一种INK128在制备延缓卵巢发育的产品中的应用

摘要

本发明公开一种INK128在制备延缓卵巢发育的产品中的应用，涉及医药领域；所述延缓卵巢发育的产品具体为维持卵巢内分泌功能的产品或提高卵巢线粒体功能的产品，所述卵巢具体为重建卵巢；本发明发现，饲喂INK128后，重建卵巢的发育被显著延长至12周，同时卵巢的内分泌功能得到了一定程度上的维持。同时，通过RNAseq结果显示，相比于未饲喂INK128组别获得的重建卵巢，饲喂INK128后，mTOR信号通路被显著抑制，线粒体的相关功能被显著提升，免疫应答及炎症反应也被显著降低，对延缓卵巢衰老起到了至关重要的作用。

说明书

技术领域

本发明涉及医药领域，特别是涉及一种INK128在制备延缓卵巢发育的产品中的应用。

背景技术

卵巢对于维持女性生育及内分泌水平至关重要。卵巢衰老与女性年龄是相关的，随着年龄的增长，周期性排卵、卵泡闭锁及细胞凋亡导致卵泡数量急剧下降，导致卵巢衰老。从大约35岁,女性生育能力开始下降,大约50岁进入更年期,内分泌功能发生紊乱,这些都可能导致生殖衰老相关的慢性疾病发生,如冠心病、骨质疏松症,和内分泌失调,给女性的身心健康造成了极大的冲击。

原始生殖细胞(PGCs)是卵巢内卵子或精子的前体细胞。由于PGCs可以进行自我更新和向生殖细胞分化，这些细胞也被认为是种系干细胞或卵巢干细胞。种系干细胞移植能重建卵巢卵母细胞和卵泡发育及内分泌功能，通过将PGCs与胚胎性腺体细胞聚集后，再将重组性腺移植到小鼠的肾包囊中，可以诱导其进行减数分裂和卵泡发育并形成卵母细胞。但是，重组后的卵巢只能在体内维持其功能大约4周左右。这使得重建卵巢，恢复内分泌功能的方法受到了时间上的限制。因此，如何延缓重聚卵巢卵泡发育，同时降低免疫应答和炎症反应是目前医学领域亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种INK128在制备延缓卵巢发育的产品中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，使重聚卵巢卵泡发育得到延缓，同时降低免疫应答和炎症反应，从而达到延缓卵巢衰老的目的。

为实现上述目的，本发明提供一种INK128在制备延缓卵巢发育的产品中的应用。

进一步的，所述产品为维持卵巢内分泌功能的产品、提高卵巢线粒体功能的产品、降低免疫应答的产品或降低炎症反应的产品。

进一步的，根据上述任一项所述的应用，所述卵巢为重建卵巢。

本发明还提供一种INK128在制备延缓卵泡发育的产品中的应用。

进一步的，所述卵泡为重建卵巢中的卵泡。

本发明还提供一种INK128在制备改善卵巢衰老造成的内分泌紊乱的产品中的应用，所述卵巢衰老由端粒酶基因敲除而造成。

进一步的，根据上述任一项所述的应用，INK128施用量按照INK128施用对象体重计量为1.8mg/kg/天。

本发明公开了以下技术效果：饲喂INK128后，重建卵巢的发育被显著延长至12周，同时端粒酶敲除小鼠的内分泌功能得到了一定程度上的维持。进一步的，通过RNAseq结果显示，相比于未饲喂INK128组别获得的重聚卵巢，饲喂INK128后，mTOR信号通路被显著抑制，线粒体的相关功能被显著提升，免疫应答及炎症反应也被显著降低，对延缓重构卵巢衰老，维持机体内分泌功能起到了至关重要的作用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为GFP荧光和H&E染色可以直观地观察到卵巢样移植物中卵泡的发育情况，其中图1-A为40mg/L雷帕霉素治疗小鼠4周后，图1-B为40mg/L雷帕霉素治疗小鼠8周后；

图2为接受雷帕霉素治疗的小鼠与未接受雷帕霉素治疗的小鼠不同发育阶段的卵泡数目比较，其中图2-A为接受雷帕霉素治疗的小鼠与未接受雷帕霉素治疗的小鼠4周后，图2-B为接受雷帕霉素治疗的小鼠与未接受雷帕霉素治疗的小鼠8周后；

图3为GFP荧光和H&E染色观察INK128治疗年轻C57BL/6小鼠4周后和8周后的卵巢样移植物中卵泡的发育情况和卵泡数量，其中，图3-A为接受INK128治疗的小鼠与未接受INK128治疗的小鼠4周与8周后的卵泡发育情况，3-B为接受INK128治疗的小鼠与未接受INK128治疗的小鼠4周与8周后的卵泡数量；

图4为免疫荧光染色观察C57BL/6小鼠的颗粒细胞与卵母细胞；

图5为GFP荧光观察饲喂INK128治疗的C57BL/6小鼠维持八周的重组卵巢的形态；

图6为H&E染色观察饲喂INK128治疗的C57BL/6小鼠维持8周的各级卵泡形态学组织；

图7为饲喂INK128治疗的C57BL/6小鼠维持8周后重组卵巢的各个阶段的卵泡数；

图8为GFP荧光和H&E染色观察INK128治疗G2 Terc

图9为INK128治疗G2 Terc

图10为INK128饲喂(+)或正常喂水(-)8周或12周后的受体小鼠的促卵泡激素(FSH)，抗苗勒激素(AMH)和雌二醇(E2)在血清中的水平；

图11为G2 Terc

图12为INK128饲喂G2 Terc

图13为INK128饲喂G2 Terc

图14为来自G2 Terc

图15为对照组与INK128饲喂G2 Terc

图16为对照组与INK128饲喂G2 Terc

图17为INK128饲喂G2 Terc

图18为MitoCarta2.0数据集与线粒体相关基因之间共享基因的韦恩图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

以下实施例中使用的雷帕霉素来自LC lab(Catalog No.R5000-1)，高效液相色谱法测定雷帕霉素的纯度为>99％；INK128来自Selleck.cn(MLN0128，目录号:S2811)，高效液相色谱法测定INK128纯度为99.68％。

G2 Terc

实施例1小鼠的卵巢重建及饲喂

1、12.5天胚胎的原始生殖细胞及性腺体细胞的获得；

2、重聚性腺形成重聚卵巢，将重聚卵巢移植到双侧去卵巢的小鼠的肾包囊下；

3、移植后饲喂雷帕霉素：将雷帕霉素以40mg/L的浓度溶解在饮用水中，约8.0mg/kg/day用于饲喂C57BL/6幼龄小鼠，

4、移植后饲喂INK128：将50mM INK128溶于DMSO中，受体小鼠的饮用水中INK128的使用终浓度为30μM/L，1.8mg/kg/day饲喂8周龄C57小鼠分别至12周及16周，10周龄G2Terc

实施例2卵巢发育及内分泌功能检测

2.1 40mg/L雷帕霉素治疗小鼠的重构卵巢发育

通过GFP荧光和H&E染色可以直观地观察到卵巢样移植物中卵泡的发育情况，如图1-A所示(其中，BF为明亮视野下的显微图像，Actin-GFP指示携带actin-GFP的小鼠的供体细胞来源)，40mg/L雷帕霉素治疗小鼠4周后，出现大量次级卵泡、窦卵泡及成熟卵泡；如图1-B所示，40mg/L雷帕霉素治疗小鼠8周后，仅出现黄体和无卵泡空腔，无卵泡；图2-A所示，接受雷帕霉素治疗的小鼠与未接受雷帕霉素治疗的小鼠4周后的不同发育阶段的卵泡数目比较，(Mean±SEM。n＝3。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)，；图2-B所示，接受雷帕霉素治疗的小鼠与未接受雷帕霉素治疗的小鼠8周后的不同发育阶段的卵泡数目比较，(Mean±SEM。n＝3。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)，这些结果表明，雷帕霉素不能完全阻止卵巢中卵泡的立即激活和长时间的发育。

2.2 INK128治疗小鼠的卵巢发育及内分泌功能检测

2.2.1 C57BL/6小鼠

通过GFP荧光观察INK128治疗小鼠4周后和8周后的卵巢样移植物中卵泡的发育情况，结果如图3-A所示(其中，BF为明亮视野下的显微图像，Actin-GFP指示携带actin-GFP的小鼠的供体细胞来源，比例尺＝1毫米)，。

通过H&E染色观察INK128治疗小鼠4周后和8周后的卵泡数量，结果如图3-B所示(黑色箭头指示次级和成熟卵泡)，卵泡在移植后4周时存在，但在移植后8周没有卵泡。INK128治疗小鼠4周后和8周后的重组卵巢的各个发育阶段的卵泡数量统计见图3-C(比例尺＝100μm)。

通过免疫荧光染色观察颗粒细胞与卵母细胞，可看到完整的卵泡结构，结果如图4所示(比例尺＝50μm)，其中FOXL2指示颗粒细胞和VASA标记卵母细胞。

通过GFP荧光观察饲喂INK128的小鼠维持8周的重组卵巢发育的形态，结果如图5所示(其中，BF为明亮视野下的显微图像，Actin-GFP指示携带actin-GFP的小鼠的供体细胞来源)。

通过H&E染色观察饲喂INK128的小鼠，8周后，重建卵巢能的各级卵泡的形态，结果如图6所示，箭头指示初级，次级和成熟的卵泡。饲喂INK1288周后的小鼠，重组卵巢的各个阶段的卵泡数如图7所示(平均值±SEM。*P<0.05，**P<0.01)，依然存在各种级别的卵泡。

2.2.2 G2 Terc-/-小鼠

通过GFP荧光和H&E染色观察INK128治疗小鼠8周后和12周后的卵巢样移植物中卵泡的发育情况：INK128治疗小鼠8周后如图8-A所示，依然存在各种级别的卵泡。INK128治疗小鼠12周后如图8-B所示，依然存在各种级别的卵泡。(其中，BF为明亮视野下的显微图像，Actin-GFP指示携带actin-GFP的小鼠的供体细胞来源，比例尺＝1毫米)。

移植后8或12周后，各个级别的卵泡数如图9所示。

检测INK128饲喂(+)或正常喂水(-)8周或12周后的受体小鼠的促卵泡激素(FSH)，抗苗勒激素(AMH)和雌二醇(E2)在血清中的水平，饲喂INK128后，小鼠的激素水平得到了一定程度的维持。以10周龄G2 Terc-/-小鼠作为年轻对照，以22周龄G2 Terc-/-小鼠以及带有双侧卵巢切除(OE)的小鼠作为阴性对照，每个重聚物都被移植在双侧卵巢切除的受体小鼠的肾包囊下。结果如图10所示(平均值±SEM。*P<0.05，**P<0.01)。

2.3通过RNA测序分析INK128对重组卵巢功能的影响

受体为G2 Terc-/-鼠，移植四周后，饲喂INK128与对照组的重组卵巢的差异基因表达情况如图11所示，从蓝色到红色的颜色分别表示从低到高的相对基因表达水平。INK128饲喂组与对照组的DEG富集对比如图12所示，DEG富集的代表性的信号通路，12-A和12-B分别表示上调和下调的信号通路。热图(图13)显示，与对照相比，INK128处理后，与mTOR信号通路相关的代表性基因的表达水平。关键基因列在热图的右侧。

对来自G2 Terc-/-小鼠的重组卵巢中的P-AKT和FOXO3的蛋白质表达进行的蛋白质印迹分析，分析结果如图14所示，FOXO3的蛋白表达水平在INK128饲喂后显著上升，P-AKT的水平在INK128饲喂后被显著抑制。

在进行INK128处理后，将PI3K-Akt信号通路与对照进行比较，热图结果如图15所示。对比NK128处理和对照之间的差异基因进行GO富集，结果如图16所示，其中16-A表示上调DEG富集的GO，16-B下调DEG富集的GO。

与对照相比，INK128处理后与免疫反应相关的基因的表达水平、与线粒体相关的基因的表达水平和与氧化磷酸化相关的基因的表达水平的热图结果如图17所示，其中17-A为与免疫反应相关的基因的表达水平，17-B为与线粒体相关的基因的表达水平，17-C为与氧化磷酸化相关的基因的表达水平，关键基因列在热图的右侧。韦恩图(图18)说明了在我们的数据分析中揭示的MitoCarta2.0数据集与线粒体相关基因之间共享的基因。

由上述结果可知，相比于未饲喂INK128组别获得的重聚卵巢，饲喂INK128后的G2Terc-/-小鼠，mTOR信号通路被显著抑制，线粒体的相关功能被显著提升，免疫应答及炎症反应也被显著降低。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。