技有限公司，KT201)10μL，10μM上下游引物各1μL，50-100ng/μL的基因组DNA 2μL，加ddH

PCR扩增条件均为(以利于同步扩增)：

利用各引物对分别进行PCR扩增，扩增产物利用凝胶电泳进行检测，结果如图1所示。由图1可知，每对引物均可得到目的大小的片段，且条带单一、明亮，表明引物具有非常好的特异性。

随后，用exonucleaseⅠ和alkaline phosphatase 2种酶纯化扩增产物。纯化体系：10ul扩增产物，exonucleaseⅠ0.25ul，alkaline phosphatase 1ul，Fast AP Buffer 3ul。纯化程序：37℃45min，85℃15min，4℃保存。纯化完成后的产物用于测序。扩增产物经酶纯化后，按照基因测序试剂盒(BigDye Terminator V3.1 kit)说明书的要求进行二次扩增，扩增产物经PrismTM ABI 3730XL测序仪测定碱基序列。将测序结果进行分析，使用Chromas软件读取测序图谱，并与GeneBank中ABCG2基因参比序列NG_032067.2进行比对分析。

实施例2基于PCR-SSP鉴定Jr(a-)稀有血型的试剂盒和方法

本实施例基于Jr(a-)血型在亚洲人群中最常见的等位基因型ABCG2*01N.01(c.376C>T(p.Gln126X))(如图2所示)，建立一种PCR-SSP快速鉴定Jr(a-)稀有血型的试剂盒和方法，以应用于临床Jr(a-)稀有血型筛查等应用研究领域。

本实施例采用一对ABCG2基因c.376C特异性PCR扩增引物，扩增ABCG2基因；该扩增引物与业已公布的Jr(a+)等位基因ABCG2*01的序列相匹配，可以特异性地扩增Jr(a+)等位基因ABCG2*01的目的序列，而无法扩增等位基因型ABCG2*01N.01的Jr(a-)血型相关的目的序列。因此，利用这对引物进行PCR-SSP检测；引物control作为内参质控，扩增出现该阳性条带说明PCR反应顺利进行。

表2 Junior血型抗原编码基因ABCG2 c.376位PCR-SSP引物

PCR扩增反应体系：

2×Taq PCR Mastermix(天根生化科技有限公司，KT201)10μL，10μM Jr376-SSP-F/R各1μL，10μM Control-F/R各1μL，50-100ng/μL的基因组DNA 2μL，加ddH

PCR扩增条件仍为：

扩增结束后，取10μL PCR扩增产物，经核酸染料染色，于2％琼脂糖凝胶中电泳；对照DNA分子标记，在凝胶成像系统中观察特异性PCR产物条带。根据ABCG2基因特异性扩增条带的有无，直观地判定ABCG2基因型，进而预测Jra血型。若出现阳性条带，则为Jr(a+)，阴性条带则为Jr(a-)。

实施例3

本实施例给出了100例业已经ABCG2基因测序分型判定Jra血型的非相关汉族人群血液样本，包括等位基因型为ABCG2*01N.01/ABCG2*01N.01的Jr(a-)血型样本1例，等位基因型为ABCG2*01N.01/ABCG2*01的Jr(a+)血型样本3例，与等位基因型为ABCG2*01/ABCG2*01的Jr(a+)血型样本96例，采用本发明中PCR-SSP法对这100例样本进行鉴定，以验证本发明的实施效果。

本实施例中，采用实施例2的方法对100例样本进行PCR-SSP法鉴定ABCG2基因型，结果与测序分型判定的结果完全一致，见表3。

表3 100例样本采用本发明的测序分型与PCR-SSP法鉴定ABCG2基因型判定的结果对比

样本1：经ABCG2测序分型的结果为ABCG2*01N.01/ABCG2*01N.01；在NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/search/all/？term＝NG_032067.2)中查找检出的ABCG2*01N.01等位基因第376位密码子序列及所编码的氨基酸残基，判定为ABCG2*01N.01/ABCG2*01N.01基因型；采用实施例2的PCR-SSP方法，PCR产物电泳仅见清晰的内参扩增产物条带，无ABCG2特异性扩增产物条带，判定结果为Jr(a-)血型，如图3所示。

样本2、3、52：经ABCG2测序分型的结果为ABCG2*01/ABCG2*01N.01；在NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/search/all/？term＝NG_032067.2)中查找检出的ABCG2*01N.01等位基因第376位密码子序列及所编码的氨基酸残基，判定为ABCG2*01/ABCG2*01N.01基因型；采用实施例2的PCR-SSP方法，PCR扩增产物电泳均见清晰的内参及ABCG2特异性扩增产物条带，判定结果为Jr(a+)血型，如图3所示。

样本4-51、53-100：经ABCG2测序分型的结果为ABCG2*01/ABCG2*01；在NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/search/all/？term＝NG_032067.2)中查找检出的ABCG2*01N.01等位基因第376位密码子序列及所编码的氨基酸残基，判定为ABCG2*01/ABCG2*01基因型；采用实施例2的PCR-SSP方法，PCR扩增产物电泳均见清晰的内参及ABCG2特异性扩增产物条带，判定结果为Jr(a+)血型，图3中选取样本4、5做琼脂糖凝胶电泳，如图3所示。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 深圳市血液中心（深圳市输血医学研究所）

<120> 一种鉴定Junior血型基因分型的试剂盒和方法

<130> KH21-1-111

<141> 2021-03-05

<160> 34

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtcacctagt gtttgcaatc tca 23

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gccagtttct tggaaatagc ca 22

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gagccaccat gcatgacct 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gacctgacat gcgttgcaaa 20

<210> 5

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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agcatgtgtt ggagggaaaa 20

<210> 6

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tcagccaaag cacttaccca 20

<210> 7

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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aggctttgca gacatctatg ga 22

<210> 8

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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atccacacag ggaaagtcct 20

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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acaggactgg cacacgttag 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tcatttctga accccctgcc 20

<210> 11

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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agtcaggctg aactagagca 20

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cccctttgct ctccttcagg 20

<210> 13

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

acctccctca ccctctgaaa 20

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<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gccaccacat tgctaaactt ca 22

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

agcatccaag aaagggttca ca 22

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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agcatccaag aaagggttca ca 22

<210> 17

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<212> DNA

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ttttctccca gggacgttgg 20

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<211> 21

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actgactcat cctaccctca a 21

<210> 19

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gcttccctgt tccaaccaga 20

<210> 20

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<212> DNA

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<400> 20

agtctaacca atagcccctg c 21

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ggtgcaactg acttcaccca 20

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

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<212> DNA

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<400> 24

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<210> 25

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

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<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

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<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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atgttcacat gcattcgcgc 20

<210> 29

<211> 22

<212> DNA

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<400> 29

ggctccttta aggaacagtg ga 22

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

gcaacagtgt gatggcaagg 20

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

cgtggtacaa gtaagtatta gtggg 25

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<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

gggccatatt ccagattctc cc 22

<210> 33

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

tgccttccca accattccct ta 22

<210> 34

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

ccactcacgg atttctgttg tgtttc 26