公开/公告号CN112730707A
专利类型发明专利
公开/公告日2021-04-30
原文格式PDF
申请/专利权人 云南自由贸易试验区睿之成医药科技有限公司;
申请/专利号CN202110224497.5
申请日2021-03-01
分类号G01N30/06(20060101);G01N30/74(20060101);
代理机构53114 昆明祥和知识产权代理有限公司;
代理人董昆生
地址 650000 云南省昆明市自由贸易试验区昆明片区经开区浦发路16号云南创新生物产业孵化器10楼E区
入库时间 2023-06-19 10:48:02
技术领域
本发明涉及分析化学技术领域,具体涉及一种采用高效液相色谱法测定神经酸含量的方法。
背景技术
神经酸化学名为顺-15-二十四碳单烯酸,分子式为C
目前多采用衍生化气相色谱法来测定神经酸的含量。采用衍生化气相色谱法,首先需要将神经酸进行酯化后测定酯化物的含量,该方法前处理过程繁琐,且难以判断酯化终点,检测结果的可信度不高。也有使用高效液相色谱法测定神经酸含量的现有技术,但依旧存在检测时间长,效率不高等问题,因此,亟需开发一种样品前处理简单,测定结果准确度高的神经酸含量测定方法。
发明内容
为了解决背景技术中描述的技术问题,本发明提供了一种采用高效液相色谱法测定神经酸含量的方法,选择甲醇为溶解和提取溶剂,采用C
本发明解决背景技术中的技术问题,通过以下具体技术方案来实现:
一种采用高效液相色谱法测定神经酸含量的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)取神经酸标准品、含有神经酸的待测样品,以甲醇为溶剂,超声1~5分钟;
(2)色谱条件为:采用C18色谱柱,以0.01 mol/L 磷酸二氢钾-甲醇为流动相等度洗脱。
优选的,采用的色谱柱填料具体为十八烷基硅烷键合硅胶。
优选的,所述流动相0.01 mol/L 磷酸二氢钾-甲醇的体积比为5~15:85~95。
优选的,所述流动相0.01 mol/L 磷酸二氢钾-甲醇的体积比为5:95。
优选的,检测波长在198nm~213nm之间。
优选的,检测的波长为210nm。
优选的,待分析标准品或样品的进样质量按C
优选的,分析流速为0.6 ml/min~1.5ml/min。
优选的,检测温度在20 ℃~30℃。
本发明方法色谱柱使用的填料为十八烷基硅烷键合硅胶,与CN109682900A中的色谱柱填料(辛烷基硅烷键合硅胶),提取溶剂、流动相组成有较大差异,属于在原理上本质不同的两种分析方法,通过与现有技术高效液相色谱法测定蒜头果油分离出的神经酸含量(赖福兵,李伟光等),蒜头果光合生理以及其种子中神经酸的提取纯化(付一笑) ,响应面优化超声辅助蒜头果中神经酸提取工艺及其HPLC分析(谷颖卓)中的高效液相色谱法测定神经酸的技术方案相对比,本发明创造性的仅使用了0.01mol/L 磷酸二氢钾与甲醇两个试剂组成的流动相,本发明方法检测时间约为8~15分钟,分析时间优于现有技术甲醇-乙腈-四氢呋喃-0.4%乙酸水溶液10:80:5:5流动相的18分钟,试剂组成得到的效果优于现有技术甲醇-乙腈-四氢呋喃-0.4%乙酸水溶液。
附图说明
图1 本发明方法实施例5神经酸标准品色谱图;
图2 本发明方法实施例5神经酸供试品色谱图;
图3 本发明方法神经酸线性回归方程图。
具体实施方式
本发明所使用的各种试剂均参照现有技术,使用色谱纯或分析纯级别。
实施例一:
(1)精密称取神经酸标准品约15mg置10ml量瓶中,加甲醇适量超声2分钟使溶解,并稀释至刻度,作为对照溶液。
(2)精密称取神经酸原料约15mg置10ml量瓶中,加甲醇适量超声2分钟使溶解,并稀释至刻度,作为供试品溶液。
(3)以0.01 mol/L 磷酸二氢钾-甲醇的体积比为3:97流动相等度洗脱,色谱柱柱为C
经测试,实施例1中神经酸的出峰时间为7.9分钟。
实施例二:
(1)精密称取神经酸标准品约15mg置10ml量瓶中,加甲醇适量超声2分钟使溶解,并稀释至刻度,作为对照溶液。
(2)精密称取神经酸原料约15mg置10ml量瓶中,加甲醇适量超声2分钟使溶解,并稀释至刻度,作为供试品溶液。
(3)以0.01 mol/L 磷酸二氢钾-甲醇的体积比为3:97为流动相等度洗脱,色谱柱柱为C
经测试,实施例2中神经酸的出峰时间为8.7分钟。
实施例三:
(1)精密称取神经酸标准品约15mg置10ml量瓶中,加甲醇适量超声2分钟使溶解,并稀释至刻度,作为对照溶液。
(2)精密称取神经酸原料约15mg置10ml量瓶中,加甲醇适量超声2分钟使溶解,并稀释至刻度,作为供试品溶液。
(3)以0.01 mol/L 磷酸二氢钾-甲醇的体积比为7:93为流动相等度洗脱,色谱柱柱为C
经测试,实施例3中神经酸的出峰时间为11.3分钟。
实施例四:
(1)精密称取神经酸标准品约10mg置10ml量瓶中,加甲醇适量超声2分钟使溶解,并稀释至刻度,作为对照溶液。
(2)精密称取神经酸原料约10mg置10ml量瓶中,加甲醇适量超声2分钟使溶解,并稀释至刻度,作为供试品溶液。
(3)以0.01 mol/L 磷酸二氢钾-甲醇的体积比为7:93为流动相等度洗脱,色谱柱柱为C
经测试,实施例4中神经酸的出峰时间为10.5分钟。
实施例五:
(1)精密称取神经酸标准品约10mg置10ml量瓶中,加甲醇适量超声2分钟使溶解,并稀释至刻度,作为对照溶液。
(2)精密称取神经酸原料约10mg置10ml量瓶中,加甲醇适量超声2分钟使溶解,并稀释至刻度,作为供试品溶液。
(3)以0.01 mol/L 磷酸二氢钾-甲醇的体积比为5:95为流动相等度洗脱,色谱柱柱为C
经测试,实施例5中神经酸的出峰时间为12.7分钟。
实施例六:
(1)精密称取神经酸标准品约10mg置10ml量瓶中,加甲醇适量超声2分钟使溶解,并稀释至刻度,作为对照溶液。
(2)精密称取神经酸原料约10mg置10ml量瓶中,加甲醇适量超声2分钟使溶解,并稀释至刻度,作为供试品溶液。
(3)以0.01 mol/L 磷酸二氢钾-甲醇的体积比为5:95为流动相等度洗脱,色谱柱柱为C
经测试,实施例6中神经酸的出峰时间为14.6分钟。
根据实施例5中的技术方案,对本发明方法的精密度、准确度、线性、对照溶液稳定性做了验证,结果如下:
精密度:
按照实施例5中的方法,平行制备6份供试品溶液,分别使用不同品牌的色谱柱,不同型号的高效液相色谱仪,在不同日期测定神经酸供试品的含量,结果见下表1、表2。
表1、表2可见,测定结果的相对标准偏差RSD均小于1.0%,本发明方法精密度高。
准确度:
精密称取125.37 mg 神经酸标准品置25 mL容量瓶中,加入适量甲醇,超声2分钟使其溶解后,加甲醇稀释至刻度线,摇匀,作为神经酸标准储备液。
采用加样回收的方法进行准确度的考察。精密称定约13.50 mg 供试品置 25 mL量瓶中,平行称取9份,加入适量甲醇,超声2分钟使其溶解,将上述样品平均分为三组,每组分别加入神经酸标准品储备液1.5、2.5、3.5 mL ,加甲醇定容至刻度线。以精密度实验测得结果92.53%计算物底物的含量,根据最终测得结果,计算回收率,测定结果如表3所示。
表3结果表明:本发明方法回收率均在98%~102%之间,RSD均小于2.0%,本发明方法准确度高。
线性:
精密称取75.01 mg 神经酸标准品至25 mL 容量瓶中,加入适量甲醇,超声2分钟使其溶解后,加甲醇稀释至刻度线,摇匀,作为线性储备液。
分别精密吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 、6.0mL的神经酸线性储备液分别置于10 mL容量瓶中,加甲醇稀释至刻度线,摇匀,精密吸取20 μl 注入高效液相色谱仪,记录色谱图。以神经酸峰面积和对应神经酸的浓度进行线性回归分析,由最小二乘法计算得回归方程y= 2178901.8610x + 68478.2000,相关系数为0.9998,说明在0.27~1.62 mg/mL 浓度范围内,神经酸的标准曲线线性良好。
稳定性:
按照实施例5中的方法,配制供试品溶液,放冰箱2~8 ℃ 保存,分别于0、1、2、4、6、8小时测定其峰面积。
表5结果表明:1、2、4、6、8小时与0小时峰面积的比值分别为99.34%、99.79%、100.46%、100.57%、99.12%,峰面积的RSD为0.58%,表明样品溶液在8小时内是稳定的。
机译: 高效液相色谱法测定血液中富马酸和马来酸含量的方法
机译: 猪中月桂酸含量的新型SNP标记物以及使用该方法测定月桂酸含量的方法
机译: 猪粪中癸酸含量的新型SNP标记物以及使用该方法测定癸酸含量的方法