一种具有美白保湿活性的东方美人茶多糖

摘要

本发明公开了一种具有美白保湿活性的东方美人茶多糖。本发明中TMP的相对分子量为3.4×104Da，单糖组成按摩尔比为木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖＝13.97:55.60:1.37:11.94:17.12，提取率达到4％以上，纯度高达90％。本发明中东方美人茶多糖TMP有较强的抗氧化能力，可以有效清除DPPH自由基，体内外试验证实其具有显著酪氨酸酶抑制能力，同时有较强的吸水、保湿活性。TMP在食品和化妆品等领域具有巨大的应用前景。

说明书

一、技术领域

本发明涉及一种具有美白保湿活性的东方美人茶多糖，属于美白保湿化妆品技术相关领域。

二、背景技术

美白和保湿历来是注重护肤的女性消费者的主要诉求，当皮肤受到紫外线等环境的影响时，皮肤基底层色素细胞的酪氨酸酶被激活随后催化产生黑色素，形成肉眼可见的色斑和肤色不匀等皮肤问题。美白的方式有两种：①通过抑制黑色素合成限速酶的活性从源头上减少黑色素的生成；②促进黑色素的代谢。人体皮肤具有天然的保湿性能，在保持人体水分方面起着不可替代的作用。保湿护肤同样分为两种方式：①防止皮肤水分的蒸发流失②从外界环境中吸收水分，保持皮肤的水润。

作为礼仪之邦，中国自古以来都有客来敬茶之礼。东方出好茶，东方美人茶产自中国台湾海拔1200米左右的茶园，以气候冷凉，早晚云雾笼罩，平均日照短等得天独厚的自然环境而香气宜人口感绝佳。东方美人茶不仅可以作为一种饮品，而且含有多种对机体有益成分。

现有的保湿美白产品都是以抑制酪氨酸酶的活性为手段来抑制黑色素的生成，市场上流行的美白成分主要有果酸，熊果苷,胎盘提取液和维生素C，但它们却不是十全十美的。果酸的浓度掌握不好会发生灼伤，即使马上停用，灼伤性损害也不可能立即停止。另外，果酸具有抗原性，皮肤吸收后可以引起过敏反应。熊果苷具有高度的光敏感性，因而产品中往往要添加大量防晒剂，容易对皮肤造成负担，加快皮肤老化。而且熊果苷的使用皮肤易出现敏感反应。胎盘提取液本身不稳定，容易腐败变质，需在产品中添加大量防腐剂，会引起皮肤过敏。维生素C是一种很特别、很经典的抗氧化剂，具有还原黑色素、捕捉游离的自由基、促进胶原蛋白合成的作用，尤其是可以强化肌肤对抗日晒的伤害。但是敏感肌肤、干性皮肤不建议使用维生素C，维C过量使用会使皮肤干燥。因此，寻求一种安全有效的美白保湿产品至关重要。

闪式提取技术是一种得率高，操作简单易行，快速高效的提取技术。季铵盐沉淀法是一种操作简便，处理量大，无需其它有机试剂的多糖纯化方法。膜技术是一项新兴的用于澄清、分离、除菌和浓缩等方面的绿色和节能技术，具有操作简单、节能、无污染、可在常温下连续操作等优点，广泛用于化工、食品、生物、制药等领域。

茶多糖是一种高生物活性的天然多糖，因其具有良好的抗氧化，保湿，抑制络氨酸酶等活性并且绿色安全，已经逐渐成为化妆品研发的热点。然而目前以东方美人茶多糖为原料的美白保湿化妆品尚未有报道。

三、发明内容

本发明的目的在于提供一种具有抗氧化、吸湿保湿、抑制络氨酸酶活性等功效的东方美人茶多糖TMP和及其用途。

本发明为实现发明目的，采用如下技术方案：一种具有保湿美白活性的东方美人茶多糖，其特征在于：所述东方美人茶多糖TMP是以东方美人茶为原料，采用得率高、操作简单易行的闪式提取法提取其粗多糖，联合季铵盐沉淀法和超滤技术进行多糖纯化获得。东方美人茶多糖TMP的分子量为3.4×10

单糖组成按摩尔比为木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖

＝13.97:55.60:1.37:11.94:17.12。TMP可以有效清除DPPH自由基，抑制酪氨酸酶活性，同时具有很好的吸水、保湿活性。其具体制备方法包括以下步骤：

A.闪式提取技术:将市场购得的中国台湾东方美人茶粉碎至40～80目，按茶粉质量的10～50 倍加入无菌水，采用闪式提取法提取东方美人茶多糖，常温下提取30～40s，提取电压为 100～130V，离心分离或者抽滤，收集上清液，加热浓缩至固含量30％～40％；

B.CTAB沉淀法分离多糖:将上述收集的浓缩液与1～10％十六烷基三甲基溴化胺物 (CTAB)溶液的按1.5～2:1的比例混合，静置2～3h，离心收集沉淀物，将所得沉淀物用10％的NaCl溶液溶解；水溶解液加入3～4倍质量的无水乙醇，醇沉完全后，离心收集沉淀,将所得沉淀物用少量蒸馏水充分溶解；

C.对步骤B得到的溶液在25～35℃下通过截留分子量为1000～1500道尔顿的超滤膜脱盐，超滤驱动压力0.10～0.18MPa；然后在25～35℃下通过10万道尔顿的超滤膜进行超滤，收集滤液，-50℃冷冻干燥得到东方美人茶多糖TMP。

经苯酚-硫酸法测得东方美人茶多糖TMP的糖含量大于90％；

将所得多糖组分TMP配制成5mg/mL的溶液，用0.22μm微孔滤膜过滤，采用 HPLC-ELSD检测，东方美人茶多糖TMP的分子量为3.4×10

与已有技术相比，本发明的有益效果体现在:

本发明以东方美人茶为原料，采用得率高、操作简单易行的闪式提取法提取其粗多糖，联合季铵盐沉淀法和超滤技术进行多糖纯化获得东方美人茶多糖TMP。东方美人茶多糖 TMP的提取率为4％以上，产品纯度高达90％以上。该化合物为一种新来源、新结构的活性多糖。所述东方美人茶多糖TMP有较强的抗氧化能力，当TMP的浓度为400ug/mL时， DPPH自由基的清除率达到59.22％。TMP在体内体外试验中都能显著抑制酪氨酸酶活性，体外抑制酪氨酸酶活性的测定中当TMP的浓度为2.5mg/mL时，酪氨酸酶抑制率达到67.2％。体内抑制斑马鱼胚胎酪氨酸酶活性的测定中TMP的浓度为300ug/mL时，斑马鱼胚胎酪氨酸酶抑制率达到64.7％。同时TMP也有很好的吸湿、保湿活性，因此东方美人茶多糖TMP 市场应用前景十分广阔。

附图说明：

图1为本发明实施例3中东方美人茶多糖TMP对DPPH自由基的清除能力的测试结果；

图2为本发明实施例4中体外抑制酪氨酸酶活性的测定结果；

图3为本发明实施例5中东方美人茶多糖TMP体内抑制斑马鱼胚胎酪氨酸酶活性的测定结果；

图4为本发明实施例5中激光共焦显微镜观察染色的胚胎的荧光图像结果；

图5为本发明实施例6中东方美人茶多糖TMP在RH43％时吸湿率的测定结果；

图6为本发明实施例6中东方美人茶多糖TMP在RH81％时吸湿率的测定结果；

图7为本发明实施例6中东方美人茶多糖TMP在RH43％时保湿率的测定结果；

图8为本发明实施例6中东方美人茶多糖TMP在RH81％时保湿率的测定结果；

图9为标准单糖混合物(A)HPLC图和本发明中东方美人茶多糖TMP单糖组成(B)HPLC图，其中：1-鼠李糖(Rha)；2-木糖(Xyl)；3-阿拉伯糖(Ara)；4-甘露糖(Man)；5- 葡萄糖(Glu)；6-半乳糖(Gal)

实施例1

一种具有美白保湿活性的东方美人茶多糖TMP提取分离纯化的方法为：

(1)将东方美人茶子实体经组织粉碎机粉碎，过40目筛，收集其粉料；

(2)用80％的乙醇在80℃条件下回流2h，冷却，离心分离或抽滤，烘干粉料；

(3)称取东方美人茶粉料，放入闪式提取器中，加入20倍水，常温下提取30s。提取电压为130V，混合液离心(5500r/min，15min)，收集上清液；

(4)将步骤(3)收集的上清液与2％十六烷基三甲基溴化胺物(CTAB)溶液的按1.5:1 的比例混合，静置2h，待沉淀完全后，离心(5500r/min，15min)，收集沉淀物，将所得沉淀物用10％的NaCl溶液充分溶解；

(5)加入4倍体积的无水乙醇。醇沉完全后，离心(5500r/min，5min)，收集沉淀, 将所得沉淀物用蒸馏水充分溶解；

(6)对步骤(5)得到的溶液在25℃下通过截留分子量为1500Da的超滤膜脱盐，超滤驱动压力0.10MPa；然后在25℃下通过10万Da的超滤膜进行超滤，收集滤液，-50℃冷冻干燥得到东方美人茶多糖TMP；

实施例2

一种具有美白保湿活性的东方美人茶多糖TMP提取分离纯化的方法为：

(1)将东方美人茶子实体经组织粉碎机粉碎，过40目筛，收集其粉料；

(2)用80％的乙醇在80℃条件下回流3h，冷却，离心分离或抽滤，烘干粉料；

(3)称取东方美人茶粉料，放入闪式提取器中，加入25倍水，常温下提取40s。提取电压为100V，混合液离心(5500r/min，15min)，收集上清液；

(4)将步骤(3)收集的上清液与3％十六烷基三甲基溴化胺物(CTAB)溶液的按1.5:1 的比例混合，静置3h，待沉淀完全后，离心(5500r/min，15min)，收集沉淀物，将所得沉淀物用10％的NaCl溶液充分溶解；

(5)加入4倍体积的无水乙醇。醇沉完全后，离心(5500r/min，5min)，收集沉淀, 将所得沉淀物用蒸馏水充分溶解；

(6)对步骤(5)得到的溶液在25℃下通过截留分子量为1000Da的超滤膜脱盐，超滤驱动压力0.10MPa；然后在25℃下通过10万Da的超滤膜进行超滤，收集滤液，-50℃冷冻干燥得到东方美人茶多糖TMP；

实施例3

实施例1所得东方美人茶多糖TMP清除DPPH自由基的测定：

在试管中加入浓度为1.3×10

测试结果如图1所示，东方美人茶多糖TMP有较强的清除自由基能力，随着浓度的上升，清除率逐渐增大，在400ug/mL后趋于稳定。当TMP的浓度为400ug/mL时，DPPH 自由基的清除率达到59.22％。

实施例4

实施例1所得东方美人茶多糖TMP体外抑制酪氨酸酶活性的测定：

1、精确称取东方美人茶多糖TMP0.1g，加入20mL二甲基亚讽充分溶解，得到5mg/mL的待测样品母液，再对倍稀释到2.5、1.25、0.625、0.312和0.156mg/mL作为样品液。

2、按上述步骤配制阳性对照熊果苷液。

3、按下表实验体系设计依次向试管中加入磷酸盐缓冲液、不同梯度的样品液和酶液于37℃水浴10min，然后加入底物L-酪氨酸，立即开始计时。测定反应20min时475nm 波长下的吸光值。测定时以相应的阴性对照为参比(样品组、空白组、熊果苷对照组分别阴性对照组1

抑制率(％)＝(A-B)/A×100

其中，A为标准对照的吸光值，B为样品液(或阳性对照)的吸光值

表1.体外制酪氨酸酶活性试验体系设计表，

测试结果如图2所示，东方美人茶多糖TMP在体外能够有效抑制酪氨酸酶活性，随着浓度的上升，酪氨酸酶抑制率逐渐增大，当TMP的浓度为2.5mg/mL时，酪氨酸酶抑制率达到67.2％。

实施例5

实施例1所得东方美人茶多糖TMP体内抑制斑马鱼胚胎酪氨酸酶活性的测定：

收集6-7hpf斑马鱼胚胎于置于24孔板中加入不同浓度的TMP多糖(75、150和300 μg/mL)培养，以曲酸(300μg/mL)为阳性对照组，培养至48hpf时更换成新鲜培养基，继续培养24hpf，随后取出胚胎，使用激光共焦显微镜(FV1000；Olympus,Japan)观察染色的胚胎的荧光图像。然后将胚胎置于组织匀浆器中，使用组织蛋白提取试剂盒反复提取后离心5426g，20min，小心吸取上清，用BCA蛋白试剂盒测出各组蛋白含量，并用磷酸盐缓冲配成一致浓度，每组吸取100μL总蛋白置于96孔板中，加入100μL5mmol/LL- 酪氨酸溶液(磷酸盐缓冲液，pH6.8)作为底物，恒温箱中28℃静置反应30min，475nm 下测定吸光值，每一浓度设个3复孔，取平均值。空白对照组包含100μL缓冲液及100μL L-酪氨酸溶液，酪氨酸酶活性抑制率计算如下：

酪氨酸酶活性抑制率＝(1－A1/A0)×100％

其中，A1表示为样品吸光值，A0表示为空白对照组吸光值。

测试结果如图3，4所示，东方美人茶多糖TMP在体内能够有效抑制斑马鱼胚胎酪氨酸酶活性，随着浓度的上升，酪氨酸酶抑制率逐渐增大，当TMP的浓度为300ug/mL时，斑马鱼胚胎酪氨酸酶抑制率达到64.7％。图4可以更直观地看出这一趋势。

实施例6

实施例1所得东方美人茶多糖TMP吸湿保湿性能的测定：

将饱和氯化钙溶液和饱和氯化铵溶液于室温下置于干燥器中预饱和12h，分别形成相对湿度43％、81％的环境。精密称取东方美人茶多糖TMP、海藻酸钠各2g于培养皿中，平行制备3份样品，置于以上不同湿度的干燥器内，于1、3、6、9、12、18、24、36、48h取出称定质量，计算吸湿率。

吸湿率＝[(Wn－W

其中，W

将饱和氯化钙溶液于室温下置于干燥器中预饱和12h，形成相对湿度43％、81％的环境。精密称取东方美人茶多糖TMP、海藻酸钠各2g，分别配成1％的溶液，平行制备3 份样品，放置于湿度分别为81％和43％的干燥器中，控制温度为20℃。于1、3、6、9、 12、18、24、36、48h取出称定质量，计算保湿率。

保湿率＝Hn/H

其中，H

测试结果如图5-8所示，东方美人茶多糖TMP具有很好的吸湿保湿活性。从图5可以看出随着时间的推移，东方美人茶多糖TMP在RH43％的吸湿率逐渐增大,在36h后趋于平缓。从图6可以看出随着时间的推移，东方美人茶多糖TMP在RH81％的吸湿率逐渐增大, 在48h时，吸湿率达到40.1％。从图7可以看出随着时间的推移，东方美人茶多糖TMP 在RH34％的吸湿率虽然逐渐降低,但即使在48h时，其保湿率也维持在73.1％。从图8可以看出随着时间的推移，东方美人茶多糖TMP在RH81％的吸湿率虽然逐渐降低,但即使在 48h时，其保湿率也维持93.67％。