一种免疫组化抗原修复缓冲液及其使用方法

摘要

本发明涉及兽药药品制备技术领域，具体为一种免疫组化抗原修复缓冲液及其使用方法；每升抗原修复缓冲液中含有1.35～1.62gTris‑Base、0.45～0.55g反式‑2‑甲基‑2‑丁烯二酸、0.8～1.2g甘露糖赤藓糖醇、0.16～0.20g胰蛋白酶、0.20～0.25g芦荟提取物、0.12～0.16g保水剂、0.08～0.12g双乙酸钠、0.4～0.6g表面活性剂及余量的蒸馏水；本发明提供的抗原修复缓冲液不仅能最大程度地恢复在制片等过程中损失的抗原性，从而为后续的抗体染色提供很好的基础；还能有效地防止了其过度挥发而导致组织切片发生干化的现象，以保证对被破坏的抗原进行顺利地修复；另外，其还能有效去除醛类固定试剂导致的蛋白之间的交联，充分暴露石蜡切片等样品中的抗原表位，从而大大改善免疫染色效果。

说明书

技术领域

本发明涉及抗原修复缓冲液技术领域，具体为一种免疫组化抗原修复缓冲液及其使用方法。

背景技术

免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。免疫组化技术近年来得到迅速发展。

随着全自动免疫组化染色仪的应用推广，对于染色质量的要求也日益提高。其中，抗原修复在整个免疫组化染色过程中有着极其重要的作用，修复条件的好坏直接决定着最终染色结果的质量。全自动染色仪因为其自身的结构特点，其用于盛放修复液的容器体积较小，不能像手工修复那样把组织切片完全浸泡在修复液中的条件，并且全自动免疫组化染色仪在抗原修复时需要在较高的温度（100℃左右）下进行，因此修复液容易挥发，进一步减少了修复液的体积，使得其修复效果相对较差。而且也严重影响了后续免疫染色的效果。

发明内容

本发明的目的在于提供一种免疫组化抗原修复缓冲液及其使用方法，本发明提供的抗原修复缓冲液不仅能最大程度地恢复在制片等过程中损失的抗原性，从而为后续的抗体染色提供很好的基础；还能有效地防止了其过度挥发而导致组织切片发生干化的现象，以保证对被破坏的抗原进行顺利地修复；另外，其还能有效去除醛类固定试剂导致的蛋白之间的交联，充分暴露石蜡切片等样品中的抗原表位，从而大大改善免疫染色效果。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种免疫组化抗原修复缓冲液，每升抗原修复缓冲液中含有1.35～1.62gTris-Base、0.45～0.55g反式-2-甲基-2-丁烯二酸、0.8～1.2g甘露糖赤藓糖醇、0.16～0.20g胰蛋白酶、0.20～0.25g芦荟提取物、0.12～0.16g保水剂、0.08～0.12g双乙酸钠、0.4～0.6g表面活性剂及余量的蒸馏水。

更进一步地，所述芦荟提取物的制备方法包括以下步骤：

Ⅰ、将芦荟清洗干净，再依次经晾干、去皮、杀青、烘干、粉碎及过筛处理，将所得的芦荟干粉在40～100℃条件下加水提取2～4h，待提取结束后将所得浸提液经高速离心机离心处理10～20min，所得上清液再经滤布过滤处理；

Ⅱ、将步骤Ⅰ中所得的滤液浓缩至原体积的1/6～1/3，然后将所得浓缩液转至体积为其8～10倍的乙醇中，在2～5℃的条件下静置沉析6～10h，再经高速离心机离心沉淀5～10min；收集沉淀物，保存，备用；

Ⅲ、将所得的沉淀物置于冷冻干燥机中，进行冷冻干燥6～8h，使其水分含量≤0.5％，最终所得即为芦荟提取物。

更进一步地，所述步骤Ⅰ中水与芦荟干粉的质量比为20～30：1。

更进一步地，所述步骤Ⅰ中所用滤布的规格为180～250目。

更进一步地，所述步骤Ⅲ中冷冻干燥机的冷冻温度为-40～-20℃，冷冻压力为0.03～0.06mbar，冷冻时间为38～45h。

更进一步地，所述保水剂的制备方法为：

按照质量比2～4:1准确称取适量的羟丙二酸及山梨醇，将两者加入质量为羟丙二酸20～30倍、温度为40～55℃的石油醚中，然后向其中加入质量为山梨醇3～5倍的乳化剂；边搅拌边向所得的混合组分中缓慢滴加适量的蒸馏水；待滴加完毕后，将所得的混合物置于超声波清洗器中进行间歇震荡8～10min，每次震荡的时间为20～30s，两次震荡间隔时间为10～20s，待震荡完毕后静置保存，即得保水剂成品。

更进一步地，所述乳化剂选用Span80、Tween80中的任意一种。

更进一步地，所述蒸馏水的用量为石油醚的1.0～1.5倍。

更进一步地，所述表面活性剂选用二辛基琥珀酸磺酸钠、十二烷基苯磺酸钠中的任意一种。

一种免疫组化抗原修复缓冲液的使用方法，包括以下步骤：

S1、将组织切片取出，用铅笔在切片的磨砂面做好检测对应标记；然后将切片放入塑料染色架中置于电热恒温干燥箱，在50～60℃的条件下烤片50～70min；

S2、将组织切片置于二甲苯内浸泡5～8min；甩去多余液体再将组织切片置于无水乙醇中浸泡，再由自来水冲洗30～40s；

S3、将上述处理后的切片置于装有免疫组化抗原修复缓冲液中，然后将之转入微波炉内，并对切片进行微波辐射处理10～15min；待将辐射完毕后，将切片自然冷却至室温后将其取出并清洗，最后按照选好的免疫组织化学的染色方法进行染色。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明通过以Tris-Base、反式-2-甲基-2-丁烯二酸、甘露糖赤藓糖醇、胰蛋白酶、芦荟提取物、保水剂、双乙酸钠及表面活性剂等物质作为制备抗原修复缓冲液的原料；其中，胰蛋白酶的使用能使得被掩盖的抗原决定簇或变形的抗原重新暴露或抗原性得到一定程度的恢复，使得抗体能更好地渗透并与表位结合。抗原修复能最大程度地恢复在制片等过程中损失的抗原性，从而为后续的抗体染色提供很好的基础。另外，甘露糖赤藓糖醇、芦荟提取物、双乙酸钠及保水剂中羟丙二酸及山梨醇之间的配合使用，能有效地防止了其过度挥发而导致组织切片发生干化的现象，以保证对被破坏的抗原进行顺利地修复。另外，本发明所提供的抗原修复缓冲液能有效去除醛类固定试剂导致的蛋白之间的交联，充分暴露石蜡切片等样品中的抗原表位，从而大大改善免疫染色效果。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种免疫组化抗原修复缓冲液，每升抗原修复缓冲液中含有1.35gTris-Base、0.45g反式-2-甲基-2-丁烯二酸、0.8g甘露糖赤藓糖醇、0.16g胰蛋白酶、0.20g芦荟提取物、0.12g保水剂、0.08g双乙酸钠、0.4g表面活性剂及余量的蒸馏水。

芦荟提取物的制备方法包括以下步骤：

Ⅰ、将芦荟清洗干净，再依次经晾干、去皮、杀青、烘干、粉碎及过筛处理，将所得的芦荟干粉在40℃条件下加水提取2h，待提取结束后将所得浸提液经高速离心机离心处理10min，所得上清液再经滤布过滤处理；

Ⅱ、将步骤Ⅰ中所得的滤液浓缩至原体积的1/6，然后将所得浓缩液转至体积为其8倍的乙醇中，在2℃的条件下静置沉析6h，再经高速离心机离心沉淀5min；收集沉淀物，保存，备用；

Ⅲ、将所得的沉淀物置于冷冻干燥机中，进行冷冻干燥6h，使其水分含量0.5％，最终所得即为芦荟提取物。

步骤Ⅰ中水与芦荟干粉的质量比为20：1。

步骤Ⅰ中所用滤布的规格为180目。

步骤Ⅲ中冷冻干燥机的冷冻温度为-40℃，冷冻压力为0.03mbar，冷冻时间为38h。

保水剂的制备方法为：

按照质量比2:1准确称取适量的羟丙二酸及山梨醇，将两者加入质量为羟丙二酸20倍、温度为40℃的石油醚中，然后向其中加入质量为山梨醇3倍的乳化剂；边搅拌边向所得的混合组分中缓慢滴加适量的蒸馏水；待滴加完毕后，将所得的混合物置于超声波清洗器中进行间歇震荡8min，每次震荡的时间为20s，两次震荡间隔时间为10s，待震荡完毕后静置保存，即得保水剂成品。

乳化剂选用Span80。

蒸馏水的用量与石油醚相同。

表面活性剂选用二辛基琥珀酸磺酸钠。

一种免疫组化抗原修复缓冲液的使用方法，包括以下步骤：

S1、将组织切片取出，用铅笔在切片的磨砂面做好检测对应标记；然后将切片放入塑料染色架中置于电热恒温干燥箱，在50℃的条件下烤片50min；

S2、将组织切片置于二甲苯内浸泡5min；甩去多余液体再将组织切片置于无水乙醇中浸泡，再由自来水冲洗30s；

S3、将上述处理后的切片置于装有免疫组化抗原修复缓冲液中，然后将之转入微波炉内，并对切片进行微波辐射处理10min；待将辐射完毕后，将切片自然冷却至室温后将其取出并清洗，最后按照选好的免疫组织化学的染色方法进行染色。

实施例2

一种免疫组化抗原修复缓冲液，每升抗原修复缓冲液中含有1.5gTris-Base、0.5g反式-2-甲基-2-丁烯二酸、1.0g甘露糖赤藓糖醇、0.18g胰蛋白酶、0.22g芦荟提取物、0.14g保水剂、0.10g双乙酸钠、0.5g表面活性剂及余量的蒸馏水。

芦荟提取物的制备方法包括以下步骤：

Ⅰ、将芦荟清洗干净，再依次经晾干、去皮、杀青、烘干、粉碎及过筛处理，将所得的芦荟干粉在70℃条件下加水提取3h，待提取结束后将所得浸提液经高速离心机离心处理15min，所得上清液再经滤布过滤处理；

Ⅱ、将步骤Ⅰ中所得的滤液浓缩至原体积的1/4，然后将所得浓缩液转至体积为其9倍的乙醇中，在3℃的条件下静置沉析8h，再经高速离心机离心沉淀8min；收集沉淀物，保存，备用；

Ⅲ、将所得的沉淀物置于冷冻干燥机中，进行冷冻干燥7h，使其水分含量0.4％，最终所得即为芦荟提取物。

步骤Ⅰ中水与芦荟干粉的质量比为25：1。

步骤Ⅰ中所用滤布的规格为200目。

步骤Ⅲ中冷冻干燥机的冷冻温度为-30℃，冷冻压力为0.04mbar，冷冻时间为40h。

保水剂的制备方法为：

按照质量比3:1准确称取适量的羟丙二酸及山梨醇，将两者加入质量为羟丙二酸25倍、温度为50℃的石油醚中，然后向其中加入质量为山梨醇4倍的乳化剂；边搅拌边向所得的混合组分中缓慢滴加适量的蒸馏水；待滴加完毕后，将所得的混合物置于超声波清洗器中进行间歇震荡9min，每次震荡的时间为25s，两次震荡间隔时间为15s，待震荡完毕后静置保存，即得保水剂成品。

乳化剂选用Tween80。

蒸馏水的用量为石油醚的1.2倍。

表面活性剂选用十二烷基苯磺酸钠。

一种免疫组化抗原修复缓冲液的使用方法，包括以下步骤：

S1、将组织切片取出，用铅笔在切片的磨砂面做好检测对应标记；然后将切片放入塑料染色架中置于电热恒温干燥箱，在55℃的条件下烤片60min；

S2、将组织切片置于二甲苯内浸泡6min；甩去多余液体再将组织切片置于无水乙醇中浸泡，再由自来水冲洗35s；

S3、将上述处理后的切片置于装有免疫组化抗原修复缓冲液中，然后将之转入微波炉内，并对切片进行微波辐射处理12min；待将辐射完毕后，将切片自然冷却至室温后将其取出并清洗，最后按照选好的免疫组织化学的染色方法进行染色。

实施例3

一种免疫组化抗原修复缓冲液，每升抗原修复缓冲液中含有1.62gTris-Base、0.55g反式-2-甲基-2-丁烯二酸、1.2g甘露糖赤藓糖醇、0.20g胰蛋白酶、0.25g芦荟提取物、0.16g保水剂、0.12g双乙酸钠、0.6g表面活性剂及余量的蒸馏水。

芦荟提取物的制备方法包括以下步骤：

Ⅰ、将芦荟清洗干净，再依次经晾干、去皮、杀青、烘干、粉碎及过筛处理，将所得的芦荟干粉在100℃条件下加水提取4h，待提取结束后将所得浸提液经高速离心机离心处理20min，所得上清液再经滤布过滤处理；

Ⅱ、将步骤Ⅰ中所得的滤液浓缩至原体积的1/3，然后将所得浓缩液转至体积为其10倍的乙醇中，在5℃的条件下静置沉析10h，再经高速离心机离心沉淀10min；收集沉淀物，保存，备用；

Ⅲ、将所得的沉淀物置于冷冻干燥机中，进行冷冻干燥8h，使其水分含量0.3％，最终所得即为芦荟提取物。

步骤Ⅰ中水与芦荟干粉的质量比为30：1。

步骤Ⅰ中所用滤布的规格为250目。

步骤Ⅲ中冷冻干燥机的冷冻温度为-20℃，冷冻压力为0.06mbar，冷冻时间为45h。

保水剂的制备方法为：

按照质量比4:1准确称取适量的羟丙二酸及山梨醇，将两者加入质量为羟丙二酸30倍、温度为55℃的石油醚中，然后向其中加入质量为山梨醇5倍的乳化剂；边搅拌边向所得的混合组分中缓慢滴加适量的蒸馏水；待滴加完毕后，将所得的混合物置于超声波清洗器中进行间歇震荡10min，每次震荡的时间为30s，两次震荡间隔时间为20s，待震荡完毕后静置保存，即得保水剂成品。

乳化剂选用Span80。

蒸馏水的用量为石油醚的1.5倍。

表面活性剂选用二辛基琥珀酸磺酸钠。

一种免疫组化抗原修复缓冲液的使用方法，包括以下步骤：

S1、将组织切片取出，用铅笔在切片的磨砂面做好检测对应标记；然后将切片放入塑料染色架中置于电热恒温干燥箱，在60℃的条件下烤片70min；

S2、将组织切片置于二甲苯内浸泡8min；甩去多余液体再将组织切片置于无水乙醇中浸泡，再由自来水冲洗40s；

S3、将上述处理后的切片置于装有免疫组化抗原修复缓冲液中，然后将之转入微波炉内，并对切片进行微波辐射处理15min；待将辐射完毕后，将切片自然冷却至室温后将其取出并清洗，最后按照选好的免疫组织化学的染色方法进行染色。

效果测试：

分别对EDTA缓冲液1mM pH6.0、Tris-HCl缓冲液0.05M pH10.0及本发明实施例1、实施例2及实施例3制备的抗原修复缓冲液进行效果测定，所得数据记录于表1及表2：

表 1

注：表中-表示阴性；+表示弱阳性；+ +表示中等阳性；+ + +表示强阳性。

表 2

注：表中-表示阴性；+表示弱阳性；+ +表示中等阳性；+ + +表示强阳性。

由表1及表2中的相关数据可知，相比较于现有的抗原修复缓冲液（如EDTA缓冲液、Tris-HCl缓冲液），本发明提供的抗原修复缓冲液不仅能最大程度地恢复在制片等过程中损失的抗原性，从而为后续的抗体染色提供很好的基础；还能有效地防止了其过度挥发而导致组织切片发生干化的现象，以保证对被破坏的抗原进行顺利地修复；另外，其还能有效去除醛类固定试剂导致的蛋白之间的交联，充分暴露石蜡切片等样品中的抗原表位，从而大大改善免疫染色效果。另外，综合表格中的对比的结果可知，本发明优选的柠康酐溶液的浓度为0.10～0.50%，即0.10～0.50g/L；优选的pH值为7.2。由此表明本发明制作的膨胀剂具有更广阔的市场前景，更适宜推广。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。