一种细胞来源的外泌体在制备治疗哮喘和/或肺纤维化生物制剂中的应用

摘要

本发明公开了一种细胞来源的外泌体在制备治疗哮喘和/或肺纤维化生物制剂中的应用。所述生物制剂的剂型包括气雾剂、喷雾剂、口服制剂或注射用剂，所述的外泌体也可用于药物装载、表面修饰或赋形。本发明已进行体外细胞实验，体外细胞实验表明，本发明提取纯化的脐带间充质干细胞外泌体能够修复受损伤的肺上皮细胞，也能够抑制肺上皮细胞分泌炎症因子，同时也能够抑制肺成纤维细胞的增殖，因此，该外泌体具有治疗哮喘和/或肺纤维化的潜力，能在制备治疗哮喘和/或肺纤维化生物制剂中应用。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种细胞来源的外泌体在制备治疗哮喘和/或肺纤维化生物制剂中的应用。

背景技术

人类的肺面积为35-100平方米，负责吸入氧气，排出二氧化碳。在正常的呼吸过程中，肺表面将暴露于微生物、空气污染、职业化学物质和灰尘中。所有这些都构成了急性和慢性肺部疾病的危险因素。世卫组织最近的一份报告证明，世界各国有数亿各年龄层的人患有慢性呼吸道疾病，并将肺部疾病列为全球第三大死因，仅次于心血管疾病和癌症。

哮喘(Aasthma)是一种以慢性气道炎症和气道高反应性为特征的异质性疾病。主要特征包括气道慢性炎症，气道对多种刺激因素呈现的高反应性，多变的可逆性气流受限，以及随病程延长而导致一系列气道结构的改变，即气道重构。临床表现为反复发作的喘息、气急、胸闷或咳嗽等症状，常在夜间及凌晨发作或加重，多数病人可自行缓解或经治疗后缓解。哮喘的典型症状为发作性伴有哮呜音的呼气性呼吸困难，可伴有气促、胸闷或咳嗽，症状可在数分钟内发作，并持续数小时至数天，可经平喘药物治疗后缓解或自行缓解，夜间及凌晨发作或加重是哮喘的重要临床特征。

肺纤维化(PμLmonary Fibrosis，RF)是一种慢性、进行性和破坏性的间质性肺病，属于纤维增殖性疾病范畴。主要的病理特征是成纤维细胞的增殖，大量的细胞外基质聚集，并伴炎症损伤、组织结构破坏为特征的一大类肺疾病终末期改变，也就是正常的肺泡组织被损坏后，经过异常修复导致的结构异常。当肺纤维化进展时，在静息时也发生呼吸困难，严重的肺纤维化患者可出现进行性呼吸困难。其他症状有干咳、乏力。发病早期虽有呼吸困难，但X线胸片可能基本正常，中后期出现两肺中下野弥散性网状或结节状阴影，偶见胸膜腔积液，增厚或钙化。肺组织纤维化的严重后果，导致正常肺组织结构改变，功能丧失。大量没有气体交换功能的纤维化组织代替肺泡，导致氧不能进入血液。患者呼吸不畅，缺氧、酸中毒、丧失劳动力、靠呼吸机生存，最后衰竭、死亡。

目前，可以用于治疗哮喘和/或肺纤维化的生物制剂非常有限。临床上，常用糖皮质激素、免疫抑制剂、细胞毒性生物制剂和抗凝剂治疗。虽然这些生物制剂可以延缓肺功能下降速度，但他们不能够逆转病情进展，而且这些药物或者生物制剂对人体还有很多的副作用，比如对胃肠道的刺激，可出现恶心，消化不良等症，皮肤过敏等皮肤疾病，以及对肝功能的损害等。肺移植是治疗肺纤维化相对有效的手段，但健康肺供体来源有限，制约了其广泛应用，而且在移植后还要克服免疫排斥，其中位生存期低于5年。

目前，大量的临床前实验显示，骨髓间质干细胞(MSCs)能够有效改善肺纤维化疾病，其有多种药理作用，包括抗炎、免疫调节、再生、促血管生成和抗纤维化等特性，因此，干细胞提供了一种新型的肺纤维化治疗方法。目前普遍认为干细胞的功效主要有三个作用机制，(1)归巢能力，即细胞通过趋化因子、细胞表面受体、整合素或选择素介导的化学吸引，选择性地迁移到损伤组织；(2)分化为新的不同类型的细胞以取代受损细胞；(3)通过旁分泌作用分泌能够调节细胞反应的物质。但是，目前许多研究表明，注射体内的干细胞的有效移植和分化数量很低，这表明干细胞最有可能是通过旁分泌机制发挥作用的，所以越来越多的研究人员把注意力集中在干细胞的分泌组上，比如细胞因子、趋化因子和生长因子等可溶性因子和细胞微囊泡及外泌体，其中外泌体为近些年研究者专注的热点。

外泌体是有活细胞分泌的磷脂双分子层结构的小囊泡，直径在30-150nm，密度在1.13-1.19g/mL，可存在于各种体液中，如血清、血浆、唾液、尿液，腹水、脊髓液、乳汁等。外泌体中含有多种生物分子，如mRNA、miRNA、蛋白质、脂质等，可以传递给受体细胞，从而改变受体细胞的生理功能或病理功能。近几年，外泌体作为细胞间的信息传递工具及各种疾病的生物标志物而引起广泛的关注，外泌体具有在生物医药及疾病诊断领域的应用开发潜力。

发明内容

为此，本发明提供一种细胞来源的外泌体在制备治疗哮喘和/或肺纤维化生物制剂中的应用。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

根据本发明的一方面提供的一种细胞来源的外泌体在制备治疗哮喘和/或肺纤维化生物制剂中的应用。

进一步的，所述生物制剂的剂型包括气雾剂、喷雾剂、口服制剂或注射用剂。

进一步的，所述的外泌体能用于药物装载、表面修饰或赋形。

本发明的另一方面提供的一种用于制备治疗哮喘和/或肺纤维化生物制剂的细胞来源的外泌体，所述外泌体的提取方法包括超速离心法、密度梯度离心法、超滤法、聚合物沉淀法、切向流过滤法、免疫捕获法、亲和色谱法、微流控法或分子排阻法。

进一步的，所述外泌体具有促进肺上皮细胞修复的作用。

进一步的，所述的外泌体可以抑制LPS诱导肺上皮细胞产生的炎症因子。

进一步的，所述外泌体能通过调节凋亡蛋白的表达来抑制人胚肺成纤维细胞的增殖。

进一步的，所述细胞来源有植物、微生物、动物及人，包括体液、组织液、体细胞、干细胞及经干细胞诱导分化的细胞。

进一步的，所述的外泌体具有治疗哮喘和/或肺纤维化的潜力，能在制备治疗哮喘和/或肺纤维化生物制剂中应用。

本发明具有如下优点：

本发明的外泌体，可通过气雾剂、喷雾剂、口服制剂、注射制剂等多种方式进行治疗肺纤维化疾病，又可通过药物装载、表面修饰或赋形等方法制备成生物制剂，这样能够在治疗哮喘和/或肺纤维化过程中，大大降低生物制剂毒副作用，避免传统生物制剂对胃肠道的刺激、皮肤过敏以及对肝功能的损害等问题。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。

本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。

图1为本发明图1为本发明提供的双重切向流过滤体系的结构图，1为第一储存罐，2为第一蠕动泵，3为第一过滤装置，4为第二储存罐，5为第二过滤装置，6为第二蠕动泵；

图2为本发明提供的脐带间充质干细胞显微镜观察图；

图3为本发明提供的脐带间充质干细胞特异蛋白CD34的流式检测结果图；

图4为本发明提供的脐带间充质干细胞特异蛋白CD45的流式检测结果图；

图5为本发明提供的脐带间充质干细胞特异蛋白CD73的流式检测结果图；

图6为本发明提供的脐带间充质干细胞特异蛋白CD90的流式检测结果图；

图7为本发明提供的脐带间充质干细胞特异蛋白CD105的流式检测结果图；

图8为本发明提供的双重TFF提纯后的外泌体的电镜图；

图9为本发明提供的双重TFF提纯后的外泌体的纳米粒径图；

图10为本发明提供的Western Blot鉴定双重TFF提纯后的外泌体的CD9蛋白结果图；

图11为本发明提供的Western Blot鉴定双重TFF提纯后的外泌体的CD63蛋白结果图；

图12为本发明提供的Western Blot鉴定双重TFF提纯后的外泌体的ALIX蛋白结果图；

图13为本发明提供的不同外泌体浓度对肺上皮细胞增殖能力的影响结果图；

图14为本发明提供的LPS诱导肺上皮细胞产生的炎症因子IL-6含量结果图；

图15为本发明提供的LPS诱导肺上皮细胞产生的炎症因子IL-8含量结果图；

图16为本发明提供的LPS诱导肺上皮细胞产生的炎症因子TNF-α含量结果图；

图17为本发明提供的不同外泌体浓度对人胚肺成纤维细胞增殖能力的影响结果图；

图18为本发明提供的WB法检测的人胚肺成纤维细胞株中凋亡蛋白Bcl-2、Bax结果图，其中A为PBS缓冲液对照图，B为加入双重TFF法提取的外泌体结果图，C为加入超速离心法提取的外泌体结果图。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1干细胞的制备及培养

1.脐带间充质干细胞的提取制备

从手术室采集新生儿脐带，用PBS缓冲液将脐带冲洗干净，用剪刀镊子剔去血管，剥出里面的华氏胶组织，将组织充分剪碎至1mm

2.脐带间充质干细胞的鉴定

获得原代干细胞P

3.脐带间充质干细胞的培养

将脐带间充质干细胞置于干细胞培养基中培养，培养条件：含5％CO

4.脐带间充质干细胞培养上清液预处理

将细胞培养上清液加入离心管中，5000-12000g离心5-50min，再用0.22-0.45μm滤膜过滤除菌，放置4℃备用。

实施例2外泌体的提取纯化、鉴定

1.双重切向流过滤法提取外泌体

(1)向第一储存罐1和第二储存罐4中加入无菌水，分别打开蠕动泵(第一蠕动泵2和第二蠕动泵6)，冲洗系统；

(2)向第一储存罐1中加入4L预处理的样本溶液，打开第一蠕动泵2使系统循环，预处理的样本溶液经设有切向流过滤膜F-1的第一过滤装置3浓缩过滤，使含有外泌体的溶液进入第二储存罐4中；待第一储存罐1中的液体体积为最小运行体积时，加入2L无菌的PBS缓冲液继续浓缩过滤至最小运行体积；

(3)待第二储存罐4中的液体体积超过400mL时，打开第二蠕动泵6使系统循环，含有外泌体的溶液经设有切向流过滤膜F-2的第二过滤装置5，浓缩过滤，去除了小分子物质；

(4)待第二储存罐4中的液体体积为最小运行体积时，向第二储存罐4中加入2000mL的PBS缓冲液，继续浓缩过滤至第二储存罐4中溶液为200mL，收集该溶液，即得到双重切向流过滤体系提取纯化的外泌体。

2.超速离心法提取外泌体

将预处理后样本加至超速离心管中，4℃条件下100000g离心2h，用1mL的洗脱液进行重悬，即得到超速离心分离纯化的外泌体。

3.外泌体的鉴定

收集后的外泌体，通过电镜，如图8所示；纳米粒径示踪分析仪，如图9所示；特异性的蛋白CD9，如图10所示；特异性的蛋白CD63如图11所示；特异性的蛋白ALIX，如图12所示，对外泌体进行鉴定。

实施例3细胞功能实验

1.肺上皮细胞修复作用

将人正常肺上皮细胞(BEAS-2B)制成细胞悬液，以5×10

实验结果图13可见，相比于对照组，利用双重TFF法和超速离心法提取纯化的外泌体均能显著的促进人正常肺上皮细胞(BEAS-2B)增殖，随着外泌体浓度的增加，其活性越好，外泌体的最佳浓度为8×10

2.肺上皮细胞炎症因子的抑制作用

将人正常肺上皮细胞(BEAS-2B)制成细胞悬液，以5×10

如图14、15、16所示，脐带间充质干细胞外泌体能够抑制LPS诱导肺上皮细胞(BEAS-2B)分泌的炎症因子IL-6、IL-8及TNF-α，而且随着外泌体浓度的增加，其抑制炎症因子的活性越好，外泌体的最佳浓度为8×10

3.人胚肺成纤维细胞抑制作用

取人胚肺成纤维细胞株(MRC-5)，消化重悬后制成密度为5×10

实验结果图17可见，脐带间充质干细胞外泌体能显著抑制人胚肺成纤维细胞(MRC-5)的增殖，且具有明显的剂量依赖效应，其中最佳外泌体浓度为8.0×10

4.人胚肺成纤维细胞(MRC-5)中凋亡蛋白Bcl-2、Bax表达

蛋白Bcl-2、Bax是调控MRC-5细胞凋亡最重要的细胞因子，Bcl-2能够抑制MRC-5细胞凋亡，Bax则促进MRC-5细胞凋亡。

取人胚肺成纤维细胞株(MRC-5)，消化重悬后制成密度为5×10

实验结果图18可见，脐带间充质干细胞外泌体对人胚肺成纤维细胞(MRC-5)中凋亡蛋白Bcl-2、Bax表达的有较为显著的影响。可以发现两种方法提取的外泌体均能显著下调Bcl-2蛋白表达，并且上调Bax蛋白表达，由图可见，双重TFF法提取的外泌体对Bcl-2、Bax蛋白表达水平的影响略强于超速离心法，此结论与上述外泌体生物活性的实验结果相符。

本发明的外泌体，可通过气雾剂、喷雾剂、口服制剂、注射制剂等多种方式进行治疗肺纤维化疾病，又可通过药物装载、表面修饰或赋形等方式制备成生物制剂，这样能够在治疗哮喘和/或肺纤维化过程中，大大降低生物制剂毒副作用，避免传统生物制剂对胃肠道的刺激、皮肤过敏以及对肝功能的损害等问题。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。