改进TSH检测结果一致性的定标方法、TSH候选标准物质及其制备方法

摘要

本发明公开了一种改进TSH检测结果一致性的定标方法、TSH候选标准物质及其制备方法。改进TSH检测结果一致性的TSH候选标准物质的制备方法为：收集不同个体的离体血清，混合后得到11种不同TSH浓度的血清溶液，对所述11种不同TSH浓度的血清溶液中TSH浓度进行定值，得到11种浓度的TSH候选标准物质。对于不同的厂商，利用该候选标准物质配制与其原厂校准品浓度等同的TSH专用校准品替代原厂校准品，比较采用TSH专用校准品前后，发现个体血清TSH检测结果的一致性大大提高了。本发明的改进TSH检测结果一致性的定标方法适用于临床常规的TSH检测试剂的校准，能提高不同厂商TSH检测结果的一致性和可比性。

说明书

技术领域

本发明涉及临床检测技术领域，具体来说，涉及改进TSH检测结果一致性的定标方法、TSH候选标准物质及其制备方法。

背景技术

促甲状腺激素(Thyroid Stimulating Hormone,TSH)是腺垂体嗜碱性细胞分泌的一种糖蛋白类激素，由211个氨基酸组成，其分子结构由非共价的α、β亚基异二聚体组成，其中该激素发挥生物和免疫功能特异性的是β亚基，α亚基与黄体生成素(LH)、促卵泡激素(FSH)及人绒毛膜促性腺激素(HCG)的α亚基基本相同。TSH能促进T3(三碘甲腺原氨酸)及T4(甲状腺素)的分泌，同时又受T3及T4的负反馈，是判断甲状腺功能最敏感的指标，在甲状腺疾病治疗过程中，应密切监测该指标的水平。

目前TSH的免疫分析主要为放射免疫分析法(Radioimmunoassay,RIA)，免疫放射分析法(immunoradiometric assay,IRMA)，化学发光免疫分析法(ChemiluminescenceImmunoassay,CLIA)，电化学发光免疫分析法(Electrochemiluminescence Immunoassay,ECLIA)，时间分辨荧光免疫分析法(Time-resolved Fluoroimmunoassay,TrFIA)和化学发光酶免疫分析法(Chemiluminescence Enzyme Immunoassay,CLEIA)等。TSH各厂商检测结果差异较大，有些低浓度的TSH检测值，贝克曼Access 2高于西门子Immulite 2000约20倍。最近有研究表明，TSH在正常浓度时，方法间差异较小，而在异常浓度时差异较大。国内马东红等人对6种TSH检测方法对比研究发现方法间存在不同程度的差异，并且发现放免法和免疫放射法与自动化检测系统的相关性差(r为0.38-0.41)。

实现检验结果一致性的重要途径是检测方法的标准化，1993年国际临床化学联合会(IFCC)，欧洲共同体标准物质局(BCR)和美国病理学家协会(CAP)联合发布了血清基质的血清蛋白质有证参考物质CRM 470，研究表明使用该标准物质为校准品赋值，使得各个实验室之间的室间测量结果差异明显变小。但是对于TSH这一类采用化学发光原理的检验项目尚没有使检测系统间检测结果差异减小的具体实用的研究。本发明采用定值后的多个候选标准物质配制各厂商的专用校准品替代厂家的用户终端校准品，来实现检验结果一致化。

发明内容

针对上述技术问题，本发明提出一种改进TSH检测结果一致性的定标方法、TSH候选标准物质及其制备方法，能够克服现有技术的上述不足。

为实现上述技术目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种改进TSH检测结果一致性的TSH候选标准物质的制备方法，包括以下步骤：

S1：收集不同个体的离体血清，混合后得到11种不同TSH浓度的血清溶液；

S2：分别对所述11种不同TSH浓度的血清溶液中每种血清溶液的TSH浓度进行定值，得到11种不同浓度的TSH候选标准物质。

进一步地，所述步骤S2采用TSH国际标准物质进行量值传递的方式对所述11种不同TSH浓度的血清溶液(候选TSH标准物质)中的TSH浓度进行定值。

进一步地，对所述11种不同TSH浓度的血清溶液中的TSH浓度进行定值的方法具体包括以下步骤：

S2.1：将TSH国际标准物质进行稀释，得到不同浓度的TSH国际标准物质的稀释溶液，并计算各稀释溶液中TSH的认证浓度；

S2.2：采用N个TSH定量检测系统分别测定步骤S2.1中获得的各稀释溶液中TSH的浓度；

S2.3：对于所述N个TSH定量检测系统中的每个TSH定量检测系统，均采用步骤S2.1获得的各稀释溶液中TSH的认证浓度和步骤S2.2中获得的各稀释溶液中TSH的测定浓度进行线性拟合，得到TSH定值标准曲线，即N个TSH定量检测系统得到N个TSH定值标准曲线；

S2.4：采用所述N个TSH定量检测系统分别测定所述TSH候选标准物质中TSH的浓度；

S2.5：对于所述N个TSH定量检测系统中的每个TSH定量检测系统，均将步骤S2.4获得的所述TSH候选标准物质中TSH的测定浓度代入到步骤S2.3获得的相应的TSH定值标准曲线的方程，从而获得所述候选TSH标准物质中TSH的浓度，即将步骤S2.4中某一TSH定量检测系统测得的所述候选TSH标准物质中TSH的浓度值代入到步骤S2.3中获得的该TSH定量检测系统对应的TSH定值标准曲线的方程，从而获得所述TSH候选标准物质中TSH的浓度值，该浓度值即为该TSH定量检测系统对所述候选TSH标准物质中TSH的浓度的定值结果，针对N个TSH定量检测系统会得到N个定值结果；其中，所述TSH定值标准曲线的横坐标(X)为认证浓度，纵坐标(Y)为测定浓度；步骤S2.5中是将所述候选TSH标准物质中TSH的测定浓度代入所述TSH定值标准曲线方程的Y值，计算得到的X值为所述候选TSH标准物质中TSH的浓度；

S2.6：将步骤S2.5获得的针对所述N个TSH定量检测系统的全部所述候选TSH标准物质中TSH的浓度进行求平均处理，所得均值即为所述候选TSH标准物质中TSH浓度的最终定值结果；

所述N为≥2的自然数。

进一步地，所述N为3-20的自然数。

进一步地，所述N为10。

进一步地，所述步骤S2.1包括以下步骤：

S2.1.1配制系列不同浓度的所述TSH国际标准物质的稀释溶液：将稀释液和所述TSH国际标准物质原液按照不同体积比混合，从而获得系列不同浓度的所述TSH国际标准物质的稀释溶液；在配制每份所述TSH国际标准物质的稀释溶液的过程中，均对组成所述TSH国际标准物质的稀释溶液的所述稀释液和所述TSH国际标准物质原液分别进行称重；

S2.1.2系列不同浓度的所述TSH国际标准物质的稀释溶液的密度测定：分别测量步骤S2.1.1中配制的系列不同浓度的所述TSH国际标准物质的稀释溶液的密度；

S2.1.3获得系列不同浓度的所述TSH国际标准物质的稀释溶液中TSH的认证浓度：按照如下公式计算所述系列不同浓度的所述TSH国际标准物质的稀释溶液中的每份稀释溶液中TSH的认证浓度：

式中，C1表示所述TSH国际标准物质原液中TSH的浓度，ρ1表示所述TSH国际标准物质原液的密度，M1表示所述TSH国际标准物质的原液TSH国际标准物质的质量，M2表示所述TSH国际标准物质的稀释溶液中所述稀释液的质量，ρ2表示所述TSH国际标准物质的稀释溶液的密度，C表示所述TSH国际标准物质的标准系列的认证浓度。

进一步地，所述步骤S2.1中将TSH国际标准物质进行稀释采用的稀释液为混合人血清或含牛血清白蛋白(BSA)的Hanks液，所述混合人血清和含BSA的Hanks液为TSH浓度为0μIU/mL的液体；所述血清为外观澄清透明，除外黄疸、溶血、脂血及乳糜等异常性状。

根据本发明的另一方面，提供了上述方法制备的TSH候选标准物质，所述TSH候选标准物质为11种不同TSH浓度的血清溶液，所述11种不同TSH浓度的血清溶液的定值分别为0.191μIU/mL(L1)、0.500μIU/mL(L2)、2.094μIU/mL(L3)、4.118μIU/mL(L4)、4.929μIU/mL(L5)、6.748μIU/mL(L6)、8.245μIU/mL(L7)、12.604μIU/mL(L8)、16.401μIU/mL(L9)、23.880μIU/mL(L10)和44.985μIU/mL(L11)。

进一步地，所述TSH候选标准物质还包括极高值样本(L12)。

由于厂商的产品校准品的高值通常高于L11，所以收集TSH浓度大于150μIU/mL的检验后血清混合成L12，所用定值系统见表6，定值采用了L5-L11,将L12按照称重法算出稀释倍数分别为5.801，9.734和20.080倍，所用的稀释液为TSH浓度为0μIU/mL的混合人血清(L)见表7。最终L12的定值结果见表8。

其中，L12溶液和稀释点的密度测量的具体步骤为：

(1)采用鉴定合格的天平，先称出小瓶和加样枪枪头的质量，记为m1。

(2)采用无菌橡胶手套，从小瓶中小心拿出加样枪枪头。

(3)采用经校准的加样枪，准确吸取200μl待测样本，然后擦去加样枪枪头外表面的液体后，将装待测样本的加样枪枪头置于小瓶中，整体称重，记质量为m2。

(4)根据液体的密度计算公式为：

ρ

(5)重复(1)-(4)的步骤2次。

测得L12的密度为1.025和1.022，均值1.024。

(6)采用同样的方法得到各混合液的密度ρ

稀释倍数的计算公式为：

其中，N表示稀释倍数，W

采用上述方法和5个不同TSH检测系统对L12定值如表8所示。

本发明提供了一种改进TSH检测结果一致性的定标方法，包括以下步骤：

(1)准备M份不同浓度的TSH校准品溶液：一份来源于所述的TSH候选标准物质中的高值样本，一份来源于所述的TSH候选标准物质中的低值样本，另外M-2份是由所述高值样本和所述低值样本按照不同体积比混合而成的系列混合样本，混合所得的TSH的浓度来源于个各厂商用户终端校准品的浓度；

(2)采用各厂商的校准品校准各厂商TSH检测试剂后，检测一定数量的个体人血清中的TSH浓度，每个个体血清检测2次；

(3)采用步骤(1)中准备好的M份不同浓度的TSH校准品溶液对TSH定量检测系统进行校准(即设定基准，某个信号对应的所谓“真值”)，然后检测上述个体血清样本中TSH的浓度，每个个体血清检测2次；

所述M为≥2的自然数(特殊情况下M＝1)。

进一步地，步骤(1)中，在配制所述系列混合样本的过程中，针对所述系列混合样本中的每个混合样本，均对组成所述混合样本的所述低值样本和所述高值样本分别进行称重，并测定所述混合样本的密度，然后根据所述混合样本密度，以及组成该混合样本的所述低值样本和所述高值样本的质量和计算得到该混合样本的体积，进而计算得到各混合样本中TSH的认证浓度。

本发明的有益效果：本发明制备的TSH候选标准物质来源于混合人血清，因而具有良好的互换性，且定值来源于国际标准物质，从而能够提高各实验室的检测结果的一致性与准确性；采用本发明的TSH候选标准物质检测能代表临床实际检测状况的单个患者个体血清盘，结果表明校准之后系统间的一致化程度明显提高，系统间的TSH检测值变异系数中位值从17.94％变为9.56％，混合人血清TSH检测值变异系数中位值从17.10％变为5.52％，满足生物学变异导出的变异系数(CV)中等要求(9.65％)；本发明的TSH候选标准物质适用于临床常规的TSH检测试剂的校准；本发明的定标方法能提高个体患者TSH检测结果的一致性和可比性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为多种基质稀释的TSH国际标准物质在ADVIA CentaurXP和Immulite2000系统间的互换性(A为4种基质，B为其中定值采用的的2种基质)，其中具有互换性的判断标准为TSH国际标准物质在以个体血清TSH检测值绘制的Deming回归线上下两条95％可信线(虚线)范围内。

图2为多种基质稀释的TSH国际标准物质在ADVIA CentaurXP和Architecti2000sr系统间的互换性(A为4种基质，B为其中定值采用的的2种基质)，其中具有互换性的判断标准为TSH国际标准物质在以个体血清TSH检测值绘制的Deming回归线上下两条95％可信线(虚线)范围内。

图3为多种基质稀释的TSH国际标准物质在ADVIA CentaurXP和DXI 800系统间的互换性(A为4种基质，B为其中定值采用的的2种基质)，其中具有互换性的判断标准为TSH国际标准物质在以个体血清TSH检测值绘制的Deming回归线上下两条95％可信线(虚线)范围内。

图4为多种基质稀释的TSH国际标准物质在ADVIA CentaurXP和Liaison XL系统间的互换性(A为4种基质，B为其中定值采用的的2种基质)，其中具有互换性的判断标准为TSH国际标准物质在以个体血清TSH检测值绘制的Deming回归线上下两条95％可信线(虚线)范围内。

图5为多种基质稀释的TSH国际标准物质在ADVIA CentaurXP和CI 1000系统间的互换性(A为4种基质，B为其中定值采用的的2种基质)，其中具有互换性的判断标准为TSH国际标准物质在以个体血清TSH检测值绘制的Deming回归线上下两条95％可信线(虚线)范围内。

图6为多种基质稀释的TSH国际标准物质在ADVIA CentaurXP和Cobas 601系统间的互换性(A为4种基质，B为其中定值采用的的2种基质)，其中具有互换性的判断标准为TSH国际标准物质在以个体血清TSH检测值绘制的Deming回归线上下两条95％可信线(虚线)范围内。

图7为多种基质稀释的TSH国际标准物质在ADVIA CentaurXP和AutolumoA2000plus系统间的互换性(A为4种基质，B为其中定值采用的的2种基质)，其中具有互换性的判断标准为TSH国际标准物质在以个体血清TSH检测值绘制的Deming回归线上下两条95％可信线(虚线)范围内。

图8为采用DXI 800在两种基质稀释的不同浓度的TSH国际标准物质(L1和L2)赋值曲线(A为TSH浓度为0μIU/mL的混合人血清，B为含牛血清白蛋白的Hanks液)；

图9为采用DXI 800在两种基质稀释的不同浓度的TSH国际标准物质(L3和L4)赋值曲线(A为TSH浓度为0μIU/mL的混合人血清，B为含牛血清白蛋白的Hanks液)；

图10为采用DXI 800在两种基质稀释的不同浓度的TSH国际标准物质(L5、L6和L7)赋值曲线(A为TSH浓度为0μIU/mL的混合人血清，B为含牛血清白蛋白的Hanks液)；

图11为采用DXI 800在两种基质稀释的不同浓度的TSH国际标准物质(L8、L9和L10)赋值曲线(A为TSH浓度为0μIU/mL的混合人血清，B为含牛血清白蛋白的Hanks液)；

图12为采用DXI 800在两种基质稀释的不同浓度的TSH国际标准物质(L11)赋值曲线(A为TSH浓度为0μIU/mL的混合人血清，B为含牛血清白蛋白的Hanks液)；

图13为采用Cobas 601在两种基质稀释的不同浓度的TSH国际标准物质(L1和L2)赋值曲线(A的基质为TSH浓度为0μIU/mL的混合人血清，B为含牛血清白蛋白的Hanks液)；

图14为采用Cobas 601在两种基质稀释的不同浓度的TSH国际标准物质(L3和L4)赋值曲线(A为TSH浓度为0μIU/mL的混合人血清，B为含牛血清白蛋白的Hanks液)；

图15为采用Cobas 601在两种基质稀释的不同浓度的TSH国际标准物质(L5、L6和L7)赋值曲线(A为TSH浓度为0μIU/mL的混合人血清，B为含牛血清白蛋白的Hanks液)；

图16为采用Cobas 601在两种基质稀释的不同浓度的TSH国际标准物质(L8、L9和L10)赋值曲线(A为TSH浓度为0μIU/mL的混合人血清，B为含牛血清白蛋白的Hanks液)；

图17为采用Cobas 601在两种基质稀释的不同浓度的TSH国际标准物质(L11)赋值曲线(A为TSH浓度为0μIU/mL的混合人血清，B为含牛血清白蛋白的Hanks液)；

图18为专用校准品校准前后TSH检测结果一致化改进效果对比图(A为专用校准品校准前系统间可比性，B为专用校准品校准后系统间可比性)。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

步骤一(TSH候选标准物质定值)

一种改进TSH检测结果一致性的TSH候选标准物质专用校准品的制备方法，包括以下步骤：

S1：收集不同个体的离体血清，混合后得到11种不同TSH浓度的血清溶液；

S2：分别对所述11种不同TSH浓度的血清溶液中的TSH浓度进行定值，得到11种浓度的TSH候选标准物质。

所述步骤S2采用TSH国际标准物质NIBSC 81/565进行量值传递的方式对所述11种不同TSH浓度的血清溶液(候选TSH标准物质)中TSH浓度进行定值，多种基质稀释的TSH国际标准物质在多系统间的互换性如图1-7所示，TSH检测系统基本信息如表1所示(稀释液见表2)。

两系统间TSH国际标准物质具有互换性的判断标准为其在以个体血清TSH检测值绘制的Deming回归线上下两条95％可信线范围内。具体实施步骤为，从首都医科大学附属北京朝阳医院收集高中低不同TSH浓度的29例患者血清(伦理批准件2018-2-26-1)。每例样本的血清根据各厂家需求量被分成了8份，分别在8个不同系统(见表1中除了IS 1200和Maglumi 2000plus的8个检测系统)检测3次。要求样本外观没有溶血、脂血和黄疸，采用西门子ADVIA CentaurXP免疫分析仪检测TSH的初始浓度范围为从0.09μIU/mL到84.03μIU/mL。以ADVIA CentaurXP为比对系统进行TSH国际标准物质互换性评价的原因是该系统为本实验室常规使用的仪器，且本实验室通过了国际标准化组织(ISO)15189和美国病理学家协会(CAP)双认可，检测质量有保证。

表1.TSH检测系统基本信息

AMR，分析测量范围；RR，参考范围；ECL，电化学发光；CL，化学发光；CMIA，化学发光微粒子免疫检测法。

表2.TSH国际标准物质稀释液的基本信息

IS，TSH国际标准物质；HSP0，TSH浓度为0μIU/mL混合人血清；BSA，牛血清白蛋白(Sigma,B2064，浓度46g/L)。

从图1-7中可以发现除了ADVIA CentaurXP和Cobas 601之外，TSH浓度为0μIU/mL混合人血清(HSP0)使稀释的TSH国际标准物质在各系统间具有互换性。而含BSA的Hanks液能使稀释的TSH国际标准物质在ADVIA CentaurXP和DXI 800/Cobas 601/AutolumoA2000plus系统间具有互换性。因此选择了这两种基质作为TSH国际标准物质的稀释液绘制定标曲线为TSH候选标准物质定值，最终需要使各定值系统所得的值在总体均值加/减3倍标准差之内。

进一步的，为了探索在体外诊断量值溯源领域TSH国际标准物质互换性对多系统定值的重要性，本发明首次明确了两个问题：(1)不同稀释液使TSH国际标准物质具有不同的互换性(图1-7)。(2)只有使TSH国际标准物质具有互换性才能在多系统间/内使TSH候选标准物质定值达到一致，多系统定值才能成功。

举例来说，分别将TSH国际标准物质采用HSP0和含BSA的Hanks液进行稀释，采用DXI 800系统得到的定值曲线见图8-12，可以看出左侧的5条定值曲线和右侧的5条定值曲线斜率接近，定值一致(每浓度水平采用2支定值样本)，偏倚的中位值小于基于生物学变异度导出的最大允许偏倚(11.7％)；但是分别将TSH国际标准物质采用HSP0和含BSA的Hanks液进行稀释，采用Cobas 601系统得到的定值曲线见图13-17，可以看出左侧的5条定值曲线和右侧的5条定值曲线斜率差异很大，定值不一致(每浓度水平采用2支定值样本)，偏倚的中位值大于基于生物学变异度导出的最大允许偏倚(11.7％)，见表3。所以，我们得到的结论是在为TSH候选标准物质定值时，尽量选择使TSH国际标准物质具有互换性的基质绘制定值曲线进行定值。当采用具有互换性的基质(见图3B)，如将TSH国际标准物质采用HSP0和含BSA的Hanks液进行稀释，在DXI 800系统为TSH候选标准物质定值，使用两种基质以及与其他检测系统定值结果相比都满足在总体均值加/减3倍标准差之内的要求(表3-5)。当采用不具有互换性的基质(见图6B)，如将TSH国际标准物质采用HSP0稀释，在Cobas 601系统为TSH候选标准物质定值，其定值结果与其他系统或采用使TSH国际标准物质具有互换性的基质得到的定值曲线的定值结果相差较大，不能满足在总体均值加/减3倍标准差之内的要求(表3，表5)。所以对TSH候选标准物质进行多系统定值时，在选择TSH国际标准物质稀释液时，需要先进行相关的互换性研究，尽可能选择使国际标准物质具有互换性的基质进行定值，提高定值一致性和成功率。

进一步的为了验证HSP0和含BSA的Hanks液对TSH候选标准物质定值的广泛适宜性，本发明另外选择了2个TSH主流检测系统(IS 1200和Maglumi 2000plus，见表1)，将TSH国际标准物质进行系列稀释，绘制定值曲线为TSH候选标准物质定值，最后发现将TSH国际标准物质采用HSP0和含BSA的Hanks液进行稀释，采用IS 1200系统得到的定值结果与总体均值接近，将TSH国际标准物质采用HSP0进行稀释，采用Maglumi 2000plus系统得到的定值结果与总体均值接近，见表4。

最终，采用10个检测系统13种定值方式得到的TSH候选标准物质的定值结果见表5。

表3同一检测系统采用不同基质为TSH候选标准物质定值的偏倚

表5.TSH候选标准物质最终定值

所述步骤S2进行定值的方法具体包括以下步骤：

S2.1：采用使TSH国际标准物质在系统间具有互换性的稀释液(下称适宜稀释液)对其进行稀释，得到不同浓度的TSH国际标准物质的稀释溶液，即为定值曲线，并计算各稀释溶液中TSH的认证浓度；

S2.2：采用10个TSH定量检测系统(13种定值方法，其中ADVIA CentaurXP，DXI800和IS 1200采用了2种稀释液对国际标准物质进行稀释分别获得10条定值曲线，其余7个定量系统均采用了1种稀释液对国际标准物质进行稀释分别获得5条定值曲线)分别测定步骤S2.1中获得的各稀释溶液中TSH的浓度，TSH定量检测系统在正式试验前均须通过精密度、正确度、系统线性、携带污染等一系列的测量系统的性能验证，性能验证通过后，进行正式定值实验；

S2.3：对于所述10个TSH定量检测系统中的每个TSH定量检测系统，均采用步骤S2.1获得的适宜稀释液稀释TSH国际标准物质，从而获得TSH的认证浓度，随后与步骤S2.2中获得的各稀释溶液中TSH的测定浓度进行线性拟合，得到TSH定值标准曲线。因为标准曲线和TSH候选标准物质的TSH浓度范围宽，故对TSH候选标准物质定值时，采用了多个定值曲线。即13个TSH定值方法得到65个TSH定值标准曲线；

S2.4：采用所述13个TSH定值方法分别测定所述TSH候选标准物质中TSH的浓度；

S2.5：对于所述13个TSH定值方法中的每个TSH定量检测系统，均将步骤S2.4获得的所述候选TSH标准物质中TSH的测定浓度代入到步骤S2.3获得的相应的TSH定值标准曲线的方程，从而获得所述候选TSH标准物质中TSH的浓度，即将步骤S2.4中某一TSH定量检测系统测得的所述候选TSH标准物质中TSH的浓度值代入到步骤S2.3中获得的该TSH定量检测系统对应的TSH定值标准曲线的方程，从而获得所述候选TSH标准物质中TSH的浓度值，该浓度值即为该TSH定量检测系统对所述候选TSH标准物质中TSH的浓度的定值结果，针对13个TSH定值方法每种浓度水平选择2支样本，会得到26个定值结果；其中，所述TSH定值标准曲线的横坐标(X)为认证浓度，纵坐标(Y)为测定浓度；步骤S2.5中是将所述候选TSH标准物质中TSH的测定浓度代入所述TSH定值标准曲线方程的Y值，计算得到的X值为所述TSH候选标准物质中TSH的浓度，见表4；

S2.6：将步骤S2.5获得的针对所述13个TSH定值方法的全部所述候选TSH标准物质中TSH的浓度进行求平均处理，所得均值即为所述候选TSH标准物质中TSH浓度的最终定值结果，见表5。

所述步骤S2.1包括以下步骤：

S2.1.1配制系列不同浓度的所述TSH国际标准物质的稀释溶液：将稀释液和所述TSH国际标准物质原液按照不同体积比混合，从而获得系列不同浓度的所述TSH国际标准物质的稀释溶液；在配制每份所述TSH国际标准物质的稀释溶液的过程中，均对组成所述TSH国际标准物质的稀释溶液的所述稀释液和所述TSH国际标准物质原液分别进行称重；

S2.1.2系列不同浓度的所述TSH国际标准物质的稀释溶液的密度测定：分别测量步骤S2.1.1中配制的系列不同浓度的所述TSH国际标准物质的稀释溶液的密度；

S2.1.3获得系列不同浓度的所述TSH国际标准物质的稀释溶液中TSH的认证浓度：按照如下公式计算所述系列不同浓度的所述TSH国际标准物质的稀释溶液中的每份稀释溶液中TSH的认证浓度：

式中，C1表示所述TSH国际标准物质原液中TSH的浓度，ρ1表示所述TSH国际标准物质原液的密度，M1表示所述TSH国际标准物质的原液TSH国际标准物质的质量，M2表示所述TSH国际标准物质的稀释溶液中所述稀释液的质量，ρ2表示所述TSH国际标准物质的稀释溶液的密度，C表示所述TSH国际标准物质的标准系列的认证浓度。

所述步骤S2.1中将TSH国际标准物质进行稀释采用的稀释液为混合人血清或含BSA的Hanks液，所述血清和含BSA的Hanks液为TSH浓度为0μIU/mL的血清；所述血清为外观澄清透明，除外黄疸、溶血、脂血及乳糜等异常性状。

所述步骤S2.1.3中TSH国际标准物质原液中TSH的浓度的获得方法为采用含牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液(PBS)溶液称重法稀释的TSH国际标准物质(WHO NIBSC 81/565)，浓度为1181.356μIU/mL。

上述方法制备的校准品为11种不同TSH浓度的血清溶液(L1-L11)，所述11种不同TSH浓度的血清溶液的定值如表5所示。

步骤二(极高值样本L12的定值)

由于厂商的产品校准品的高值通常高于L11，所以收集TSH浓度大于150μIU/mL的检验后血清混合成L12，所用定值系统见表6，定值采用了L5-L11,将L12按照称重法算出稀释倍数分别为5.801，9.734和20.080倍，所用的稀释液为TSH浓度为0μIU/mL的混合人血清(L)见表7。最终L12的定值结果见表8。

其中，L12溶液和稀释点的密度测量的具体步骤为：

(1)采用鉴定合格的天平，先称出小瓶和加样枪枪头的质量，记为m1。

(2)采用无菌橡胶手套，从小瓶中小心拿出加样枪枪头。

(3)采用经校准的加样枪，准确吸取200μl待测样本，然后擦去加样枪枪头外表面的液体后，将装待测样本的加样枪枪头置于小瓶中，整体称重，记质量为m2。

(4)根据液体的密度计算公式为：

ρ

(5)重复(1)-(4)的步骤2次。

测得L12的密度为1.025和1.022，均值1.024。

(6)采用同样的方法得到各混合液的密度ρ

稀释倍数的计算公式为：

其中，N表示稀释倍数，W

表6 TSH极高值样本L12定值检测系统基本信息

L12定值稀释倍数如表7所示：

表7 TSH极高值样本L12定值稀释倍数(称重法)

采用上述方法和5个不同TSH检测系统对L12定值如表8所示：

表8 5系统对TSH极高值样本L12定值

步骤三(改进TSH检测结果一致性的定标方法)

1.检测系统基本信息

采用体外诊断市场上主流的6个检测系统(如表9)，采用配制的TSH专用校准品，比较校准前后，对系统间检测结果一致化的改进程度。

表9 TSH一致化检测系统基本信息

2.各检测系统TSH专用校准品的配制

如表10所示，按照厂商产品校准品的浓度，采用定值的L1-L12 TSH候选标准物质，按照称重法配制，配制每个校准品，其体积为1ml，采用相邻的高值(H)和低值(L)两个浓度值配制。通过下列公式计算，

其中C

表10 TSH专用校准品配制(称重法,g)

3.血清盘收集

在首都医科大学附属北京朝阳医院收集TSH高中低不同浓度的22例患者检测完成后的血清(TSH浓度范围0.13～84.3μIU/mL，西门子ADVIA CentaurXP检测系统)按照6厂商的4次检测量分装成6份，冻于-80C，从血清的采集到冻存完成不超过48小时。收集过程中排除了溶血，黄疸和脂血的样本。

4.混合人血清即是11浓度水平的TSH候选标准物质。

在实验之前对仪器进行必要的检查和维护保养，采用原厂校准品校准后，进行室内质控品的检测。质控通过后，充分混匀这33个样本，每个样本检测2次。然后采用以上配制的TSH专用校准品校准后，再次检测以上33个样本，每个样本检测2次。

最后将TSH专用校准品校准前后的变异系数(CV)分别与基于生物学变异度导出的最优CV(CV＝0.25*CVI，CVI为个体内生物学变异度)相比较，判断一致化改进效果。同时以ADVIA CentaurXP作为对照系统，采用MedCalc统计软件进行Passing–Bablok回归，并比较校准前后回归线的变化。

校准前后6系统TSH检测值变异系数(CV)中位值从17.94％变为9.56％，混合人血清TSH检测值变异系数(CV)中位值从17.10％变为5.52％，满足生物学变异导出的CV中等要求(9.65％)。以ADVIA CentaurXP为比较检测系统，其他检测系统作为评价系统，如表11所示校准前所得的斜率范围为0.738-1.128，相关系数为0.989-0.999；校准后所得的斜率范围为0.954-1.053，相关系数为0.986-0.999。

校准品校准前后一致化改进效果对比如图18所示。

表11 TSH专用校准品校准前后ADVIA CentaurXP与其他检测系统可比性与相关性

上述校准品在如下任一种的应用也属于本发明的保护范围：

(i)采用专用校准品校准TSH检测试剂；

(ii)采用专用校准品提高多系统对个体患者TSH检测结果的一致性和/或可比性。

上述系统包括用于定量检测TSH的仪器和所使用的试剂，如临床实验室TSH检测系统。

综上所述，借助于本发明的上述技术方案，本发明制备的TSH候选标准物(TSH专用校准品)来源于新鲜冰冻混合人血清，因而具有良好的互换性。采用该校准品对多个TSH检测系统进行校准后，检测个体人血清或人混合血清TSH浓度时，各实验室的检测结果的一致性明显提高。检验结果的准确可比能为患者疾病诊断和治疗监测提供科学依据。本发明采用以上校准品，检测能代表临床实际检测状况的单个患者个体血清盘，结果表明校准之后系统间的一致化程度明显提高，系统间的TSH检测值变异系数中位值从17.94％变为9.56％，混合人血清TSH检测值变异系数中位值从17.10％变为5.52％，满足生物学变异导出的CV中等要求(9.65％)。总之，本发明研制的TSH专用校准品及其一致化应用实施方案适用于临床常规的TSH检测试剂的校准，从而提高个体患者TSH检测结果的一致性和可比性，具有很好的应用前景，值得推广。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。