检测NG淋病奈瑟菌的引物和试剂盒

摘要

本发明公开了检测NG淋病奈瑟菌的引物，其特征在于，所述引物包括：扩增NG淋病奈瑟菌的扩增引物和测序引物，测序引物与扩增引物相同；其碱基序列为：NG F1：GATGACTTACCTGCCGCTGTT；NG R1：TTGCCTTACTTACTCCGCCATT。本发明具有高敏感，高特异和短检测窗口期等优点，同时相比较荧光定量PCR法，可以鉴定细菌变异情况，同时避免因细菌变异导致的漏检发生。

说明书

技术领域

本发明属于生命科学和生物技术领域，特别涉及检测NG淋病奈瑟菌的引物和试剂盒。

背景技术

淋病奈瑟菌(Niesseria gonorrhoese，NG)1879年由Neisser发现，简称为淋球菌，是引起淋病的病原体，属奈瑟菌属。淋病奈瑟菌为革兰阴性双球菌，无鞭毛或芽孢，有菌毛和荚膜，需氧，具有氧化酶和触酶。致病因素有菌毛、荚膜、外膜蛋白、IgA蛋白酶和脂多糖等。传统的病原体检测方法包括涂片法、细菌培养、免疫学技术等普遍存在检出率低、周期长、特异性差等缺点，给临床诊断带来困难。NG主要通过直接涂片镜检和培养的方法进行鉴定。但目前一些患者存在着不规则用药等现象，而且临床还出现少量对于培养基中万古霉素敏感的菌株，因此作为“金标准”的培养方法也可能出现假阴性。

淋病奈瑟菌基因组长2.154Mb，一般基因检测的靶基因可为其隐蔽性质粒，染色体基因，抗淋球菌胞嘧啶DNA甲基转移酶基因，透明蛋白基因，菌毛DNA，rRNA和porA假基因。

通过一代测序法检测，可以对奈瑟菌高度保守区域进行特异性片段扩增，对扩增产物进行测序，测序数据与标准序列比对，以鉴定是否为淋病奈瑟菌，以及其变型情况进行鉴定。

发明内容

鉴于核酸检测是直接检测病原体核酸，具有高敏感，高特异和短检测窗口期等优点，同时一代测序相对荧光定量PCR法，可以鉴定细菌变异情况，同时避免因细菌变异导致的漏检发生。本发明提供了一种一代测序检测NG淋病奈瑟菌的引物和试剂盒，用于检测淋病奈瑟菌核酸。

一种检测NG淋病奈瑟菌的引物，其特征在于所述引物包括：扩增NG淋病奈瑟菌的扩增引物和测序引物，测序引物与扩增引物相同；其碱基序列为：

NG F1：GATGACTTACCTGCCGCTGTT

NG R1：TTGCCTTACTTACTCCGCCATT。

供检测NG淋病奈瑟菌的方法，包括以下步骤：

(1)用PCR扩增已提取的DNA；

(2)对步骤1中的扩增产物进行测序；

(3)对测序结果进行判断，鉴定NG淋病奈瑟菌；

本发明的第二个目的是提供一种检测NG淋病奈瑟菌的试剂盒，所述试剂盒包括检测体系PCR扩增反应液、测序体系反应液，其特征在于，所述检测体系PCR扩增反应液包括一对扩增引物NG F1、NG R1，所述测序体系反应液包括一对测序引物NG F1、NG R1，其序列均为：

NG F1：GATGACTTACCTGCCGCTGTT

NG R1：TTGCCTTACTTACTCCGCCATT。。

进一步地，所述检测体系PCR扩增反应液还包括10×PCR Buffer；2mM dNTPs；KODFX DNA Polymerase(1U/μl)。

进一步地，所述测序体系反应液还包括测序纯化液、EDTA、无水乙醇、75％乙醇、HIDI(高度去离子甲酰胺)。

进一步地，所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品；阳性对照品含NG阳性质粒，序列如下：

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阴性对照品为去离子水。

有益效果：本发明设计了NG淋病奈瑟菌的引物，采用PCR技术，构建了稳定的扩增体系。通过调整引物浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳。

附图说明

图1是已知阴性样本N1S1、N1S2、N1S4、N1S5、N1S7，已知阳性样本N1S3、N1S8、N1S9电泳图。Mark从下往上依次为100、250、500、750、1000、2000、3000、5000bp、其中最亮的为750bp

图2是样本N1S3、N1S8、N1S9一代测序检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。

实施例1

检测NG淋病奈瑟菌的试剂盒，包括

(1)检测体系PCR扩增反应液。包括：10×PCR Buffer；2mM dNTPs；KOD FX DNAPolymerase(1U/μl)；检测NG上、下游引物NG F1/R1(10μm)。

(2)测序体系反应液，包括测序纯化液(ExoI:0.6U，CIP:1.2U)、EDTA(125mmol)、无水乙醇、75％乙醇、HIDI(高度去离子甲酰胺)、测序引物：检测NG的上、下游引物分别为NGF1/R1(3.2μm)。

(3)阳性对照品和阴性对照品。

NG上、下游引物序列为：

NG F1：GATGACTTACCTGCCGCTGTT

NG R1：TTGCCTTACTTACTCCGCCATT。

阳性对照品含NG阳性质粒，序列如下：

aacattatggatgacggccgccgcaagatgacttacctgccgctgttcgatgcgtccgaactgaaggcgggggacgaaacgggcggcacggtgcggatacttttgggttcgcccgacaaagagatgaaggaaatttcggaaaaggcggcaaaaaatttcaacatacaatatgtcgcgccgcatccccgccagacctacgggctttccggcgtaaccgcgttaaattcgccctatgtcatcgaagactatattttgcgcgaaattaagaaaaacccgcatacgaggtatgaaatttatacctttttcagcggtgcggcgttgacgatgaaggattttcccaatgtgcacgtttacgcattgaaaccggcttcccttccggaagattattggctcaagcccgtttatgcgctgttccgtcaggccgacattccgattttggcatttgacgataaaaatcaatcgcatggtaaatcaaaatagaaaatggcggagtaagtaaggcaaaaatcaggatatggcgtattttttgaattgaagataatttccgatt；

阴性对照品为去离子水。

实施例2

试剂配置：配制10个配检测体系PCR反应液，每份16μl分装。

加样：加入检测体系PCR反应液中4μl DNA；阳性对照和阴性对照直接加4μl阳性对照品和阴性对照品；空白对照加4μl生理盐水或不加任何物质。

1、PCR体系如下所示：体系20ul

2、PCR扩增程序

其中，引物序列为：

NG F1 GATGACTTACCTGCCGCTGTT

NG R1 TTGCCTTACTTACTCCGCCATT

Sanger测序：

取9μl PCR产物与2μl纯化体系。按照以下程序进行纯化：

将1μl纯化产物分别与上、下测序引物按照如下体系进行混合：

测序反应程序：

沉淀环节：

向完成测序反应的产物中加入2μl 125mmol的EDTA，静置5min；加入15ml无水乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心30min；倒置离心15sec，加入50ml70％乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心15min；倒置离心15sec，置于95℃金属浴上；加入10μl HIDI后进行变性试验。变性程序：

变性程序结束后，上测序仪(ABI3730)测序。

结果判断：分别将测序结果与NG参考序列(GenBank:AY953447.1)进行比对，根据实际对结果进行报告。

图1是已知阴性样本N1S1、N1S2、N1S4、N1S5、N1S7，已知阳性样本N1S3、N1S8、N1S9电泳图。Mark从下往上依次为100、250、500、750、1000、2000、3000、5000bp、其中最亮的为750bp

图2是样本N1S3、N1S8、N1S9一代测序检测结果。

序列表

<110> 武汉艾迪康医学检验所有限公司

<120> 检测NG淋病奈瑟菌的引物和试剂盒

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

gatgacttac ctgccgctgt t 21

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

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<210> 3

<211> 550

<212> DNA

<213> Niesseria gonorrhoese

<400> 3

aacattatgg atgacggccg ccgcaagatg acttacctgc cgctgttcga tgcgtccgaa 60

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