一种南美白对虾β-1,3-葡聚糖结合蛋白抗菌肽

摘要

本发明公开了一种南美白对虾β‑1,3‑葡聚糖结合蛋白抗菌肽PvGBP 5，其氨基酸序列为QVKAQLNYAKRKNAI，抗菌肽的分子量为1745Da。实验证明，本发明抗菌肽PvGBP 5对具有耐热性的及孢子形成的微生物，特别是芽孢杆菌，产生了较强的抑制作用，可以在制备治疗或预防芽孢杆菌的药物中得到广泛应用，特别是作为黑木耳培养耳棒的抑菌剂。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种南美白对虾β-1,3-葡聚糖结合蛋白抗菌肽及其应用。

背景技术

木耳培养过程中，从被污染的木耳培养耳棒中所提取的细菌大多为芽孢杆菌属，都会对真菌产生拮抗作用，并且能够产生多种的拮抗化合物，包括脂肽、环肽、几丁质酶和挥发性有机物等。虽然目前木耳的培养技术已经较为成熟，但在木耳的培养过程中，如果耳棒的灭菌处理不到位，则会因为广泛分布于自然界的枯草芽孢杆菌、尼氏芽孢杆菌等芽孢杆菌属的细菌，导致耳棒受到污染，最终影响木耳的产量，给木耳生产企业带来较大的经济损失。同时被污染的耳棒受到许多芽孢杆菌属细菌的污染，也会对消费者的食品安全卫生造成不小的影响。

在木耳生产过程中，如使用化学合成的除菌剂来抑制芽孢杆菌感染，除了易导致各种健康问题，还存在增加食品安全的风险。近几年来，抗菌肽作为生物除菌剂和食品防腐剂，在农业生产中得到广泛应用。抗菌肽是生物体产生的一类具有广谱抗菌、抗病毒、杀寄生虫、抗肿瘤等活性的小分子多肽的总称，广泛分布于自然界的各种生物体内。抗菌肽因其具有抗菌谱广、不受传统抗生素耐药突变株影响、不易产生耐药菌株、与传统抗生素有协同作用、中和内毒素等特性，已成为国内外免疫学和分子生物学的研究热点，并且有望成为新一代绿色抗菌剂和免疫调节剂。

南美白对虾（

发明内容

本发明的目的在于提供一种南美白对虾β-1,3-葡聚糖结合蛋白抗菌肽及其应用，通过南美白对虾β-1,3-葡聚糖结合蛋白抗菌肽PVGBP 5对从木耳培养耳棒上提取的枯草芽孢杆菌、尼氏芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、溶淀粉芽孢杆菌等细菌抑菌活性的研究，为寻找新的木耳培养耳棒的抑菌剂提供实验依据，促进我国食品和木耳养殖行业的健康、持续发展。

为了解决上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种南美白对虾β-1,3-葡聚糖结合蛋白抗菌肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

以南美白对虾β-1,3-葡聚糖结合蛋白为目标寻找其序列中的抗菌肽存在可行的理论依据。因此，我们利用AntiBP、APD3和CAMP三个在线服务器对南美白对虾β-1,3-葡聚糖结合蛋白序列筛选和计算，发现了对枯草芽孢杆菌、尼氏芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、溶淀粉芽孢杆菌等芽孢杆菌属的细菌具有很强抗菌作用的抗菌肽序列QVKAQLNYAKRKNAI，命名PVGBP 5，分子量为1745Da。

抗菌肽PVGBP 5可以从至少如下两个方面对细菌造成破坏：一方面，吸附在细菌细胞膜表面，破坏细胞膜导致细菌死亡；另一方面，破坏细胞膜的同时改变细菌细胞膜的通透性，并抑制细胞膜生成，降低细菌污染器具的可能性。

本发明还提供上述南美白对虾β-1,3-葡聚糖结合蛋白抗菌肽在制备治疗或预防芽孢杆菌的药物中的应用。

优选的，上述芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌、尼氏芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、溶淀粉芽孢杆菌中的一种或多种。

本发明还提供上述南美白对虾β-1,3-葡聚糖结合蛋白抗菌肽在制备木耳培养耳棒中的抑菌剂的应用。

本发明还提供一种木耳培养耳棒抑菌剂，其活性成分为上述南美白对虾β-1,3-葡聚糖结合蛋白抗菌肽。

本发明的抗菌肽可以采用本领域技术人员已知的方法合成，例如固相合成，并采用本领域技术人员已知的方法进行纯化，例如高效液相色谱法。

实施本发明，具有如下有益效果：

本发明以南美白对虾β-1,3-葡聚糖结合蛋白为研究对象，并通过筛选和计算，发现一个全新氨基酸序列的多肽PVGBP 5。研究PVGBP 5对枯草芽孢杆菌、尼氏芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、溶淀粉芽孢杆菌等芽孢杆菌属的抑菌活性；并以枯草芽孢杆菌为例利用透射电镜观察PVGBP 5对其破坏程度；利用激光共聚焦显微镜观察PVGBP 5是否能吸附在细菌表面。实验结果表明，该肽对枯草芽孢杆菌、尼氏芽孢杆菌等芽孢杆菌属细菌具有强烈的抑制作用。它的抑菌机理是首先吸附在细菌表面，然后破坏细菌的细胞膜，并抑制膜的生成。本发明还可以抑制木耳培养过程中的芽孢杆菌感染，可以用于制备木耳培养耳棒的抑菌剂。

附图说明

图1为本发明从受过污染的木耳培养耳棒中选取其中细菌进行培养，最终鉴定出受到污染的培养耳棒中存在的大多为芽孢杆菌属的细菌，其对真菌产生拮抗作用，感染前后可见显著差异。

图2为本发明鉴定出的五种细菌从被污染的木耳培养耳棒中分离出来后，构建的细菌系统进化树。被分离出来的五种细菌分别命名为（AGA-3、AGA-5、AGA-11A、AGA-11B、AGA-12）。菌株AGA-3和AGA-12与枯草芽孢杆菌（AY867792.1）和尼氏芽孢杆菌（JQ579625.1）的16S rRNA序列具有100%的同源性。菌株AGA-5与蜡样芽孢杆菌（KX890470.1）的16S rRNA序列同源性为99%，而AGA-11A和AGA-11B分别与解淀粉芽孢杆菌（KX267938.1）和枯草芽孢杆菌（DQ923483.1）的16S rRNA序列相似性为98%。

图3为本发明抗菌肽PVGBP 5对枯草芽孢杆菌最低抑制浓度（MIC）测定对照图，其中，A：抗菌肽浓度0 μg/mL；B：抗菌肽浓度25 μg /mL；C：抗菌肽浓度125mg/mL；D：抗菌肽浓度62.5 μg/mL；E：抗菌肽浓度31.25 μg/mL；F：抗菌肽浓度15.625 μg/mL。

图4为本发明抗菌肽PVGBP 5对枯草芽孢杆菌的时间杀伤测定曲线，（A）（◆）对照，（■）和（●）的生长曲线分别为1×MIC（0小时）和1×MIC（4小时）。（B） AGA-3、（◆）对照、（▲）、（■）和（●）的时间杀灭动力学分别为1/2、1、2×MIC。所用MIC为15.625μg/mL。

图5为本发明抗菌肽PVGBP 5对木耳培养棒中枯草芽孢杆菌的抑制作用。将样品分别用AGA-3、Nisin和PvGBP 5处理。（A）菌丝菌落直径，与对照组相比，枯草芽孢杆菌对菌丝生长有明显的抑制作用。（B）子实体重量，PvGBP 5处理的蘑菇产量与对照组没有区别，枯草芽孢杆菌处理组的蘑菇产量下降了48.7%（相对于对照组）。所用MIC为15.625 μg/mL。

图6为本发明抗菌肽PVGBP 5作用枯草芽孢杆菌的透射电镜观察图，其中，A：枯草芽孢杆菌的空白对照组；B：PVGBP 5处理0.5 h后的枯草芽孢杆菌；C：PVGBP 5处理2 h后的枯草芽孢杆菌。所用MIC为15.625 μg/mL。

图7为本发明抗菌肽 PVGBP 5对枯草芽孢杆菌生物膜形成的抑制作用柱状图，乳酸链球菌素（Nisin）作为阳性对照、磷酸盐缓冲液（PBS）作为阴性对照和肽PVGBP 5处理后的细菌膜情况。其中，当显著性p < 0.005时考虑。实验结果发现PvGBP 5对AGA-3具有抗生物膜活性，因为PvGBP 5在浓度大于1/4×MIC时对生物膜的形成没有影响。当用1×MIC的PvGBP 5处理AGA-3时，生物膜的形成减少了90.6%。所用MIC为15.625μg/mL。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例和附图对本发明做进一步的详细说明，但本领域技术人员了解，下述实施例不是对本发明保护范围的限制，任何在本发明基础上做出的改变和变化，都在本发明的保护范围之内。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：菌种的培养及鉴定

从黑龙江省东宁市食用菌研究开发中心获得了被细菌污染的培养耳棒。将样品培养在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）斜面中，培养10天。马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）的配方为：20%（w/v）马铃薯，2%葡萄糖，0.2% 酵母提取物，0.4%磷酸二氢钾（ KH2PO4），0.2% 七水硫酸镁（MgSO4·7H2O）和16% 琼脂（pH值5.5±0.1）。培养10天。

从污染的耳棒中分离出5种细菌（分别命名为AGA-3、AGA-5、AGA-11A、AGA-11B和AGA-12）。根据16S rRNA基因序列与NCBI基因库序列的核苷酸序列分析，其中5个分离株均呈现出相似的阈值≥98%（表1）。菌株AGA-3和AGA-12与枯草芽孢杆菌（AY867792.1）和尼氏芽孢杆菌（JQ579625.1）的16S rRNA序列具有100%的同源性。菌株AGA-5与蜡样芽孢杆菌（KX890470.1）的16S rRNA序列同源性为99%，而AGA-11A和AGA-11B分别与解淀粉芽孢杆菌（KX267938.1）和枯草芽孢杆菌（DQ923483.1）的16S rRNA序列相似性为98%。所以鉴定出的细菌大多为芽孢杆菌属，其对真菌产生拮抗作用，能产生多种拮抗化合物，包括脂肽、环肽、几丁质酶和挥发性有机物等，受污染前后的培养耳棒可看出显著差异（图1）。因此，观察到的木耳生长抑制可能是由于受到从被污染的培养耳棒中分离出的这五种芽孢杆菌的影响。

表1污染木耳培养耳棒细菌的鉴定。

实施例2：耳棒细菌的分离及鉴定

从受污染的耳棒中取渣（5g），用5ml 0.85%无菌生理盐水在无菌研钵中研磨，然后将其平铺在经抗真菌环己酰胺处理的琼脂（YESA）平板上。然后，将培养皿在37℃下孵育，并对菌落进行培养，获得纯培养物。

通过16s rDNA测序对耳棒中分离的细菌进行鉴定，用DNA提取试剂盒（中国北京基因组研究所）提取和纯化细菌基因组DNA，然后用两个通用引物27F（AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）和1492R（TACGGCTACCTTGTTACGACT）和Biometra热循环仪，通过聚合酶链反应（PCR）扩增16s rDNA序列。扩增程序在95℃下进行4分钟的初始变性，然后在94℃下进行35个周期1分钟，57℃下1分钟，72℃下90 s。最后在72℃下延伸10分钟。扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳进行分析。

PCR产物由博瑞生物技术公司（中国厦门）进行测序。DNA序列同源性在NCBIGenBank网站上进行了快速搜索(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi),利用mega7.0中的邻域连接法，利用16srdna序列构建了细菌系统进化树（图 2）。

实施例3：计算机预测来源于南美白对虾β-1,3-葡聚糖结合蛋白（β-GBP）的AMPs及预测AMPs的合成

使用两个在线软件AntiBP2和HeliQuest ，用来预测来自南美白对虾β-GBP序列中多肽的电荷和疏水性。使用 uniprot用于验证南美白对虾β-1,3-葡聚糖结合蛋白（β-GBP）中多肽的来源和功能。选择具有正电荷、疏水性大于20%的多肽进行下一步验证。

预测得到8个潜在的AMPs（表2）。其中肽PvGBP 2和PvGBP 5与大多数AMPs具有相同的特征，包括具有3到6的净正电荷，以及40%到60%的疏水性。在此基础上，进一步研究了肽PvGBP 5的抗菌活性。

使用高效液相色谱法（HPLC）纯化肽，以Agela C18柱获得99%的肽纯度。采用液相色谱-质谱联用技术（LC-MS/ESI）测定了合成肽的分子质量。

表2南美白对虾β-1,3-葡聚糖结合蛋白预测潜在抗菌肽

实施例4：肽PvGBP5的最低抑菌浓度（MIC）

5株芽孢杆菌（AGA-3、AGA-5、AGA-11A、AGA-11B和AGA-12）在37℃的营养肉汤（NB）培养基中生长，并在0.01M，pH7.2磷酸盐缓冲液（PBS）中稀释至10

最终得出结论为肽PvGBP 5对这些细菌都产生了较强的抗菌活性，PvGBP 5的MICs为31.25-125μg/mL（表3）。PvGBP 5对耐热的、孢子形成的微生物，特别是芽孢杆菌的都产生了较强的抑制作用，具有较强的抑菌作用，可以在食品防腐剂中得到广泛应用。

表3肽PvGBP5对五种芽孢杆菌的抗菌活性

实施例5：生长曲线和时间杀伤动力学

评估肽PvGBP 5的生长曲线和时间杀死动力学。首先，AGA-3在37°C下培养12小时至对数生长期（OD600=0.6-0.7），然后将PvGBP 5添加到细菌悬浮液中，使最终浓度分别对应于1/2×、1×、2×MIC。采用UV-5200分光光度计在600 nm处，每小时测量细菌数量。以磷酸盐缓冲液（PBS）缓冲液（配方：0.01M，pH7.2）为对照。

如图4A所示，在1×MIC浓度PvGBP 5的16h培养过程中，AGA-3的生长完全受到抑制。对照组在前2h有滞后期，滞后期后呈指数增长。对照组在第4小时加入PvGBP 5（1×MIC），在6h时明显抑制。1×MIC（4h）组的OD600在14h以上增加，仍明显低于对照组。在时间-杀伤曲线分析（图4B）中，随着PvGBP 5浓度的增加，细菌数量减少。PvGBP 5浓度为1×MIC时，1.5h后细菌数下降76.3%，PvGBP 5浓度为2×MIC时下降96.8%。1×MIC和2×MIC处理2.5h细菌数下降100%。

实施例6：木耳抗菌试验

菌株AGA-3在营养肉汤（NB）中37℃培养12h，在发酵过程中加入PvGBP 5（1×MIC）作为阳性对照。发酵液在室温离心10min，通过0.22μm孔径的膜过滤器得到培养滤液。接下来，培养滤液在PDA中培养并预冷至50℃。不含培养滤液的马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）平板作为阴性对照。将培养耳棒置于培养基中心，在25℃下孵育。最后的生长速率计算为7d后每个菌丝菌落的径向延伸。如图5A所示，与对照组相比，枯草芽孢杆菌对菌丝生长有明显的抑制作用，7d后下降49.4%，由于PvGBP5对枯草芽孢杆菌有抗菌作用，菌丝生长与对照组基本一致

为评价耳曲霉菌的生长，将菌株AGA-3（10

研究表明，芽孢杆菌通过产生抗真菌药物如脂肽、环肽和几丁质酶等来抑制真菌的生长，导致耳廓真菌产量下降。肽PvGBP5对芽孢杆菌有很强的抑制作用，但对丝状真菌没有影响，这与nisin类似，nisin的主要抗菌机制是吸附在细菌表面和破坏膜上。

实施例7：透射电镜分析

枯草芽孢杆菌（AGA-3）在10

用透射电镜观察了PvGBP 5处理后AGA-3细菌膜的超微结构变化。未经处理的细菌膜与正常胞质、未变形细胞一致，无细胞质渗漏（图6A）。然而，当用肽PvGBP 5处理细菌细胞（AGA-3）1小时后，细菌细胞膜开始变得薄和变得模糊，胞质中的电子密度不均匀（图6B）。PvGBP 5治疗后2h，细菌细胞膜完全空泡化和破裂（图6C）。这些观察表明，肽PvGBP 5通过改变膜结构和渗透性对AGA-3起抗菌作用。透射电子显微镜结果表明，PvGBP 5肽对细菌的细胞膜及其内部结构具有破坏作用。

实施例8：PvGBP 5对细菌细胞膜成膜作用的影响

用离心法收集AGA-3菌株，并在0.1的OD600下重新悬浮在营养肉汤中。接下来，将细菌悬浮液与等量的PVGB 5（1/8×MIC—1×MIC）混合，然后用移液管移入无菌96孔板中，然后在37°C下培养72 h。用PBS（PBS：0.01 M，pH 7.2）清洗两次，去除未附着的细胞，然后用200μL 1 mg/mL结晶紫溶液进行细胞染色。染色5分钟后，用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）清洗平板，去除结晶紫染色，然后添加200μL 250 mg/mL冰醋酸，在25°C下培养30分钟以溶解染色的生物膜。生物膜生物量通过在Synergy H1多模式酶标仪（美国BioTek）上测量600 nm处的吸光度来量化。用乳酸链球菌素（Nisin）和磷酸盐缓冲液（PBS）处理的样品分别作为阳性和阴性对照。

为评价PvGBP 5对生物膜形成的影响，以低于1×MIC的PvGBP 5或等量的乳酸链球菌素（Nisin）作为阳性对照，观察PVGB 5对AGA-3细胞膜形成的影响。由于其已知的抗生物膜活性，将其用作对照。如图7所示，发现PvGBP 5对AGA-3具有浓度依赖性的抗生物膜活性，因为PvGBP 5在浓度大于1/4×MIC时对生物膜的形成没有影响。当用1×MIC的PvGBP5处理AGA-3时，生物膜的形成减少了90.6%。生物膜代表了一种受保护的生长模式，允许细菌细胞在恶劣的环境中生存。芽孢杆菌属的细菌也具有群体聚集的运动的性性质，这似乎有助于多肽在其表面结合，导致生物膜的破裂。芽孢杆菌的抗真菌活性被认为与生物膜的形成有关。因此，肽PvGBP 5对AGA-3的抗生物膜活性表明它可以作为培养耳棒真菌培养的抗菌剂。