对金散中抗偏头痛有效成分的分离鉴定及其应用

摘要

本发明属于中药技术领域，具体公开了对金散中的抗偏头痛有效成分分离鉴定及其应用，本发明筛选了“对金散”抗偏头痛的有效成分，其选自黄芩苷、白杨素‑7‑O‑β‑D‑葡萄糖醛酸苷、千层纸素A‑7‑O‑β‑D‑葡萄糖醛酸苷、白杨素‑6‑C‑阿拉伯糖‑8‑C‑葡萄糖苷和白杨素‑6‑C‑葡萄糖‑8‑C‑阿拉伯糖苷中的任何一种单体化合物或一种以上的单体化合物按照任意的比例组成的混合物；研究结果表明，本发明分离得到的单体化合物在抗偏头痛药物中效果显著。

说明书

技术领域

本发明属于中药复方治疗偏头痛有效成分的发现和应用领域，具体涉及“对金散”治疗偏头痛的有效成分的分离鉴定及其应用。

背景技术

偏头痛(Migraine)是单侧或双侧搏动性头痛的原发性中枢神经系统功能紊乱性疾病，其病因较为复杂，当前主流的三叉神经血管学说认为脑血管周围的三叉神经末梢受到刺激后，释放某些神经肽如CGRP等，使相邻颅内血管的血管壁过度扩张，产生波动性头痛。同时导致血管通透性发生改变，血浆成分漏出，血小板激活，肥大细胞产生脱颗粒变化，产生无菌性炎症，并形成恶性循环。对三叉神经细胞的研究表明，在神经源性炎症的条件下，会增加三叉神经细胞释放CGRP。同时，三叉神经节中TRPV1的激活也可以引起CGRP和P物质的释放，导致偏头痛。

目前治疗偏头痛的药物有：钙离子拮抗剂，5-HT1B/1D受体激动剂，α肾上腺素受体阻断剂，CGRP受体拮抗剂，非甾体类消炎药等，但是它们均存在一定的毒副作用。中医药是我国医学科学的特色，在疗效好，毒性小等方面具有独特的优势，因此从中医药中发掘干预偏头痛的药物具有重要意义。目前，治疗偏头痛常用中成药和医院制剂有天舒胶囊、天麻钩藤颗粒、正天丸等；中药复方汤剂有：天芎止痛汤、芎麻汤、等。尽管上述中成药对缓解急性发作的偏头痛方面疗效良好，但通常由于活性成分不清晰、作用机理不明确等缺陷，导致其市场信任度不高，难以通过国际标准认证。因此，运用现代手段阐明中药复方对偏头痛的治疗机制具有重大意义。

“对金散”出自明代王绍隆《医灯续焰》，由黄芩(酒制)、大黄(酒制)等份组成，治疗偏正头风。其中的黄芩(酒制)，为出自宋代朱端章《卫生家宝方》的小清空膏，以酒浸透，晒干的片黄芩粉末，治疗偏正头痛。其中的大黄(酒制)，在清代魏之琇《续名医类案》中有记载，以酒浸九蒸九晒的大黄粉末，与茶调服，治疗头痛。黄芩最早被记录在《神农本草经》中，为唇形科植物黄芩ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根。味苦，性寒，归肺、胆、脾、小肠、大肠经，具有清热燥湿，泻火解毒，止血，安胎的功效。其化学成分为黄酮及其苷类，多糖，挥发油类等成分。大黄主要来源是蓼科植物掌叶大黄Rheumpalmatum L.、唐古特大黄Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.或药用大黄Rheum officinaleBaill.的干燥根及根茎。性味苦寒，归胃、肝、大肠经，具有泻下攻积、清热泻火、凉血解毒、逐瘀通经、利湿退黄的功效。其化学成分复杂，主要包括蒽醌、蒽酮、二苯乙烯、鞣质、色酮、苯丁酮苷等各类化合物。黄芩、大黄的化学成分及药理作用现代研究较为成熟，但目前国内外尚未有黄芩联合大黄治疗偏头痛的文献。

发明内容

本发明的目的在于从“对金散”提取物中分离鉴定得到具有抗偏头痛活性的单体化合物。

本发明的另一目的在于提供从“对金散”提取物中分离得到的5种单体化合物在制备治疗偏头痛药物中的应用。

本发明的又一目的在于提供一种用于治疗偏头痛的药物组合物。

本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：

从酒制大黄和酒制黄芩中分离得到的单体化合物在制备抗偏头痛药物中的应用，所述的单体化合物选自黄芩苷、白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、白杨素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷和白杨素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷中的任意一种或一种以上的组合。

作为一种优选技术方案，所述的单体化合物为以下(1)～(5)中的任意一种：

(1)黄芩苷、白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、白杨素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷和白杨素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷中的任意一种；

(2)黄芩苷、白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、白杨素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷和白杨素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷的组合；

(3)黄芩苷、白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、白杨素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷和白杨素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷中的任意两种的组合；

(4)黄芩苷、白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、白杨素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷和白杨素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷中的任意三种的组合；

(5)黄芩苷、白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、白杨素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷和白杨素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷中的任意四种的组合。

一种抗偏头痛单体化合物的制备方法，将酒制大黄和酒制黄芩的全成分提取物通过高效液相色谱-四级杆飞行时间串联质谱进行分离和鉴定获得所述的单体化合物。

作为一种优选技术方案，所述酒制大黄和酒制黄芩的全成分提取物的制备方法为：将酒制大黄及酒制黄芩分别粉碎过筛，以1:1的质量比称取酒制大黄、酒制黄芩粉末混合均匀，加入95％乙醇溶液，80～90℃水浴加热回流提取后，放冷，抽滤，将残渣加入50％乙醇溶液，80～90℃水浴加热回流提取后，放冷，抽滤，将残渣继续加入纯水，100℃水浴加热回流提取后，放冷，抽滤，将滤液混合真空旋蒸回收溶剂即得酒制大黄、黄芩的全成分提取物。

作为一种优选技术方案，所述分离和鉴定方法包括：在1260型高效液相色谱仪HPLC Hedera ODS-2色谱柱上进行分离，用0.3％甲酸水和甲醇进行洗脱；飞行时间质谱和电喷雾电离源用于负离子模式的分析；运用Qualitative Analysis B.06.00软件，结合文献和Massbank数据库，对共有峰进行定性鉴别确定分离的单体化合物的结构。

一种治疗偏头痛的药物组合物，该药物组合物为以下(1)～(6)中的任意一种：

(1)由治疗上有效量的黄芩苷或其可药用的盐与药学上可接受的载体组成的组合物；

(2)由治疗上有效量的白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷或其可药用的盐与药学上可接受的载体组成的组合物；

(3)由治疗上有效量的千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷或其可药用的盐与药学上可接受的载体组成的组合物；

(4)由治疗上有效量的白杨素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷或其可药用的盐与药学上可接受的载体组成的组合物；

(5)由治疗上有效量的白杨素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷或其可药用的盐与药学上可接受的载体组成的组合物；

(6)由治疗上有效量的黄芩苷、白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、白杨素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷和白杨素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷中的一种以上按照任意比例组成的混合物与药学上可接受的载体组成。

作为一种优选技术方案，将所述药物组合物按常规的制剂方法制备成药学上可接受的剂型。

本发明首先制备“对金散”提取物，通过高效液相色谱-四级杆飞行时间串联质谱鉴定”对金散”提取物的主要化学成分：将酒制大黄及酒制黄芩分别粉碎，过200目筛，以1:1的比例称取酒制大黄、酒制黄芩粉末共20g，混合均匀。加入95％乙醇溶液300mL，85℃水浴加热回流提取2小时，放冷，抽滤，将残渣加入50％乙醇溶液300mL，85℃水浴加热回流提取2小时，放冷，抽滤，将残渣继续加入纯水300mL，100℃水浴加热回流提取2小时，放冷，抽滤，将滤液混合真空旋蒸回收溶剂，将浸膏粉末于50℃烘干后称重，即得“对金散”提取物，在阴凉干燥条件下保存。高效液相色谱-四级杆飞行时间串联质谱(HPLC-Q-TOF/MS)技术的高灵敏度和选择性，以及低检测限的优点，使其在复杂中药提取物中的定性及定量研究中具有广泛的应用，因此本发明运用HPLC-Q-TOF/MS技术，采用电喷雾负离子模式，用QualitativeAnalysis B.06.00软件进行“对金散”质谱总离子流图的提取得到“对金散”总离子流图。此后，运用Qualitative Analysis B.06.00软件，结合文献和Massbank数据库，按照共有峰质谱信息对共有峰进行定性鉴别，确定化合物的结构式。

对于具有参考标准物质的化合物，进一步确认了保留时间和二级质谱信息的结构；对于不能获得参考标准物质的化合物，首先根据碎片离子的精确质量计算碎片组成并通过比较化学数据库给出的可能结构式来研究相似结构化合物的质谱。最终本发明确定了“对金散”提取物的26种单体成分。这些单体主要分为13种黄酮和9种蒽醌类，1种多酚类，1种有机酸类和一种糖类；此后，针对与偏头痛相关的9个蛋白，通过分子对接技术筛选出白杨素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷、白杨素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷、黄芩苷、白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷这5种单体成分再进行下一步的研究。

炎症因子作为神经血管性炎症中的潜在疼痛介质，可诱导脑膜血管的无菌性炎症，导致偏头痛的发生。TNF-α是一种重要的促炎性介质，可以通过MAPK信号转导系统JNK和P38通路上调体外培养的大鼠三叉神经细胞种CGRP-mRNA的表达，引起CGRP的释放。TNF-α还可以通过促进CGRP转录，刺激前列腺素生成产生痛觉过敏，激活脑膜伤害感受器，提高神经元兴奋性，进而造成持续性头痛。抗偏头痛药物舒马曲坦能显著降低CGRP-mRNA表达水平，其可能是通过抑制MAPK信号通路起作用。本发明提取培养原代三叉神经细胞，使用TNF-α为造模剂，成功建立三叉神经细胞炎症模型，白杨素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷、白杨素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷、黄芩苷、白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷5种单体成分均具有一定抑制CGRP释放的作用，呈剂量依赖性。其中舒马曲坦与模型组相比能够极显著地抑制CGRP的释放，推测“对金散”可能通过抑制TNF-α受体或其下游信号通路达到调控CGRP-mRNA的表达发挥干预偏头痛的作用。在270μmol/L时筛选出的化合物与模型组相比均有显著性差异，说明各化合物具有一定体外抗偏头痛活性。

TRPV1可以通过多种方式参与偏头痛的发作，在源自硬脑膜的三叉神经节近一半的传入神经中发现TRPV1存在，激活这些包含TRPV1的硬脑膜神经纤维可以释放CGRP和P物质，而CGRP和P物质能够引起神经源性炎症，表明TRPV1可能在神经性炎症通路中起作用。本发明采用MTT法对化合物白杨素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷、白杨素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷、黄芩苷、白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷和舒马曲坦进行细胞毒性实验，确定无毒浓度范围。使用脂质体转染法将TRPV1质粒转染入HEK 293细胞，使其表达TRPV1蛋白。运用高通量实时荧光检测分析系统检测HEK 293细胞内钙离子含量进行药效验证实验，结果显示化合物白杨素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷、白杨素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷、黄芩苷、白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷和舒马曲坦具有一定抑制TRPV1的作用，体现了中药通过多成分作用于靶点的特点。其中化合物黄芩苷、白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷能够在90μM极显著性降低辣椒素刺激表达TRPV1的HEK293细胞内钙离子荧光强度升高，且抑制效果略优于舒马曲坦，可能是“对金散”干预偏头痛的关键活性成分。

综上所述可见，由“对金散”提取物中分离的黄芩苷、白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、白杨素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷和白杨素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷可能与CGRP受体结合，抑制CGRP与CGRP受体结合，避免血管壁过度扩张引起偏头痛。同时，化合物也能通过抑制TNF-α、TRPV1受体，调控细胞内p38-MAPK和PKC等信号通路，进而减少CGRP的释放。

由此，本发明筛选了“对金散”抗偏头痛的有效成分，其选自黄芩苷、白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、白杨素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷和白杨素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷中的任何一种单体化合物或一种以上的单体化合物按照任意的比例组成的混合物；优选的，所述“对金散”抗偏头痛的有效成分，选自黄芩苷、白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、白杨素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷和白杨素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷中的任何一种单体化合物或由黄芩苷、白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、白杨素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷和白杨素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷按照任意的比例组成的混合物。研究结果表明，本发明分离得到的单体化合物在抗偏头痛药物中效果显著，上述的单体化合物在制备抗偏头痛药物中的应用属于本发明的保护主题之一。

本发明中所述的黄芩苷、白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、白杨素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷和白杨素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷可按照本说明书所提供的方法从“对金散”中分离得到。

上述治疗偏头痛单体化合物的制备方法也是本发明的保护主题之一。本发明提供了一种从“对金散”中分离获得黄芩苷、白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、白杨素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷和白杨素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷的方法。

本发明的进一步目的是提供治疗偏头痛的药物组合物，该药物组合物由治疗上有效量的黄芩苷或其可药用的盐与药学上可接受的载体组成；或者是由治疗上有效量的白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷或其可药用的盐与药学上可接受的载体组成；或者是由治疗上有效量的千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷或其可药用的盐与药学上可接受的载体组成；或者是由治疗上有效量的白杨素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷或其可药用的盐与药学上可接受的载体组成；或者是由治疗上有效量的白杨素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷或其可药用的盐与药学上可接受的载体组成；或者是由治疗上有效量的黄芩苷、白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、白杨素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷和白杨素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷中的一种以上按照任何比例组成的混合物与药学上可接受的载体组成。

将药学上可接受用量的黄芩苷、白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、白杨素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷和白杨素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷与药学上可接受的载体或稀释剂配合后，按本领域常规的药物制剂方法将其制备成任意一种适宜的药物组合物；通常该组合物适合于口服给药和注射给药，也适合其它的给药方法；该药物组合物可以按照药物制剂的常规制备方法制备成片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、锭剂、栓剂或口服液等各种制剂形式。根据不同的给药方法，本发明药物组合物可以含有0.1％-99％重量，优选10-60％重量的黄芩苷、白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷或千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷单体化合物。

本发明的有益效果：

本发明筛选了“对金散”中抗偏头痛的有效成分。研究结果表明，本发明分离得到的单体化合物在抗偏头痛药物中效果显著。

附图说明

图1化合物与TNF-α受体结合图；

其中，(A)黄芩苷结合3D图；(B)黄芩苷结合2D图；(C)白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷结合3D图；(D)白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷结合2D图；(E)千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷结合3D图；(F)千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷结合2D图；绿色表示氢键作用力；粉红色表示疏水间作用力；棕黄色表示静电作用力。

图2化合物与TRPV1受体结合图；

其中，(A)黄芩苷结合3D图；(B)黄芩苷结合2D图；(C)白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷结合3D图；(D)白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷结合2D图；(E)千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷结合3D图；(F)千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷结合2D图；绿色表示氢键作用力；粉红色表示疏水间作用力；棕黄色表示静电作用力。

图3化合物与CGRP受体结合图；

其中(A)黄芩苷结合3D图；(B)黄芩苷结合2D图；(C)白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷结合3D图；(D)白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷结合2D图；(E)千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷结合3D图；(F)千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷结合2D图；绿色表示氢键作用力；粉红色表示疏水间作用力；棕黄色表示静电作用力。

图4“对金散”预测显效成分对TNF-α刺激三叉神经细胞释放CGRP的影响；

其中，1-5依次为化合物白杨素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷、白杨素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷、黄芩苷、白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷和千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷；##表示与M组比较有极显著性差异(p<0.01)；纵坐标为相对空白组增加的值。

图5化合物1-6对表达TRPV1的HEK293细胞内钙离子荧光强度的影响；

其中，(A)白杨素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷荧光强度变化图；(B)白杨素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷荧光强度变化图；(C)黄芩苷荧光强度变化图；(D)白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷荧光强度变化图；(E)千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷荧光强度变化图；(F)舒马曲坦荧光强度变化图；K为空白组，M为模型组；横坐标为检测时间，纵坐标为荧光强度相对变化率ΔF/F0；其中F0表示初始十个时间点的荧光强度平均值，ΔF表示检测时间点荧光强度与F0的差值；图中从左往右第一个箭头表示在第180s加入V底板1药物，第二个箭头表示在第660s加入V底板2药物；##表示与M组比较有极显著性差异(p<0.01)，#表示与M组比较有显著性差异(p<0.05)。

图6化合物1-6对表达TRPV1的HEK293细胞内钙离子荧光强度的影响；

其中，(A)化合物1-6在270μM浓度时对HEK293细胞内钙离子荧光强度的影响；(B)化合物1-6在90μM浓度时对HEK293细胞内钙离子荧光强度的影响；(C)化合物1-6在30μM浓度时对HEK293细胞内钙离子荧光强度的影响；(D)化合物1-6在10μM浓度时对HEK293细胞内钙离子荧光强度的影响；化合物1-6依次为化合物白杨素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷、白杨素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷、黄芩苷、白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷和舒马曲坦；K为空白组，M为模型组；横坐标为检测时间，纵坐标为荧光强度相对变化率ΔF/F0；其中F0表示初始十个时间点的荧光强度平均值，ΔF表示检测时间点荧光强度与F0的差值；图中从左往右第一个箭头表示在第180s加入V底板1药物，第二个箭头表示在第660s加入V底板2药物；##表示与M组比较有极显著性差异(p<0.01)，#表示与M组比较有显著性差异(p<0.05)。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

试验例1“对金散”中治疗偏头痛有效成分的分离、鉴别以及治疗偏头痛作用药效验证试验1试验材料

大黄(产地：甘肃礼县)，黄芩(产地：山东莒县)，大黄酸(中检所，纯度>98％，批号：110757-200206)，大黄素(中检所，纯度>98％，批号：110756-200110)，大黄素甲醚(中检所，纯度>98％，批号：758-20006)，芦荟大黄素(中检所，纯度>98％，批号：110795-201007)，大黄酚(成都曼斯特，纯度>98％，批号：must-14072416)，黄芩苷(成都曼斯特，纯度>98％，批号must-11101403)，汉黄芩苷(南京森贝伽生物科技公司，纯度>98％，批号：09203)，黄芩素(成都曼斯特，纯度>98％，批号：must-17031608)，汉黄芩素(成都曼斯特，纯度>98％，批号：must-17110603)，白杨素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷(南京森贝伽生物科技公司，纯度≥98％，批号：201802)，白杨素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷(南京森贝伽生物科技公司，纯度≥98％，批号：201802)，白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(南京森贝伽生物科技公司，纯度≥98％，批号：201901)，千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(南京森贝伽生物科技公司，纯度≥98％，批号：201901)

2试验方法

2.1“对金散”全成分提取物制备

将酒制大黄及酒制黄芩分别粉碎，过200目筛，以1:1的比例称取酒制大黄、酒制黄芩粉末共20g，混合均匀。加入95％(v/v)乙醇溶液300mL，85℃水浴加热回流提取2小时，放冷，抽滤，将残渣加入50％乙醇溶液300mL，85℃水浴加热回流提取2小时，放冷，抽滤，将残渣继续加入纯水300mL，100℃水浴加热回流提取2小时，放冷，抽滤，将各滤液混合并真空旋蒸回收溶剂，将浸膏粉末于50℃烘干后称重，即得“对金散”提取物，在阴凉干燥条件下保存。

2.2高效液相色谱-四级杆飞行时间串联质谱

通过高效液相色谱-四级杆飞行时间串联质谱鉴定“对金散”提取物的主要化学成分。在1260型高效液相色谱仪HPLC Hedera ODS-2色谱柱上进行分离，用0.3％(v/v)甲酸水溶液和甲醇进行洗脱；洗脱过程：液相条件为：甲醇(A)：0.3％甲酸水(B)、流速：1mL/min、柱温：25℃，检测波长：256nm；梯度洗脱条件为：0-5min、A：10％-30％；5-93min、A：30％-100％；93-96min、A：100％-100％。飞行时间质谱和电喷雾电离源用于负离子模式的分析；运用Qualitative Analysis B.06.00软件，结合文献和Massbank数据库，对共有峰进行定性鉴别确定分离的单体化合物的结构。

2.3分子对接

2.3.1疾病相关蛋白的获取

通过CTD数据库导出经过试验验证的偏头痛疾病基因。通过UniProt数据库，输入偏头痛(Migraine)。将上述基因整理，去除重复基因，通过DrugBank数据库进行筛选，得到具有已知上市药物的基因。在PDB数据库搜索下载所选靶蛋白的PDB格式，共得到9个相关蛋白，分别为6A93(5-HT)、4XJJ(TGFB)、4TWT(TNF)、1XPC(ESTR)、5IS0(TRPV1)、3BXK(CACNA1A)、3N7P(CGRP)、6FCX(MTHFR)、4OVN(SCN5A)。

2.3.2蛋白和成分的准备

将靶蛋白导入Discovery Studio软件中，然后进行删除靶蛋白水分子，加极性氢及CHARMm力场进行能量校正，保存为对接受体。将化学成分三维结构导入DS软件中给配体小分子赋力场。

2.3.3受体蛋白活性位点的确定

对于没有配体的晶体结构，可利用软件自带的功能，查找活性位点。

对于有配体的晶体结构，可以以该配体分子的位置为中心再向外扩张

2.3.4分子对接可靠性检验

在确定的9个靶蛋白中，6A93、4XJJ、1XPC、4TWT、5IS0晶体结构中含有原始配体，采用CDOCKER对接得到的配体构象与原配体的构象能够较好的重合，两者之间RMSD值小于2，说明这四个靶点的对接方法可靠准确；对于晶体结构中不含有原始配体，先在ChEMBL数据库中查找靶点的抑制剂和非抑制剂，以IC50或Ki小于等于10μmol的小分子为抑制剂，反之为非抑制剂，组成验证集，进行验证。记录每个小分子的分值最高构象，计算抑制剂和非抑制剂两组对接得分的P值，若P值小于0.01，则说明抑制剂组与非抑制剂组对接得分上有极显著差别，说明对接方法可靠准确。

2.3.5进行分子对接CDOCKER计算

基于CHARMM的CDOCKER方法用于分子对接。CDOCKER是DiscoveryStudio3.0(DS3.0)软件中一个在CHARMM脚本中编写的蛋白质配体分子对接程序。其中，对蛋白和质谱所得的小分子进行加氢和电场处理，使用DS3.0软件执行分子对接程序。在表格视图中查看配体分子每个姿势取相对应的-CDOCKER_INTERACTION_ENERGY值，该值越高，表明结合的姿势取相越佳。

2.4试验细胞培养

三叉神经细胞从新生3～5天的健康大鼠头部原代提取，培养于含B27的Neurobasal培养基中，置于37℃、CO

HEK293细胞(获赠于中国药科大学基础医学与临床药学学院)，培养于含5％胎牛血清的DMEM培养基中，置于37℃、CO

2.5“对金散”预测显效成分基于CGRP的体外药效试验

研究对金散预测显效成分抑制TNF-α刺激三叉神经细胞释放CGRP的作用。将细胞板中原培养基全部吸出，与新鲜培养基混合后重新均匀分配，每孔150μL。给药组在各孔中加入样品药液，模型组和空白组加入等量的培养基，放置于细胞孵箱中预处理4h，给药组和模型组加入终浓度为200ng/mL的TNF-α溶液，空白组加入等量的PBS溶液，放置于细胞孵箱中处理24h，用ELISA试剂盒测定细胞上清液中CGRP的含量。

2.6“对金散”预测显效成分基于TRPV1通路的体外药效验证实验

在6孔板中培养HEK293细胞，待细胞生长至70-80％汇合度时转染。将TRPV1质粒-脂质复合物加入到细胞中(J Physiol 598.19(2020)pp 4321–4338)，37℃孵箱中培养细胞24-48h，在荧光显微镜下观察转染情况。

事先在黑壁底透的96孔板中每孔加入0.1％(g/100ml)左旋多聚赖氨酸溶液60μL，放在孵箱中孵育至少45min后，吸出左旋多聚赖氨酸溶液，置超净台中晾干。用0.25％胰酶-EDTA(0.25g/100ml)消化待检测转染成功的HEK293细胞，取10μL细胞悬液计数，调整细胞密度为1-1.3×10

2.7数据和统计分析

使用Graphpad Prism软件对数据进行绘图与分析，所得结果表示为平均值±标准误(Mean±SEM)，采用单因素方差分析(One-way ANOVA)比较各组间均值差异，p<0.05则认为具有统计学差异。

3试验结果

3.1高效液相色谱-四级杆飞行时间串联质谱

根据表1可知“对金散”提取物经质谱鉴定共有26种成分，包括蔗糖、没食子酸、5,2′-二羟基-6,7,8-三甲氧基黄酮、儿茶素-7-O-β-D-葡萄糖苷、白杨素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷、白杨素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷、白藜芦醇-4′-O-β-D-(2″-O-没食子酰)葡萄糖苷、5-羟基-4′-甲氧基二氢黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、5,7,2′-三羟基-6-甲氧基黄酮-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷、黄芩苷、大黄酸-8-O-β-D-葡萄糖苷、去甲汉黄芩素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、汉黄芩苷、芦荟大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、黄芩素、汉黄芩素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚。但是在众多的化学成分中，究竟发挥作用的有效成分或者有效成分群尚不清楚。

表1“对金散”提取液质测定结果

3.2分子对接

运用CTD，UniProt和DrugBank数据库筛选出偏头痛相关的9个靶蛋白，用Discovery Studio软件研究“对金散”化学成分与疾病相关蛋白活性位点的对接情况，将化合物按照-CDOCKER_INTERACTION_ENERGY打分进行排序。对接结果显示，化合物可以很好地对接到蛋白的活性位点空腔中，为了客观地评价综合打分结果，采用主成分分析法进行评价。分析结果显示，在提取两个主成分时对解释原变量(即9个指标数据)的方差贡献率达到为86.056％>85％，故选择提取两个主成分进行分析。2个主成分的特征根分别为A1＝6.644，A2＝1.101，2个主成分的方差贡献率分别为λ1＝0.73827，λ2＝0.12229。最后排名得到打分前6的化合物分别是白杨素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷、白杨素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、黄芩苷、去甲汉黄芩素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷。

从图1、2和3可以看到，黄芩苷、白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷和千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷可以通过疏水间作用力、静电作用力和氢键等作用力与三种靶蛋白结合，表明以上化合物具有一定抑制靶蛋白的作用。它们可能通过抑制TNF-α、TRPV1受体，调控细胞内p38-MAPK和PKC等信号通路，进而减少CGRP的释放。同时，化合物也能与CGRP受体结合，抑制CGRP与CGRP受体结合，避免血管壁过度扩张引起偏头痛。综上所述，“对金散”抗偏头痛的成分为白杨素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷、白杨素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、黄芩苷、白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷。

3.3“对金散”预测显效成分基于CGRP的体外药效试验

由图4可知，白杨素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷、白杨素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷、黄芩苷、白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷能以剂量依赖性抑制TNF-α刺激引起的CGRP释放，在270μmol/L时与模型组相比均与显著性差异，说明上述化合物具有一定体外抗偏头痛活性。

3.4“对金散”预测显效成分基于TRPV1通路的体外药效验证实验

由图5知，与模型组相比，化合物白杨素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷、白杨素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷在浓度为270μM及化合物黄芩苷、白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷在浓度为90μM时均能极显著性降低辣椒素刺激表达TRPV1的HEK 293细胞内钙离子荧光强度升高。舒马曲坦在浓度为30和90μM时能显著性降低辣椒素刺激TRPV1的HEK 293细胞内钙离子荧光强度升高。

由图6知，在270μM浓度时化合物白杨素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷、白杨素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷、黄芩苷、白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷和舒马曲坦均能够极显著降低辣椒素刺激TRPV1的HEK 293细胞内钙离子荧光强度升高；在90μM浓度时化合物抑制荧光强度变化的能力从强到弱排序为黄芩苷>千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷>白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷>舒马曲坦>白杨素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷>白杨素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷；在30μM浓度时，舒马曲坦组仍然能够显著降低辣椒素刺激TRPV1的HEK 293细胞内钙离子荧光强度升高；在10μM浓度时，各化合物均不能降低辣椒素刺激TRPV1的HEK 293细胞内钙离子荧光强度升高。以上结果表明化合物白杨素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷、白杨素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷、黄芩苷、白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷和舒马曲坦均能以剂量依赖性抑制TRPV1通道的激活，舒马曲坦相对于化合物白杨素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷、白杨素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷、黄芩苷、白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷和千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷具有更小的最低有效浓度，但是化合物黄芩苷、白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷能够在90μM极显著性降低辣椒素刺激表达TRPV1的HEK293细胞内钙离子荧光强度升高，且抑制效果略优于舒马曲坦。