使用能够增加腺苷水平的细菌菌株的治疗方法

摘要

本发明涉及能够产生腺苷或诱导腺苷的产生的乳酸菌菌株，其用于在受试者中产生腺苷。此类菌株的治疗用途包括治疗或预防与腺苷缺乏有关的疾病，例如伤口愈合。还提供了新型菌株。

说明书

技术领域

本发明在本文中提供了某些乳酸菌菌株、选择此类菌株的方法、以及含有此类菌株的产品，所述菌株因其增加腺苷水平用于预防和/或治疗伤口（以及如本文其它地方所述的其它疾病）的能力而被选择。此外，本发明涉及包含底物组分的制剂，所述底物组分特别选择为增强此类菌株的功效。

背景技术

联合国粮食及农业组织（Food and Agricultural Organization of the UnitedNations）已将益生菌定义为“当以足够的量施用时，对宿主赋予健康益处的活微生物”。假设益生菌经由微生物群组成的调节，经由代谢活性，或甚至通过与粘膜下面的免疫系统直接相互作用，来影响宿主的免疫功能。在此类相互作用之后，免疫机制可以被激活，如通过免疫介质例如细胞因子的释放、抗体的产生、以及淋巴细胞及其它免疫细胞的激活而反映的。这些激活的细胞、细胞因子和/或由益生菌释放的化合物将通过血液循环在机体的不同部位处发挥免疫调节功能。益生菌还可以预防或抑制病原体的增殖，并且压制通过病原体的毒力因子产生。

几种不同的细菌菌株目前用作益生菌，包括产生乳酸的细菌，例如乳杆菌属（

人体中一个重要的代谢过程是嘌呤代谢，其中嘌呤被特异性酶代谢且分解。此类酶的一个实例是胞外-5’-核苷酸酶（CD73），其被视为腺苷生成中的关键酶。腺苷是已知的免疫压制化合物，并且主要通过四种G蛋白偶联受体A1、A2a、A2b和A3发挥功能。腺苷的调节已作为治疗方法处于研究中，以便影响免疫和炎性系统。来自正常细胞的细胞外腺苷浓度为大约300 nM；然而，响应细胞损害（例如在炎性或缺血性组织中），这些浓度迅速升高（600–1,200 nM）。因此，关于应力或损伤，腺苷的功能主要是在缺氧、缺血和癫痫活动的情况期间，预防组织损害的细胞保护功能。腺苷具有极短的半衰期，因此当在临床环境中使用时，必须仔细地评估施用模式。当治疗某些类型的不规则心跳时，使用腺苷的静脉内施用。腺苷对糖尿病中的足部伤口的局部治疗，已显示在实验动物中急剧增加组织修复和重构。

伤口愈合是复杂的过程，并且通过四个重叠的阶段来实现：止血、炎症、增殖和最终重塑。这些阶段重叠，且一般具有4周的正常进展时间。慢性伤口已停滞在炎症状态，并且无法进一步进展，例如无法进展至增殖和重塑阶段。因此，慢性伤口可能永远无法愈合，或者可能需要数年才能愈合。此类伤口给患者造成严重的情绪和身体压力，并且可以导致严重的残疾以及甚至在某些情况下的死亡。它们还对患者和整个医疗系统两者产生显著的财务负担。因此，存在改善且加速伤口愈合，以及改善其它病况和/或疾病的需要，所述其它病况和/或疾病与腺苷产生或合成或水平减少、低或缺乏有关，或者以其为特征。

发明内容

如上文概述的，伤口愈合是涉及四个重叠阶段的复杂过程：止血、炎症、增殖和最终重塑。巨噬细胞在所有这些阶段中都起关键作用。随着伤口愈合，局部巨噬细胞群体从占优势地促炎（M1样表型）过渡为抗炎（M2样表型）。在toll样受体激动剂的存在下，通过腺苷刺激A2a受体使巨噬细胞从促炎M1样表型转变成抗炎/伤口愈合M2样表型。

腺苷具有极短的半衰期，因此当在临床环境中使用时，必须仔细地评估施用模式。当治疗某些类型的不规则心跳时，使用腺苷的静脉内施用，然而，最近美国食品药品监督管理局（U.S. Food and Drug Administration, FDA）警告医疗保健专业人员，关于此类药物罕见但严重的心脏病发作和死亡风险。即使市场上的产品具有较少的报道的安全关注，但仍然存在使用腺苷特性的益处用于更好和更安全的治疗的需要。

本发明基于以下发现：可以选择能够产生腺苷的细菌，例如乳酸菌。产生腺苷的乳酸菌在本领域中尚未报道。

因此，本发明提供了细菌菌株，例如乳酸菌菌株，其能够产生腺苷或诱导腺苷产生，用于受试者中的腺苷产生（例如，增加腺苷水平或者增加或促进腺苷的产生）。

此类产生腺苷的细菌菌株的治疗用途可以有利地帮助解决腺苷半衰期短的问题。例如，此类菌株可以在它们已施用后继续产生腺苷或诱导腺苷产生（例如允许连续产生），从而提供了更长期的腺苷产物来源。相对于针对一些疗法所提议的腺苷静脉内施用，这种特性还提供了明确优点，因为对于静脉内施用，腺苷将被快速清除，并且将需要腺苷的进一步施用来替换它。另外，通过使用此类细菌菌株例如益生菌允许的施用途径，例如经口或直肠施用途径，容易地允许实现受试者的频繁反复给药，从而改善疗效。如本文其它地方所述，另一个相关的优点在于，已显示了具有产生腺苷或诱导腺苷产生的能力的菌株可以促进全身腺苷水平增加，即使当菌株经口而不是全身例如静脉内施用时。这种效应是特别令人惊讶和有利的。

本发明进一步提供了用于在受试者中产生腺苷（例如，增加腺苷的水平、或者增加或促进腺苷的产生）的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的细菌菌株，例如乳酸菌菌株的步骤，所述细菌菌株能够产生腺苷或诱导腺苷的产生。

本发明进一步提供了细菌菌株，例如乳酸菌菌株在制造药剂或组合物中的用途，所述细菌菌株能够产生腺苷或诱导腺苷的产生，所述药剂或组合物用于在受试者中产生腺苷（例如，增加腺苷的水平、或者增加或促进腺苷的产生）。

此类菌株可能能够产生腺苷或诱导腺苷的产生。

此类产生腺苷的菌株可以用于伤口愈合。在一些情况下，它可以用于慢性伤口愈合。在其它情况下，伤口可以是难以愈合的、非愈合的或严重的伤口，并且在其它方面令人困扰的。任何类型的伤口都可以使用本发明来治疗，例如影响或损害或破坏受试者的上皮或内皮的任何伤口。特别地，在本文中待治疗的伤口类型可以是局部（例如在受试者的皮肤或其它表面上）、口部和/或肠的。伤口的实例为烧伤、静脉溃疡和动脉溃疡、糖尿病性溃疡、压力性溃疡、坏疽性脓皮病、复发性口疮性口炎（溃疡）以及在肠中发现的伤口，其为炎性肠病（IBD）的临床表现的部分，所述炎性肠病例如溃疡性结肠炎和克罗恩氏病（换言之，肠伤口或与IBD有关的伤口）。可以通过本文的本发明治疗的伤口的另一个实例是消化性溃疡。可以通过本发明治疗的伤口的进一步实例是口腔中的伤口，例如口腔溃疡或口部溃疡或口疮。在所有情况下，在一些方面，这些伤口可以是慢性伤口。

不希望受理论束缚，认为通过这些细菌菌株的腺苷产生，例如腺苷的局部或全身产生，可以用于促进巨噬细胞从占优势地促炎（M1样表型）到抗炎（M2样表型）的群体过渡或表型转变，例如增加具有抗炎（M2样表型）的巨噬细胞的数目或比例或百分比，例如与促炎（M1样表型）相比，且从而促进或实现如本文所述的伤口愈合。与相关对照相比，例如与其中不存在菌株的水平相比，可以方便地评价此类增加。

此类产生腺苷的菌株因此可以同样地用于治疗或预防受试者中的任何疾病，所述任何疾病与减少、低或缺乏的腺苷产生或合成或水平有关，或者以其为特征。下文概述了可以根据本发明治疗的疾病的一些具体实例。

腺苷是用于化妆品和个人护理产品中的天然成分，其充当皮肤恢复和舒缓剂以及抗衰老成分。关于腺苷的抗皱效应（以及其它相关的治疗或美容效应）的一种可能机制（Abella 2006，Int J Cosmet Sci，Dec；28（6）:447-51）是通过胶原产生。腺苷可能作用于A2A和A2B腺苷受体，并且从而直接刺激胶原基质形成（Shaikh和Cronstein 2016，Purinergic Signalling 12（2），191-197）。

腺苷还已显示促进具有稀疏毛发的人的毛发增厚。研究已发现，腺苷增加毛发生长的生长期，并且还增加毛干直径（Oura等人2008，J. Dermatology，35（12）:763-7）。因此，腺苷治疗可能对于毛发生长有显著结果，并且可以帮助患有雄激素性脱发的人。

因此，如本文所述的产生腺苷的菌株可以用于皮肤治疗（例如对皮肤具有有益作用的治疗），例如可以用于恢复皮肤（皮肤恢复治疗）或抗衰老治疗，例如抗皱治疗。此类菌株也可以用作皮肤舒缓剂。如本文所述的产生腺苷的菌株也可以用于毛发治疗（例如对毛发例如头发具有有益作用的治疗），例如可以用于促进或增加毛发增厚或毛发生长，或用于治疗或预防毛发脱落，例如用于雄激素性脱发等脱发类型。

任何适当的施用模式均可以用于此类治疗。特别地，局部和/或经口施用将优选用于上述皮肤和毛发病况的治疗。

因此，特别是当考虑毛发或皮肤治疗时，本发明还提供美容用途以及治疗用途。在一些实施方案中，将美容用途和治疗用途组合。在其它实施方案中，仅提供美容用途（美容用途而无治疗用途）、或仅提供治疗用途（治疗用途而无美容用途）。

腺苷信号传导减少和腺苷缺乏已与几种炎性病况相联系，所述炎性病况包括但不限于结肠炎（Naganuma等人2006，J Immunol，177:2765-69，Kurtz等人2014，Am J PhysiolGastrointest Liver Physiol，307（3）:G338-46）、炎性肠病（Friedman等人2009，PNAS，106（39），16788-93）、以及炎性肠综合征（Ochoa-Cortes等人2014，Inflamm Bowel Dis，20（7）:1259-87）。如本文所述的产生腺苷的菌株也可以用于治疗和/或预防炎性病况。优选地，菌株可以用于治疗和/或预防哺乳动物机体的胃肠（GI）道、泌尿生殖（GU）道、口腔、肺和气道中、皮肤等上的炎症性过程（或炎性疾病），包括但不限于结肠炎、炎性肠病（IBD）、肠易激综合症（IBS）、憩室炎、牙龈炎、阴道炎等。

任何适当的施用模式均可以用于此类治疗。特别地，经口施用将方便地用于治疗IBS、IBD、憩室炎或影响GI道的其它疾病。经口和/或局部施用将方便地用于治疗阴道炎、牙龈炎、或者影响GU道或口腔的其它疾病。

调节性T细胞（Treg）是T细胞的亚群，其调节免疫系统，维持对自身抗原的耐受性，并且消除自身免疫性疾病。Treg一般压制或下调效应T细胞（包括T细胞的TH1、TH2和TH17子集）的诱导和增殖；T细胞的这些促炎家族经由腺苷（由Treg产生）与受体A2A的相互作用来控制，所述受体A2A在T细胞上高度表达（Ohta and Sitkovsky 2014，Frontiers inImmunology，10；5:304）。

因此，如本文所述的产生腺苷的菌株可以用于治疗或预防与Treg缺乏或Treg功能障碍有关的疾病。

因此，如本文所述的产生腺苷的菌株也可以用于治疗和/或预防自身免疫性疾病，例如IPEX综合征（免疫失调、多内分泌腺病和肠病，伴X连锁遗传）。

再次，可以根据所讨论的疾病容易地确定适当的施用模式。

本发明的其它目的和优点对于读者将变得显而易见，并且预期这些目的和优点在本发明的范围内。

附图说明

图1显示了罗伊氏乳杆菌（

图2显示了如通过代谢物组学分析检测到的小鼠模型中的血浆腺苷。如所示的3组的比较。#：WT+LR相对于WT+MRS，# p<0.05；**：WT+LR相对于无处理的WT，** p<0.01。n = 8只小鼠/组。

图3A显示了与DSM 17938细菌细胞相比，罗伊氏乳杆菌DSM 33198细菌细胞的上清液中的5'-核苷酸酶活性的测量。图3B显示了与DSM 17938细菌细胞相比，各种罗伊氏乳杆菌细菌细胞的上清液中的5'-核苷酸酶活性的测量。

具体实施方式

伤口愈合过程通过四个重叠的阶段来实现：止血、炎症、增殖和最终重塑。这些阶段重叠，且一般具有4周的正常进展时间，尽管在一些情况下，伤口愈合可能需要数周或数月。慢性伤口已停滞在炎症状态，并且无法进一步进展，例如无法进展至增殖和重塑阶段。

在皮肤上的伤口中，血小板聚集以及趋化因子和生长因子（例如IL-1、TNF-a和TGF-b）的释放，激活局部成纤维细胞和角质形成细胞，并且激活免疫级联以启动炎症。作为表皮的主要细胞类型，角质形成细胞，释放促炎细胞因子（IL-8和IL-6）以及抗微生物肽和蛋白质。总之，这种免疫应答旨在通过募集和激活巨噬细胞、嗜中性粒细胞和角质形成细胞来净化伤口床，其导致伤口消毒以及后续的炎症消退。同时，一方面皮肤驻留T细胞和另一方面浸润性T细胞通过IL-17、IL-22和TNF-a的产生而参与炎症阶段，进一步扩大了宿主防御应答。并且最后，巨噬细胞（M1样表型）经历了从关键的炎症和杀微生物参与者到抗炎和调控活性（M2样表型）的表型转变。启动血管生成，并且M2巨噬细胞激活成纤维细胞，以产生细胞因子和生长因子（IL-10、VEGF和TGF-b），其通过角质形成细胞的迁移来刺激伤口闭合。

在慢性伤口中，认为促炎巨噬细胞（M1样表型）不能吞噬废嗜中性粒细胞（spentneutrophil），并且未能转变为抗炎M2样表型巨噬细胞。这导致募集更多的巨噬细胞，所述巨噬细胞继续产生促炎趋化因子（IL-8）和细胞因子（TNF-a），其加剧炎症并抑制伤口闭合。

在toll样受体激动剂的存在下，通过腺苷刺激A2a受体已显示使巨噬细胞从促炎M1样表型转变成抗炎/伤口愈合M2样表型（Ferrante等人2013，Inflammation，36（4）:921-31）。促炎M1样表型巨噬细胞降低CD39和CD73（被视为腺苷生成中的关键酶）的表达和活性两者，导致减少的ATP降解。相比之下，其特征在于产生抗炎细胞因子（IL-10和IL-1受体拮抗剂）和组织重塑分子的M2样表型巨噬细胞，显示了两种分解代谢酶的表达和活性增加，并且能够将ATP转换成腺苷（Zanin等人2012，PloS One，7（2）,e31205）。因此，M2巨噬细胞生成富含腺苷的环境，其依次又可以加强这些细胞的抗炎和组织重塑活性。

需要有效的伤口愈合的严重粘膜组织损害是炎性肠病（IBD）的主要特点，所述炎性肠病（IBD）具有两个实体：克罗恩氏病（CD）和溃疡性结肠炎（UC）。固有层单核细胞和M1巨噬细胞通过紧密连接蛋白的失调，上皮细胞连接蛋白的诱导和上皮细胞凋亡的诱导，TNF-a、IL-1b和IL-18的诱导来破坏肠道上皮屏障，因此驱动IBD中的肠道炎症。腺苷可以与M1巨噬细胞上的A2A受体结合，并且诱导向M2抗炎表型的转变。UC和CD两者均显示了发炎的粘膜中大量促炎M1驻留（Lissner等人2015，Inflamm Bowel Dis，21（6）:1297-305），因此，例如，使用根据本发明的产生腺苷的菌株，将这些M1巨噬细胞转变为M2巨噬细胞的能力，可以帮助这些疾病中的伤口愈合。

如上文概述的，优选的乳酸菌菌株是这样的菌株，其可以在受试者中，特别是在胃肠（GI）道、皮肤/伤口、口腔道（oral tract）/口部或其它适当的位置（取决于所讨论的疾病）中产生或诱导腺苷。此类腺苷可以作用于适当的细胞表面腺苷受体（例如A2A受体、A2B受体、A3或A4受体，优选A2A受体），并且导致产生升高水平的细胞内cAMP。例如，A2A和其它腺苷受体已知存在于GI道中发现的细胞和其为炎症性过程的部分的细胞中。因此，腺苷应该优选在细胞外提供，以便能够结合细胞表面腺苷受体。为此，腺苷可以在细菌细胞内产生，并且转运到细胞外（或分泌）。可替代地，腺苷可以在细胞外产生，例如在细菌细胞表面上或在上清液中产生。此类细胞外产生可以例如方便地借助于细胞壁（或细胞表面）锚定的5’-核苷酸酶（或胞外5’-核苷酸酶，CD73）的存在而发生，所述酶可以将适当的底物转换为腺苷。此类细胞外产生可以同样借助于在细胞上清液或细胞外空间中的5'-核苷酸酶（或胞外5'-核苷酸酶）的存在而发生。如本文所示，细菌菌株可以将此类5'-核苷酸酶（或胞外5'-核苷酸酶）提供或产生或释放到细胞上清液或细胞外空间内，所述酶然后可以在其中将适当的底物转换为腺苷。适当的底物包括AMP。

因此，当细菌菌株在本文中被称为能够产生腺苷时，这包括通过细菌细胞本身直接产生腺苷，并且还包括通过细菌细胞借助于具有活性5'-核苷酸酶（例如，存在于细菌细胞表面上、或者释放到细胞上清液或细胞外空间内）的细胞产生腺苷，并且从而将适当的底物例如AMP转换或能够转换为腺苷。此类底物可以是例如在环境中内源性地天然存在的，或者可以例如通过外源手段提供给细菌。

因此，本发明的菌株可以用于治疗与腺苷的减少或降低水平有关（或以其为特征）、或者与腺苷缺乏有关（或以其为特征）的任何疾病或病况，或者可以用于治疗可获益于腺苷的水平增加的任何疾病或病况。此类疾病或病况（以及实际上患有此类疾病或病况的受试者）可容易地被本领域技术人员识别，并且可例如包括这样的疾病、病况或受试者，例如与正常或健康受试者中的水平，例如具有相同、相当或可比较年龄的正常或健康受试者中的水平相比，所述疾病、病况或受试者具有低、减少例如显著减少（或异常）水平的腺苷或者腺苷缺乏。此类疾病的优选实例是伤口。在一些情况下，它可以用于慢性伤口愈合。在其它情况下，伤口可以是难以愈合的、非愈合的或严重的伤口，并且在其它方面令人困扰的。任何类型的伤口都可以使用本发明来治疗，例如影响或损害或破坏受试者的上皮或内皮的任何伤口。特别地，在本文中待治疗的伤口类型可以是局部（例如在受试者的皮肤或其它表面上）、口部和/或肠的。伤口的实例为烧伤、静脉溃疡和动脉溃疡、糖尿病性溃疡、压力性溃疡、坏疽性脓皮病、复发性口疮性口炎（溃疡）以及在肠中发现的伤口，其为炎性肠病（IBD）的临床表现的部分，所述炎性肠病例如溃疡性结肠炎和克罗恩氏病（换言之，肠伤口或与IBD有关的伤口）。可以通过本文的本发明治疗的伤口的另一个实例是消化性溃疡。可以通过本发明治疗的伤口的进一步实例是口腔中的伤口，例如口腔溃疡或口部溃疡或口疮。在所有情况下，在一些方面，这些伤口可以是慢性伤口。

待治疗疾病的其它实例在本文其它地方进行描述。例如，待治疗的疾病或病况包括伤口愈合、皮肤治疗、毛发治疗、炎性病况、与Treg缺乏或Treg功能障碍有关的疾病或者自身免疫性疾病。特别地，待治疗的疾病或病况包括局部、口部和/或肠伤口，皮肤恢复治疗，抗衰老治疗，促进或增加毛发增厚或毛发生长的治疗，治疗或预防毛发脱落，治疗或预防胃肠道、泌尿生殖道、口腔、肺和/或气道中、或皮肤上的炎症性过程，或者治疗或预防IPEX综合征。

用于此类治疗用途的优选菌株是产生腺苷的菌株。

因此，本发明的再进一步方面提供了能够产生腺苷或诱导腺苷的产生的乳酸菌菌株或乳杆菌属菌株。还提供了此类菌株的治疗用途。优选地，所述菌株具有编码5’-核苷酸酶的基因，或者此类菌株具有活性5’-核苷酸酶，例如以将AMP（或其它适当的底物）转换为腺苷。腺苷产生的示例性水平或者5'-核苷酸酶活性的水平在本文其它地方进行描述。

本发明的优选菌株是罗伊氏乳杆菌菌株，更优选罗伊氏乳杆菌菌株DSM 32846、DSM 32847、DSM 32848、DSM 32849和/或DSM 33198（其保藏细节在本文其它地方提供），并且此类菌株，例如分离的菌株或者此类菌株的生物学纯培养物或制备物，构成本发明的进一步方面，以下同样构成本发明的进一步方面：包含此类菌株的组合物（例如药物或营养组合物，例如食物补充剂或益生菌组合物，例如具有药学上或营养学上可接受的稀释剂和/或赋形剂），或者此类菌株的治疗用途，例如如本文其它地方所述，特别用于治疗或预防伤口例如慢性伤口、或如本文其它地方所述的其它疾病。用于本文所述的治疗用途的另一种优选菌株是DSM 17938（其保藏细节在本文其它地方提供）。然而，在一些实施方案中，不使用DSM 17938菌株。因此，本发明提供了用于疗法中，例如用于治疗或预防如本文其它地方所述的疾病的罗伊氏乳杆菌菌株DSM 32846、DSM 32847、DSM 32848、DSM 32849和/或DSM33198。本发明进一步提供了用于治疗或预防如本文其它地方所述的伤口例如慢性伤口，或者用于治疗或预防如本文其它地方所述的其它疾病的罗伊氏乳杆菌菌株DSM 32846、DSM32847、DSM 32848、DSM 32849和/或DSM33198。本发明进一步提供了用于治疗或预防如本文其它地方所述的伤口例如慢性伤口，或者用于治疗或预防如本文其它地方所述的其它疾病的罗伊氏乳杆菌菌株DSM 17938。

因此，本发明的一个再进一步方面提供了治疗或预防受试者中的伤口例如慢性伤口、或如本文其它地方所述的其它疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的罗伊氏乳杆菌菌株DSM 32846、DSM 32847、DSM 32848、DSM 32849和/或DSM 33198的步骤。在一些实施方案中，罗伊氏乳杆菌菌株DSM 17938也是优选的。

在另一个方面，本发明提供了罗伊氏乳杆菌菌株DSM 32846、DSM 32847、DSM32848、DSM 32849和/或DSM 33198在制造药剂或组合物中的用途，所述药剂或组合物用于治疗或预防受试者中的伤口例如慢性伤口、或如本文其它地方所述的其它疾病。在一些实施方案中，罗伊氏乳杆菌菌株DSM 17938也是优选的。

如本文其它地方所述的本发明的替代和优选实施方案和特征，同样适用于此处以及本文其它地方所述的本发明的治疗方法和用途。

菌株罗伊氏乳杆菌DSM 32846、DSM 32847、DSM 32848、DSM 32849和/或DSM 33198已因其产生腺苷的能力而被选择，例如通过具有编码5'-核苷酸酶的基因、以及可以将AMP底物转换为腺苷的活性5'-核苷酸酶，并且适合于增加腺苷的水平（例如与其中不存在菌株的水平相比）。菌株包含活性的细胞壁锚定的5'-核苷酸酶，并且在其各自的上清液中也显示了5'-核苷酸酶活性（参见图1和图3A/B）。罗伊氏乳杆菌菌株DSM 17938也具有这种能力。

这些罗伊氏乳杆菌菌株已由天然存在的菌株进行开发（换言之，进行修饰或适应或进化），并且还已因一种或多种其它改善的特性而被选择，所述特性例如对胆汁的抗性增加或对粘膜表面例如GI道表面的粘附性增加。因此，DSM 32846和DSM 32847已进化为对胆汁酸更耐受，并且从而例如在GI道中大量存活。DSM 32848和DSM 32849已进化为更好地粘附于粘液，目的是例如在GI道中更好地定殖，且从而根据本发明更好地起作用。罗伊氏乳杆菌菌株DSM 33198也已在包括反复冻干程序的多步骤选择方法中进行修饰，以允许其比其天然分离株（亲本菌株）更耐受，并且在生产过程中得到更高的存活。因此，此类菌株并不对应于自然界中存在的菌株，并且已被迫进化且是非天然菌株。选择或使用了所有菌株罗伊氏乳杆菌DSM 32846、DSM 32847、DSM 32848、DSM 32849和DSM 33198。优选的菌株是DSM32846、DSM 32847、DSM 32849或DSM 33198。更优选的菌株是DSM 32846、DSM 32847或DSM33198。在本发明的一个特定方面，菌株是DSM 32846和/或DSM 32847，例如在一些实施方案中，DSM 32846是优选的。在一些实施方案中，选择或使用了菌株DSM 33198。

因此，本发明还提供了乳酸菌菌株，其能够产生腺苷或诱导腺苷的产生（例如，增加腺苷的水平或者增加或促进腺苷的产生），用于受试者中的腺苷产生，例如受试者中的全身或局部产生。此类乳酸菌菌株优选具有编码5'-核苷酸酶例如细胞壁锚定的5'-核苷酸酶的基因，或者具有活性5'-核苷酸酶例如细胞壁锚定的5'-核苷酸酶。此类菌株可以用于治疗或预防与腺苷缺乏或水平减少有关（或以其为特征）的疾病，例如与相当的健康受试者中的水平相比，或者可以用于治疗或预防可获益于腺苷的水平增加的任何疾病或病况。

因此，本发明进一步提供了用于在受试者中产生腺苷的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的细菌菌株，例如乳酸菌菌株的步骤，所述细菌菌株能够产生腺苷或诱导腺苷的产生（例如，增加腺苷的水平或者增加或促进腺苷的产生）。

本发明进一步提供了细菌菌株，例如乳酸菌菌株在制造药剂或组合物中的用途，所述细菌菌株能够产生腺苷或诱导腺苷的产生（例如，增加腺苷的水平、或者增加或促进腺苷的产生），所述药剂或组合物用于在受试者中产生腺苷。

腺苷经由腺苷受体增加细胞内cAMP水平。

本发明的一个进一步目的是提供能够产生腺苷的新细菌菌株。

人体中一个重要的代谢过程是嘌呤代谢，其中嘌呤被特异性酶代谢且分解。这些酶的一个实例是胞外-5’-核苷酸酶（CD73），其被视为腺苷生成中的关键酶。

本发明人惊讶地发现一些特异性益生菌菌株能够产生腺苷。

因此，本发明包括选择有效产生腺苷的特异性细菌菌株，包括乳酸菌菌株的新方法。选择特异性细菌菌株的目的是将它们用于治疗某些病症例如伤口，例如慢性伤口，或者用于治疗如本文其它地方所述的其它疾病。

本发明提供了用于选择细菌菌株，特别是乳酸菌菌株的方法，所述细菌菌株可用作益生菌并用于疗法中，例如作为药物或作为食物补充剂。

因此，本发明的一个方面提供了用于选择能够产生腺苷的细菌菌株，优选乳酸菌菌株的方法，其中所述方法包括：

a）针对编码5'-核苷酸酶例如细胞壁锚定的5'-核苷酸酶的基因的存在，筛选细菌菌株例如乳酸菌菌株；和/或

b）针对活性5'-核苷酸酶例如细胞壁锚定的5'-核苷酸酶的存在，筛选细菌菌株例如乳酸菌菌株或其上清液。

此类5'-核苷酸酶（5'NT）也可以被称为胞外-5'核苷酸酶或CD73（分化簇73）。然后可以选择能够产生腺苷的菌株。

可替代地来看，本发明提供了通过以下用于选择细菌菌株优选乳酸菌菌株的方法：针对其产生腺苷的能力筛选细菌菌株例如乳酸菌菌株，并且选择具有该能力的菌株。

一旦已使用本发明的方法选择了适当的菌株，它就可以用于在受试者中产生例如局部或全身产生腺苷。因此，所述菌株还必须能够在受试者中产生例如局部或全身产生腺苷。

通过本发明的方法选择、产生、获得或可获得的细菌菌株，例如乳酸菌菌株是本发明的一个再进一步方面，其中所述菌株能够在受试者中产生腺苷，例如局部或全身产生腺苷。

还提供了通过本发明选择的菌株在伤口例如慢性伤口或如本文其它地方所述的其它疾病中的治疗用途。

因此，本发明的一个进一步方面提供了通过本发明的方法选择、产生、获得或可获得的细菌菌株，例如乳酸菌菌株，其中所述菌株具有5'-核苷酸酶基因或活性5'-核苷酸酶，并且能够产生腺苷，其用于在受试者中产生例如局部或全身产生腺苷。

本发明的替代实施方案提供了用于在受试者中产生例如局部或全身产生腺苷的细菌菌株，例如乳酸菌菌株，其中所述菌株具有5'-核苷酸酶基因或活性5'-核苷酸酶，并且能够产生腺苷。这种菌株的优选特征及其用途在本文其它地方进行描述。

还提供了治疗方法或用于在受试者中产生例如局部或全身产生腺苷的方法，所述方法包括以有效实现在所述受试者中产生例如局部或全身产生腺苷的量，向所述受试者施用通过本发明的选择方法选择、产生、获得或可获得的细菌菌株，例如乳酸菌菌株，或者施用细菌菌株例如乳酸菌菌株，其中所述菌株具有5'核苷酸酶基因或活性5'核苷酸酶，并且能够产生腺苷。菌株的优选特征及其例如在伤口如慢性伤口、或者如本文其它地方所述的其它疾病的治疗或预防中的治疗用途在本文其它地方进行描述。

本发明还提供的是通过本发明的选择方法选择、产生、获得或可获得的细菌菌株，例如乳酸菌菌株在制造组合物或药剂中的用途，其中所述菌株具有5'核苷酸酶基因或活性5'核苷酸酶，并且能够产生腺苷，所述组合物或药剂用于在受试者中产生例如局部或全身产生腺苷。替代实施方案提供了细菌菌株，例如乳酸菌菌株在制造组合物或药剂中的用途，其中所述菌株具有5'核苷酸酶基因或活性5'核苷酸酶，并且能够产生腺苷，所述组合物或药剂用于在受试者中产生例如局部或全身产生腺苷。菌株的优选特征及其例如在伤口如慢性伤口、或者如本文其它地方所述的其它疾病的治疗或预防中的治疗用途在本文其它地方进行描述。

包含如本文所述的细菌菌株（例如包含一种或多种细菌菌株）（例如能够产生或诱导腺苷等的细菌菌株）的产品或组合物，例如药物组合物、益生菌组合物、或饮食/保健组合物，以及所述产品或组合物在如本文所述的方法和用途中的应用，构成本发明的再进一步方面。

联合国粮食及农业组织将益生菌定义为“当以足够的量施用时，对宿主赋予健康益处的活微生物”。如今，许多不同的细菌被用作益生菌，例如产生乳酸的细菌，如乳杆菌属和双歧杆菌属的菌株。

如本文其它地方所述的本发明的替代和优选实施方案和特征同样适用于本发明的治疗方法、用途和产品。

如上所述，本发明涉及能够产生腺苷的细菌菌株的选择和用途。

有效产生腺苷的所述菌株可以用于在受试者例如哺乳动物，优选人中局部或全身产生腺苷。

因此，如上文概述的，本发明提供了用于选择或筛选能够产生腺苷的细菌菌株的各种方法。

一些方法包括筛选编码5’-核苷酸酶，例如细胞壁锚定的5’-核苷酸酶的基因的存在的步骤（例如步骤a））。此类筛选可以使用任何适当的方法进行，并且选择对于5’-核苷酸酶基因呈阳性的菌株。此类方法可方便地在体外进行，例如可以是基于遗传或核酸的方法，以检测编码5'核苷酸酶，例如细胞壁锚定的5’核苷酸酶（或其鉴定性片段）的基因的存在，所述5'核苷酸酶的序列是本领域已知的。例如，PCR方案（或其它基于核酸的技术）可以基于编码酶的已知核酸序列，容易地设计为实现这点，或者作为替代方法，可以仔细检查候选菌株的基因组序列，目的是例如基于与已知的5'核苷酸酶序列的同源性，鉴定编码5'核苷酸酶，例如细胞壁锚定的5'核苷酸酶的所述基因，包括例如如下文讨论的LPXTG-基序（SEQ IDNO：1）的存在。

在本发明的方法中待检测的示例性基因是来自罗伊氏乳杆菌的细胞壁锚定的（胞外）5'核苷酸酶基因（例如GenBank登录号：AEI56270.1，LPXTG-基序细胞壁锚定结构域蛋白[罗伊氏乳杆菌SD2112 ]），或来自其它细菌物种例如其它乳酸菌的适当同源物/5'核苷酸酶。示例性技术在实验实施例中进行描述。

一些方法包括筛选活性（功能性）5’-核苷酸酶，例如细胞壁锚定的5'核苷酸酶的存在的步骤（例如步骤b））。此类步骤可以使用任何适当的方法，例如使用酶促测定来进行。5'-核苷酸酶催化下述反应：AMP + H

用于进行此类测定的方法是本领域技术人员众所周知的。例如，适当的试剂盒是商购可得的，例如Crystal Chem 5’-Nucleotidase Assay Kit（Crystal Chem，目录#80229，Downers Grove，IL，USA），其中借助于染料（醌染料）的产生来测量5’-核苷酸酶活性，所述染料作为AMP转换为腺苷的下游产物（即，作为腺苷产生的结果）而形成。提供AMP作为底物。示例性技术在实施例部分中进行描述。适当的方法连同其5’-核苷酸酶试剂，也可容易地得自其它试剂供应商例如Sigma。

具有高或显著生产水平的5’-核苷酸酶（或5’-核苷酸酶活性）的菌株是优选的，例如具有至少或大于2单位/L（单位/升）的5’-核苷酸酶活性，和/或能够以至少或大于2 µmolL

包括至少步骤b）的方法将是优选的，因为编码5’-核苷酸酶的基因的存在不一定指示活性5’-核苷酸酶的存在。在本发明的方法、用途和乳酸菌中，腺苷产生或腺苷活性应该在细胞外，即在乳酸菌的外部或表面上发生，使得它可以例如存在于上清液或由乳酸菌产生的其它细胞外液中。因此，在细胞表面上，例如以细胞壁锚定的5’-核苷酸酶的形式，或细菌细胞的细胞外，例如在上清液中的活性5’-核苷酸酶的存在，可以是有用的特征，使得产生腺苷的反应在细胞外部，例如在细菌细胞的表面上发生。

因此，良好水平的腺苷（例如由5’-核苷酸酶产生的细胞外腺苷）的产生，也可以指示5’-核苷酸酶基因的存在或活性5’-核苷酸酶的存在。因此，本发明的选择方法还可以涉及选择产生腺苷的菌株的步骤。具有高或显著生产水平的腺苷例如细胞外腺苷的菌株是优选的，例如以在受试者中治疗上有效的水平产生腺苷的菌株。此类值一般指在培养的菌株的上清液中或培养的菌株的细胞表面上（在体外）测量的腺苷值，并且上文提供了一些示例性的特定值。

然而，在一些实施方案中，适当的是，指代在受试者中例如局部地，例如在施用部位处，例如在胃肠道中，或全身地，例如在血液或血浆中产生的腺苷的值、水平或量。例如当与如本文其它地方所述的相关对照，例如当不施用菌株时的腺苷水平，或特定受试者中的基础或天然腺苷水平相比较时，例如优选的菌株可以实现增加的腺苷产生，例如增加的腺苷体内产生，例如局部（例如在GI道中）或全身产生。

在本文描述的本发明的所有方面中，局部产生可以指在施用部位处的腺苷产生或水平，例如在胃肠道中的腺苷产生或水平（例如当施用是经口时）。全身产生可以方便地指循环系统中，例如在血液或血浆中的腺苷产生或水平。特别地，本文的实施例显示能够在体外/培养物中产生腺苷或诱导腺苷产生的菌株，也能够例如通过促进或诱导例如血浆或血液中全身腺苷水平增加，在体内产生腺苷或诱导腺苷的产生。甚至当菌株经口施用时，也观察到此类全身腺苷水平增加。特别是当菌株经口而不是全身例如静脉内施用时，菌株以这种方式刺激或促进全身腺苷水平增加的能力是特别令人惊讶和有利的。

例如在受试者的血浆或血液中，可以引起全身腺苷（或5’核苷酸酶活性）水平增加的菌株因此是优选的，特别是当菌株经口施用时观察到此类效应的情况下。优选地，所述增加是可测量的或显著的增加，例如是统计上或临床上显著的。例如，可以引起腺苷（或5'核苷酸酶活性）的水平，例如腺苷（或5'核苷酸酶活性），优选血液或血浆腺苷的局部或全身水平中的至少或至多1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍增加的菌株是优选的。可以使用任何适当的比较，例如，当与不施用菌株时观察到的水平、或施用对照制剂例如不含相关菌株的对照制剂的水平相比较时的增加。

测量腺苷（或5’核苷酸酶活性）产生的水平的适当方法是本领域技术人员众所周知的。因此，在本发明的一些实施方案中，选择方法将涉及检测或确定由候选菌株产生的腺苷的量或水平（例如浓度）的步骤。

任选地，腺苷产生或5’核苷酸酶活性（或实际上本文所述菌株的任何其它适当的特性）的水平，可以方便地与阳性或阴性对照菌株进行比较。适当的阳性对照菌株可以是DSM 17938，其已在实施例中显示，例如在细菌细胞的上清液中，产生显著水平的腺苷/5'核苷酸酶活性。例如在细菌细胞的上清液中，与DSM 17938相比，一些菌株产生更高水平，有时显著更高水平的腺苷/5'核苷酸酶活性。因此，例如当在体外评价时，例如在细菌细胞的上清液中，与DSM 17938相比，能够产生更高（增加）水平、或显著更高（增加）水平的5'核苷酸酶活性的菌株，构成本发明的一个再进一步方面。示例性菌株是DSM 32846、DSM 32847和DSM 32849（参见图1）以及DSM 33198（参见图3A）。可替代地来看，例如当在体外评价时，例如在细菌细胞的上清液中，与DSM 17938相比，能够产生更高（增加）水平、或显著更高（增加）水平的腺苷或诱导其产生的菌株，构成本发明的一个再进一步方面。例如当在体内评价时，与DSM 17938相比，能够在受试者中产生更高（增加）水平、或显著更高（增加）水平的腺苷，例如在受试者中更高的，等等，局部或全身例如血浆或血液腺苷水平或诱导其产生的菌株，构成本发明的一个再进一步方面，特别是当菌株经口施用时观察到此类效应的情况下。

一般而言，对于一些实施方案，当与DSM17938相比较时，具有一种或多种改善（例如，显著改善）特性的菌株是优选的。

优选地，（在腺苷产生或5’核苷酸酶活性中的）所述增加是可测量的或显著的增加，例如是统计上或临床上显著的。例如，与用DSM 17938的水平相比，可以引起腺苷水平，例如腺苷优选血浆或血液腺苷的局部或全身水平，或腺苷的体外水平，或5'核苷酸酶活性水平（例如当在体外评价时）中的至少或至多10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%、200%、250%、300%、350%、400%、450%、500%、550%或更高的增加的菌株是优选的。可替代地来看，与用DSM 17938的水平相比，可以引起腺苷水平，例如腺苷优选血浆或血液腺苷的局部或全身水平，或腺苷的体外水平，或5'核苷酸酶活性水平（例如当在体外评价时）中的至少或至多1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍的增加的菌株是优选的。体外水平可以如本文其它地方所述，例如在细菌培养物中方便地进行测量。优选地，此类增加是腺苷或5’核苷酸酶活性的细胞外水平中的增加，例如如在体外例如在细菌培养物的上清液中测量的。

适当的阴性对照菌株可以是不包含编码5'核苷酸酶的基因、或不包含活性5'核苷酸酶（或不具有如本文其它地方所述的5'核苷酸酶活性）的菌株。

由于通过本发明的方法选择的菌株的下游用途，在选择或分离产生腺苷的菌株之后，其它实施方案将涉及以下的进一步步骤：培养或繁殖或产生此类菌株，以及任选地将所述培养或繁殖或产生的菌株配制成包含所述菌株的组合物，例如药物组合物或营养组合物，例如如本文其它地方所述，或者可能例如通过冻干或冷冻干燥，将此类菌株贮存用于未来使用。

本发明的方法（以及实际上如本文所述的治疗方法）的选择步骤一般将需要在支持腺苷产生的适当培养基（或体内环境）中进行。优选的培养基（或体内环境）将含有适当的碳源，其将支持通过所述菌株的腺苷产生，优选地连同通过5’核苷酸酶用于腺苷产生的适当底物例如AMP一起。

尽管此类测定可以方便地在体外进行，但另一个选项将是在适当的体内测定中评价菌株，例如使用适当的小鼠模型（参见例如实施例5中所述的小鼠模型和测定，在其中例如可以评价血浆中的腺苷水平）。

在其中使用本发明的方法筛选多于一种细菌菌株的实施方案中，可以定量所生成的腺苷或5’核苷酸酶活性的量，并且可以选择具有最高活性或水平的5’-核苷酸酶，或足够高活性或水平的5’-核苷酸酶，例如具有如本文其它地方所述的活性或水平，例如具有比DSM17938更高（优选显著更高）的活性或水平的细菌菌株，例如乳酸菌菌株，或者可以选择产生最高量或水平的腺苷，或足够高量或水平的腺苷，例如具有如本文其它地方所述的量或水平，例如具有比DSM17938更高（优选显著更高）的量或水平的菌株。

因此，本发明的一个再进一步方面是提供了用于选择有效产生腺苷的细菌菌株，优选乳酸菌菌株的方法，所述方法包括：

a）针对编码5'-核苷酸酶例如细胞表面锚定的5'核苷酸酶的基因的存在，筛选乳酸菌菌株，和；

b）定量5’-核苷酸酶的活性，以及；任选地

c）选择具有最高或足够高的5’-核苷酸酶活性的乳酸菌菌株。

在适当时，包括如本文所述的某些步骤的方法还包括由这些步骤组成的方法。

如上文阐述的，通过本发明的方法选择、产生、获得或可获得的细菌菌株，例如乳酸菌菌株是本发明的一个再进一步方面，其中所述菌株能够产生腺苷。

任何适当的细菌菌株，例如益生菌菌株，例如任何益生菌，可以经受本发明的选择方法，并且能够产生腺苷的任何适当的细菌菌株，例如益生菌菌株，可以用于本发明的方法或用途中，例如本文所述的治疗方法或用途中。

优选的细菌菌株是乳酸菌，例如乳杆菌属或双歧杆菌属。特别优选的细菌菌株是罗伊氏乳杆菌，特别是于2018年7月4日，根据布达佩斯条约保藏于DSMZ-德国微生物保藏中心（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH）（MascheroderWeg 1b，Inhoffenstr. 7B，D-38124 Braunschweig）的菌株罗伊氏乳杆菌DSM 32846、DSM32847、DSM 32848和DSM 32849，以及于2019年7月9日，根据布达佩斯条约保藏于DSMZ-德国微生物保藏中心（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH）（Mascheroder Weg 1b，Inhoffenstr. 7B，D-38124 Braunschweig）的罗伊氏乳杆菌DSM33198。这些细菌菌株或分离的细菌菌株（以及其它菌株，例如罗伊氏乳杆菌菌株，特别是相关的罗伊氏乳杆菌菌株，其具有这些保藏菌株中的一种或多种的一种或多种特征，例如产生腺苷和/或5'核苷酸酶活性、或者诱导对腺苷和/或5'核苷酸酶活性的产生的作用的能力）构成本发明的优选方面，并且可以例如用于治疗如本文其它地方所述的疾病或病况、或者用于如本文所述的任何其它用途。用于本文所述的治疗用途的另一种优选菌株是DSM17938（其保藏细节在本文其它地方提供）。然而，在一些实施方案中，不使用罗伊氏乳杆菌菌株DSM 17938。

在一些实施方案中，所使用的细菌菌株不具有产生组胺或显著水平的组胺的能力。在一些实施方案中，所使用的细菌菌株不具有用于组胺产生的基因（组氨酸脱羧酶，hdcA（基因座标签HMPREF0536_1230））。在一些实施方案中，菌株不是ATCC PTA 6475、ATCCPTA 4659、ATCC PTA 4965、ATCC 5289、ATCC 5290、CF15-6、CF4-6g、LMS11-1、LMS11-3、SR-11、SR-14、CF6-2a、CF2-a0、Me261、DSM20016、DSM 32229、DSM 32230、DSM 32231、DSM 32232和/或DSM 32273。

因此，本发明的一个再进一步方面提供了此类菌株治疗或预防如本文所述的一种或多种疾病的用途。

本发明的另一个目的是提供用于改善如本文所述的特定病症的治疗的用途和效果的方法，其包括最大化、增加或改善所选菌株例如乳酸菌菌株的5’-核苷酸酶活性，其将优选导致增加或改善的腺苷产生。可以通过在特定生长条件下培养细菌，以允许高腺苷产率（或者例如与不存在特定生长条件下观察到的产率相比，更高例如显著更高的腺苷产率）来实现这点。在本发明的一个实施方案中，特定生长条件可以是例如在正常生长培养基中培养乳酸菌，所述生长培养基补充有通过5'核苷酸酶用于腺苷产生的适当底物例如AMP、或者AMP的适当上游组分例如ADP和/或ATP。

在本发明的一个进一步相关的实施方案中，为了使5’-核苷酸酶的活性最大化，可以施用更高浓度的细菌，例如乳酸菌。示例性浓度可能是常规剂量的2至10倍。

在本发明的一个进一步相关的实施方案中，可以通过适当的方法，例如插入其5’-核苷酸酶基因在适当的启动子，例如诱导型启动子的控制下的质粒载体，在细菌菌株中过表达或诱导5’-核苷酸酶基因。可替代地，可以通过将基因的一个或多个另外的拷贝插入细菌细胞内，例如在适当的启动子例如诱导型启动子或天然启动子的控制下，插入细菌细胞的染色体上，来过表达5’-核苷酸酶基因。

如上所述，本发明的菌株，或者通过本发明的方法选择、产生、获得或可获得的菌株具有在疗法中的用途。因此，本发明的一个进一步方面提供了本发明的产生腺苷的菌株，或者使用本发明的选择方法选择、获得或可获得的菌株，其用于腺苷的产生例如局部或全身产生。在本发明的优选实施方案中，所述腺苷的产生用于治疗伤口例如慢性伤口或如本文其它地方所述的其它疾病，其将获益于腺苷的产生或增加的产生，例如局部或全身产生等。

本发明的治疗方法和用途中的细菌菌株的施用，以药学上、治疗上或生理学上有效的量，对需要治疗的受试者（动物/哺乳动物）进行。因此，所述方法和用途可能涉及鉴定需要治疗的受试者的另外步骤。

根据本发明的疾病或病况的治疗（例如预先存在的疾病的治疗）包括所述疾病或病况的治愈，或者疾病或疾病症状的任何减少或减轻（例如疾病严重性的降低）。

本发明的方法和用途适合于疾病或病况的预防，以及疾病或病况的治疗。因此，预防性治疗也由本发明涵盖。为此，在本发明的方法和用途中，治疗或疗法在适当时还包括预防法或预防。

此类预防（或保护）方面可以方便地如本文所述对健康受试者或正常受试者进行，并且可以包括完全预防和显著预防两者。类似地，显著预防可以包括这样的情况，其中与如果没有给予治疗将预计的严重性或症状相比，疾病或疾病症状的严重性降低（例如可测量地或显著降低）。

本发明的一个再进一步方面提供了用于如本文其它地方定义的治疗用途的菌株或产品，其中所述用途进一步包括施用至少一种另外的试剂，例如另外的治疗试剂或营养试剂。示例性试剂可以是将增加或增强腺苷产生的底物组分（例如，可以增加或增强腺苷产生的组分），或此类组分的来源。

因此，在本发明的一个再进一步的实施方案中，当涉及产生腺苷的细菌时，所述菌株或产品的施用进一步包括底物组分例如AMP和/或产生这种组分的材料或试剂的施用。优选的底物是AMP或AMP的来源。

在此类实施方案中，底物组分或其它另外的组分可以在施用于受试者之前直接加入细菌制备物中。可替代地，它可以在制造过程结束时，例如在发酵结束时加入细菌制备物中，之后细菌可以例如通过冻干或冷冻干燥进行贮存用于未来使用。可替代地，它可以如下所述分开施用。

在此类实施方案中，另外的治疗试剂可以是可用于治疗所讨论的疾病的任何另外的试剂。

所述另外的试剂可以连同本发明的菌株或产品（例如，作为组合制剂）一起施用，或者可以分开施用。此外，所述另外的试剂可以与本发明的菌株或产品同时或在不同的时间点，例如序贯地施用。取决于所讨论的另外的试剂，技术人员可以容易地确定合适的施用方案和时机。

本发明还提供了组合物（或组合产品或试剂盒），其包含：

（i）通过本发明的选择方法选择、产生、获得或可获得的细菌菌株，例如乳酸菌菌株（或如本文另外定义的能够产生腺苷或诱导腺苷的产生的细菌菌株），其中所述细菌菌株具有编码细胞表面锚定的5’-核苷酸酶或活性5’核苷酸酶的基因，并且能够产生腺苷；和

（ii）将增加或增强腺苷产生的一种或多种底物组分或试剂，或者此类组分或试剂的来源。

上文概述了示例性的组分或试剂。优选的组分是AMP或AMP的来源。

如本文使用的，术语“受试者”包括哺乳动物，特别是人。在本发明的优选实施方案中，将选择的菌株例如乳酸菌菌株施用于人。患有所述疾病、或怀疑患有所述疾病、或处于所述疾病的风险中的任何受试者，例如任何人受试者，例如成人或儿童或婴儿或老年受试者是适当的。

因此，如本文其它地方所述，优选的受试者是患有如本文概述的一种或多种疾病的受试者，或者被认为或怀疑患有如本文概述的一种或多种疾病的受试者。由于本发明的治疗用途也可以用于预防疾病，因此适当的受试者包括处于患有如本文概述的一种或多种疾病的风险中的那些受试者。

待治疗的其它优选疾病（以及因此的受试者）是与腺苷缺乏有关的疾病或病况（或患有所述疾病的受试者）。对于此类疾病，示例性受试者包括这样的受试者，例如与正常或健康受试者中的水平，例如具有相同、相当或可比较年龄的正常或健康受试者中的水平相比，所述受试者具有低、减少例如显著减少（或异常）水平的腺苷或具有腺苷缺乏。

在所有此类受试者中，适当时或必要时，可以使用本领域可容易地获得和已知的技术，容易地测量所述受试者中的腺苷水平。例如，腺苷的水平可以容易地在血清/血液/血浆或唾液样品中进行测量。

可以使用任何适当的施用模式，并且可以根据所讨论的疾病容易地选择。方便地，所述施用是经口和/或局部的。因此，需要时或适当时，可以将细菌施用于GI道、GU道（例如阴道）、口腔、皮肤或局部地伤口中（或对于本文所述的任何其它疾病适当的局部施用）。细菌可以包括在益生菌局部配方或食物补充剂或油滴剂，以及药物制剂中。

根据待治疗的疾病（或病况）、施用模式和涉及的制剂，可以容易地选择如本文定义的本发明的菌株、产品和组合物的适当剂量。

例如，这样选择剂量和施用方案，使得根据本发明施用于受试者的细菌可以导致腺苷的增加产生，例如局部或全身（例如血浆或血液）产生，并且在伤口例如慢性伤口或如本文其它地方所述的其它疾病中引起所需疗效或健康益处。因此，优选地，所述剂量是治疗有效剂量，其适合于待治疗的哺乳动物的类型和病况，并且例如施用于有此需要的受试者。例如，可以使用例如10

当与适当的对照相比较时，如本文所述的，术语“增加”或“增强”或“更高”（或等价术语）包括任何可测量的增加或升高。适当的对照可容易地由本领域技术人员鉴定，并且可以包括当菌株不存在时的水平，或者未治疗的或安慰剂治疗的受试者中的水平，或者健康或正常受试者例如年龄匹配的受试者、或治疗前的同一受试者中的水平。优选地，增加将是显著的，例如临床上或统计上显著的，例如具有≤0.05的概率值。

优选地，当与适当的对照水平或值相比较（例如，与未治疗的或安慰剂治疗的受试者相比较，或者与健康或正常受试者或治疗前的同一受试者相比较）时，此类增加（以及实际上如本文其它地方提到的其它增加、改善或正面效应）是可测量的增加等（适当时），更优选地，它们是显著增加，优选临床上显著或统计学上显著的增加，例如具有≤0.05的概率值。

当与适当的对照相比较时，如本文所述的，术语“降低”或“减少”（或等价术语）包括任何可测量的降低或减少。适当的对照可容易地由本领域技术人员鉴定，并且可以包括当菌株不存在时的水平，或者未治疗的或安慰剂治疗的受试者中的水平，或者健康或正常受试者例如年龄匹配的受试者、或治疗前的同一受试者中的水平。优选地，降低或减少是显著的，例如临床上或统计上显著的，例如具有≤0.05的概率值。

因此，优选地，当与适当的对照水平或值相比较（例如，与未治疗的或安慰剂治疗的受试者相比较，或者与健康或正常受试者或治疗前的同一受试者相比较）时，此类降低（以及实际上如本文其它地方提到的其它降低、减少或负面效应）是可测量的降低等（适当时），更优选地，它们是显著降低，优选临床上显著或统计学上显著的降低，例如具有≤0.05的概率值。

如整个申请自始至终使用的，术语“一个”和“一种”以它们意指所提及的组分或步骤的“至少一个/种”、“至少第一”、“一个或多个/一种或多种”或“多个/种”的含义使用，除了其中上限在其后具体陈述的情况下之外。

另外，当术语“包含（comprise）”、“包含（comprises）”、“具有（has）”或“具有（having）”、或其它等价术语在本文中使用的情况下，则在一些更具体的实施方案中，这些术语包括术语“由……组成”或“基本上由……组成”、或其它等价术语。

列表“由本文讨论的各种组分和特征组成”也可以指“包含”各种组分和特征的列表。

根据下述非限制性实施例，其它目的和优点将更充分地显而易见。

实施例

实施例1

用于鉴定具有编码细胞表面定位的5’-核苷酸酶的基因的菌株的方法

在厌氧大气中在37℃下在MRS平板上培养细菌16小时。用无菌塑料环收集10个细菌菌落，并且悬浮于100微升的无菌水（PCR质量）中。（可替代地：使用合适的方法由细菌培养物制备DNA）。

5’-核苷酸酶基因的存在可以通过PCR来检查，例如通过使用PuReTaq Ready ToGo PCR珠（GE HealthCare）和下文所述的引物对中的任一种（各0.4 mM）。应该将细菌悬浮液或DNA制备物（0.5微升）加入PCR混合物中，并且应该通过运行以下程序来执行PCR反应：95℃，5分钟；30x（95℃，30秒；55°C，30秒；72°C，30秒）；72°，10分钟。可以通过使用标准琼脂糖凝胶电泳来分开且显现PCR产物，并且通过标准桑格测序（使用用于PCR的正向引物）来测定序列。

可以使用下述引物中的任一种来检测该基因：

引物对1（产物大小233 bp）

LrNuc1f：GGAACTTTGGGAAACCATGA（SEQ ID NO:2）

LrNuc1r：CGGGCAACTTTACCATCACT（SEQ ID NO:3）

引物对2（产物大小212 bp）

LrNuc2f：TACTCGTGAAAATGCCGTTG（SEQ ID NO:4）

LrNuc2r：GTGCCCCTGTCATTTCAACT（SEQ ID NO:5）

引物对3（产物大小232 bp）

LrNuc3f：AGCTTTACCAAATTGACCCTGA（SEQ ID NO:6）

LrNuc3r：TTGATATTAGGCGCATCCTTTT（SEQ ID NO:7）

序列

编码细胞表面锚定的5’-核苷酸酶的基因，GenBank登录号：AEI56270.1，LPXTG基序细胞壁锚定结构域蛋白[罗伊氏乳杆菌SD2112]（SEQ ID NO：8）

ATGAAGAATAATAGTTCAAAATATTGTTTATTGTTAGGGACAGCGCTGTTAGGACTATATTTCCAAGCTAATAGTGTTCATGCGGATGCGACTGGTATCACAGCTAATGGAGAAACTACCCATAGCAATGTTACTCCAATGGTTCAGACTAATAAGGATGAGGCAAGTACACCGCAAACAACTACTGATTGGTCTGACCCGGCCAAATATCAAAGTGACATTCCAGTTCAGATTTTAGGAATCAATGACTTGCATGGTGGGTTAGAAACGACTGGATCAGCTACGATTGGAGATAAGACTTATTCGAATGCCGGAACAGTTGCACGCCTAGCTGGTAACCTTGATGCGGCGGAGGAAAGTTTTAAGAACGCTAATCCGACGGGAAGCTCAATTCGGGTAGAAGCCGGAGATATGGTTGGGGCTTCTCCAGCAAATTCTGCTCTTCTCCAAGACGAATCAACCATGCATGCTTTAGACGCAATGCATTTTGAAATAGGAACTTTGGGAAACCATGAGTTCGATGAAGGTTTAGCTGAGTATATGCGGATTGTTAATGGTGGTGAACCTACTAAACAATATAATGAAGCTGAGATGGCCTATCCTCATGTGAAAACAGGGATTAATATCATTACTGCCAATGTTGTAAATAAATCTGATGGTCAAATCCCATTTGGAATGCAACCATACTTGATTAAAGAAATTCATACTAGTGATGGTAAAGTTGCCCGGATCGGATTTATTGGGATTGAAACTACTTCCCTACCAATTTTAACCTTATACGATAATTACAAAGATTATGATGTTTTAGACGAGGCTGAAACAATTGCAAAATATGATCAAATTTTACGCAAAAAAGGTGTTAACGCAATTGTAGTTCTTGCCCATACAGGGGTTTCAACTGATAAAGATGGCAGCACTAAAGGTAATGCTGTTGATATCATTAAGAAGCTTTACCAAATTGACCCTGATAATTCTGTCGACCTTTATATTGCTGGTCACTCCCACCAATATGCTAATGCTACTGTTGGAAGTGTAAAATTAGTGCAAGCCATTTACACGGGTAAAGCTTACGATGATATTATCGGTTACATCGATCCAACAACTAATGATTTTGCGCCCAATAGTCTCGTTTCACATGTCTTTCCGGTACTATCTGAAAAGGATGCGCCTAATATCAAAACGGATGCAAATGTTACAGCAATTGTTGAAGATGCGAACAACCGAGTAGCACCGATTATTAACAAGAAAATAGGGGAAGCTGCTACAACAGGCGATATTCTTGGACGACTTCATAATACTCCTACTCGTGAAAATGCCGTTGGTGAATTAGTTGTCGATGGTCAATTATATGCCGCTCATAAAGTAGGCTTACCAGCTGATTTTGCGATGACTAATACAGGGGGCGTTCGTGCAGATCTGCATGTTAATCCTGATCGTTCCATTACATGGGGGAGTGCCCAAGCAGTTCAACCATTTGGTAATATTTTGCGGGTAGTTGAAATGACAGGGGCACAAATCGTTGAAGCCTTGAATCAACAATACGACGAAGATCAAGCTTACTACTTACAGATTTCCGGGCTACATTATACTTATACTGACCAAAACGATCCTAACCAACCATATAAGGTCGTTCAAGTTTATGACCAACATAATCAACCGCTTGATATGAATAAGACTTACAATGTTGTTATTAATGACTTTTTAGCAGGTGGCGGAGATGGCTTTTCTGCATTTAAGGGTACTAAAGTTGTCGGGATTGTTGGTCAAGATACAGACGCGTTTATTGACTATATTACTGATATGACTAATGATGGTAAACCAATTACTGCGCCAACAATGAACCGTAAGATTTACTTGACTGCTGAACAAGTAGCGAAGGCTGACTCAGATTCACAGTTACAAACAGGAACTAATCAGAACACTCAAAACGATGCTAATTCCCAGACTGAAGGAAATCAGCTTCAAGAAGTTCCGAGCCAACCGGTATCTCCAACAGTAACCTTGCCAACAACAGCTGGTCAACCCGCCGAAACTGTTACACTACATGCTCAATCTAAGCAACAAACCGTAGCTGCTAATAATCAATTAATTAATTTGACGCCTACATCAATTAATGGCCAAAAACAAAAAGCAGCTGACCAGCAAGCAGCTTTACCACAAACTAGTAACGATGAAGATCTTGCATTACTTCTTCTCGGAAGTTCATTAATGGCAGCAACCGGATTGACAATTATTGATCGCAAGCGTAAACATGCTTAA

细胞表面锚定的5’-核苷酸酶蛋白，GenBank登录号：AEI56270.1，LPXTG-基序细胞壁锚定结构域蛋白[罗伊氏乳杆菌SD2112]（SEQ ID NO：9）

MKNNSSKYCLLLGTALLGLYFQANSVHADATGITANGETTHSNVTPMVQTNKDEASTPQTTTDWSDPAKYQSDIPVQILGINDLHGGLETTGSATIGDKTYSNAGTVARLAGNLDAAEESFKNANPTGSSIRVEAGDMVGASPANSALLQDESTMHALDAMHFEIGTLGNHEFDEGLAEYMRIVNGGEPTKQYNEAEMAYPHVKTGINIITANVVNKSDGQIPFGMQPYLIKEIHTSDGKVARIGFIGIETTSLPILTLYDNYKDYDVLDEAETIAKYDQILRKKGVNAIVVLAHTGVSTDKDGSTKGNAVDIIKKLYQIDPDNSVDLYIAGHSHQYANATVGSVKLVQAIYTGKAYDDIIGYIDPTTNDFAPNSLVSHVFPVLSEKDAPNIKTDANVTAIVEDANNRVAPIINKKIGEAATTGDILGRLHNTPTRENAVGELVVDGQLYAAHKVGLPADFAMTNTGGVRADLHVNPDRSITWGSAQAVQPFGNILRVVEMTGAQIVEALNQQYDEDQAYYLQISGLHYTYTDQNDPNQPYKVVQVYDQHNQPLDMNKTYNVVINDFLAGGGDGFSAFKGTKVVGIVGQDTDAFIDYITDMTNDGKPITAPTMNRKIYLTAEQVAKADSDSQLQTGTNQNTQNDANSQTEGNQLQEVPSQPVSPTVTLPTTAGQPAETVTLHAQSKQQTVAANNQLINLTPTSINGQKQKAADQQAALPQTSNDEDLALLLLGSSLMAATGLTIIDRKRKHA

实施例2

用于分析5’-核苷酸酶活性的程序

Crystal Chem 5’-核苷酸酶测定试剂盒（Crystal Chem，Elk Grove Village，IL，USA）用于测定细菌细胞和发酵上清液的5’-核苷酸酶活性。简言之，程序如下。

在两个步骤中，将试剂CC1和CC2加入含有细菌或上清液的样品中。试剂1含有通过来自细菌的5’-核苷酸酶转换为腺苷的AMP。腺苷通过试剂1中的组分进一步水解成肌苷和次黄嘌呤。在第二步中，次黄嘌呤被转换为尿酸和过氧化氢，其用于生成醌染料，所述醌染料在分光光度计中在550 nm处进行动力学测量。通过计算3至5分钟之间的吸光度变化，并且与来自校准样品的值进行比较，来确定活性。

实施例3

罗伊氏乳杆菌菌株中的5’-核苷酸酶活性

使用上文实施例2中所述的方法生成了实验数据，其显示了罗伊氏乳杆菌DSM32846、DSM 32847、DSM 32848和DSM 32849，以及罗伊氏乳杆菌DSM 17938（于2006年1月30日，根据布达佩斯条约保藏于DSMZ-德国微生物保藏中心（Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH）（Mascheroder Weg 1b，D-38124Braunschweig）中的5’-核苷酸酶活性。结果显示于图1中。

实施例4

菌株选择

上文实施例3中的所有新菌株，即罗伊氏乳杆菌DSM 32846、DSM 32847、DSM 32848和DSM 32849，都显示了在细菌上清液中的5’-核苷酸酶活性。对浓度为10

罗伊氏乳杆菌DSM 32846、DSM 32847、DSM 32848和DSM 32849已就改善的特性进行开发/进化。DSM 32846和DSM 32847已制备成进化为对胆汁酸更耐受，并且从而在GI道中大量存活。DSM 32848和DSM 32849已进化为更好地粘附于粘液，目的是在GI道中更好地定殖，且从而根据本发明更好地起作用。

选择所有菌株罗伊氏乳杆菌DSM 32846、DSM 32847、DSM 32848和DSM 32849。优选的菌株是DSM 32846、DSM 32847和DSM 32849。

实施例5

菌株对血浆中的腺苷水平的作用

材料和方法

结果

代谢物组学分析检测到血浆腺苷。与饲喂MRS的小鼠对照组（p<0.05）或无处理的小鼠组（p<0.01）相比，每天向健康的母乳喂养的小鼠经口饲喂罗伊氏乳杆菌DSM 17938显著增加了血浆腺苷的强度等级（图2）。WT+LR/无处理的WT的倍数变化＝ 5.95，而WT+LR/WT+MRS的倍数变化＝ 4.4。WT+MRS相对于无处理的WT的组之间不存在显著差异。

实施例6

罗伊氏乳杆菌菌株中的5’-核苷酸酶活性

使用上文实施例2中所述的方法生成了实验数据，其显示了罗伊氏乳杆菌DSM33198中的5’-核苷酸酶活性。结果显示于图3A中，其中它们已关于来自同一实验的DSM17938的5’-核苷酸酶活性（DSM17938活性=1）进行标准化。还已对来自图1的结果完成了关于DSM17938的5’-核苷酸酶活性（DSM17938活性=1）的相同类型的标准化，并且这呈现于图3B中，使得对于不同的细菌菌株，容易地比较关于DSM17938的5’-核苷酸酶活性中的倍数变化。

实施例7

菌株选择

上文实施例6中的新菌株，即罗伊氏乳杆菌DSM 33198，显示了在细菌上清液中的高5’-核苷酸酶活性。对浓度为10

罗伊氏乳杆菌DSM 33198已就改善的特性进行开发。罗伊氏乳杆菌菌株DSM 33198已在包括反复冻干程序的多步骤选择方法中进行修饰，以允许其比其天然分离株更耐受，并且在生产过程中得到更高的存活。

选择了罗伊氏乳杆菌DSM 33198。