用于递送信使RNA的脂质制剂

摘要

本发明尤其提供了体内递送mRNA的方法，其包括向需要递送的受试者施用包含包封在脂质体内的编码蛋白质的mRNA的组合物，以使施用所述组合物导致由所述mRNA编码的蛋白质的体内表达，其中所述脂质体包含式I‑c的阳离子脂质：或其药学上可接受的盐。

说明书

相关申请

本申请是申请号为201480063947.5、申请日为2014年10月22日、发明名称为“用于递送信使RNA的脂质制剂”的中国发明专利申请的分案申请，原申请为国际申请号为PCT/US2014/061793的PCT国际申请的中国国家阶段申请，该PCT国际申请要求申请日为2013年10月22日，申请号为61/894,299以及申请日为2014年3月14日，申请号为61/953,516的美国临时专利申请的优先权，该申请以引用的方式整体并入本文中。

序列表

本说明书参考序列表(于2014年10月22日以名称为“2006685-0687_SL.txt”的.txt文件形式按电子方式提交)。.txt文件于2014年10月22日生成且大小为35,552字节。序列表的全部内容通过引用并入本文。

背景

已广泛探讨递送核酸作为潜在的治疗选择用于某些疾病状态。特别地，RNA干扰(RNAi)已经是重要的研究和临床开发的目标。尽管RNAi诸如短干扰RNA(siRNA)可能具有治疗潜力，但是其在治疗涉及缺少一种或多种蛋白质的疾病方面用处甚微。信使RNA(mRNA)疗法已成为日益重要的用于治疗各种疾病(特别是与缺少一种或多种蛋白质相关的疾病)的选择。

发明概述

本发明提供用于高度有效的体内递送和表达mRNA和编码蛋白质的改进的方法和组合物。本发明部分基于令人惊讶的发现，即基于一类特定的阳离子脂质(诸如具有本文所述的式I-c的结构的那些)的脂质体出乎意料地在体内递送mRNA和产生编码蛋白质方面有效，甚至比被认为是现有技术中递送mRNA方面最好的那些阳离子脂质更有效。实际上，在本发明之前，已广泛探讨阳离子脂质作为常用于包封包括mRNA的核酸以进行体内递送的脂质体的重要组分。由于独特地脆弱和长的mRNA结构和复杂的体内翻译过程，用于脂质体中的阳离子脂质通常起两种作用。第一，阳离子脂质在包封、循环和内吞期间促进与荷负电mRNA的相互作用，从而捕获和保护mRNA。然后，一旦在细胞溶质内，阳离子脂质需要能够释放mRNA以使mRNA可被翻译以产生编码蛋白质。一些阳离子脂质(特别是被称为可滴定的阳离子脂质的那些)在递送mRNA方面特别有效。已知能够有效递送mRNA的此类阳离子脂质的一个实例为C12-200。令人惊讶地，本发明人发现本文所述的阳离子脂质可在体内递送各种mRNA方面甚至比已知在现有技术中最好的那些(包括C12-200)更有效。例如，如在下面实施例中所示，并入本文所述的阳离子脂质(例如，cKK-E12)的脂质体颗粒导致比基于C12-200的脂质体颗粒高近50％的于施药小鼠的血浆中检测到的人因子IX蛋白的蛋白质表达。此外，从基于cKK-E12的脂质体递送的mRNA表达的不同蛋白的血浆停留时间在单次施用后维持高达7天或更长时间。因此，本发明人已证实具有本文所述的式I-c的结构的此类阳离子脂质(例如，cKK-E12)可独特地用于递送mRNA以在体内高度有效地且持续地产生蛋白(例如，治疗性蛋白)。本发明因此允许改进的mRNA疗法(其可显著地减少mRNA和相关的脂质的需要量、施用频率和可能的副作用)，从而提供更有效的、更安全的和患者友好的针对各种疾病的mRNA疗法。

一方面，本发明提供体内递送信使RNA(mRNA)的方法，所述方法包括向需要递送的受试者施用包含包封在脂质体内的编码蛋白质的mRNA的组合物，以使施用所述组合物导致由所述mRNA编码的蛋白质的体内表达，其中所述脂质体包含式I-c的阳离子脂质：

或其药学上可接受的盐，

其中：

p是1至9之间的整数，包括端值；

R

R

式(i)、(ii)和(iii)为：

其中：

R’的每个实例独立地为氢或任选取代的烷基；

X为O、S或NR

Y为O、S或NR

R

R

另一方面，本发明提供治疗疾病或病症的方法，所述方法包括向需要治疗的受试者施用包含包封在脂质体内的编码治疗性蛋白的mRNA的组合物，以使施用所述组合物导致受疾病或病症影响的一个或多个组织中由所述mRNA编码的蛋白质的表达，其中所述脂质体包含具有式I-c的结构的阳离子脂质。

另一方面，本发明提供组合物用于递送包含包封在脂质体内的编码蛋白质的mRNA的信使RNA(mRNA)，其中所述脂质体包含具有式I-c的结构的阳离子脂质。

在一些实施方案中，合适的阳离子脂质为cKK-E12：

在一些实施方案中，合适的脂质体还包含一种或多种非阳离子脂质、一种或多种基于胆固醇的脂质和/或一种或多种PEG-修饰的脂质。在一些实施方案中，所述一种或多种非阳离子脂质选自二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰基油酰基-磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰基-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰基-磷脂酰-乙醇胺(DSPE)、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、或其混合物。

在一些实施方案中，合适的脂质体还包含一种或多种基于胆固醇的脂质。在一些实施方案中，所述一种或多种基于胆固醇的脂质选自胆固醇、聚乙二醇化的胆固醇和DC-Chol(N,N-二甲基-N-乙基甲酰胺基胆固醇)、1,4-双(3-N-油基氨基-丙基)哌嗪。

在一些实施方案中，合适的脂质体还包含一种或多种PEG-修饰的脂质。在一些实施方案中，所述一种或多种PEG-修饰的脂质包含共价连接至具有C

在一些实施方案中，合适的脂质体包含cKK-E12、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2K。

在一些实施方案中，阳离子脂质(例如，cKK-E12)构成约30-50％(例如，约30-45％、约30-40％、约35-50％、约35-45％、或约35-40％)摩尔比的脂质体。在一些实施方案中，阳离子脂质(例如，cKK-E12)构成约30％、约35％、约40％、约45％、或约50％摩尔比的脂质体。

在具体的实施方案中，cKK-E12:DOPE:胆固醇:DMG-PEG2K的比率为约40:30:20:10摩尔比。在具体的实施方案中，cKK-E12:DOPE:胆固醇:DMG-PEG2K的比率为约40:30:25:5摩尔比。在具体的实施方案中，cKK-E12:DOPE:胆固醇:DMG-PEG2K的比率为约40:32:25:3摩尔比。

在一些实施方案中，合适的脂质体具有为或小于约500nm、450nm、400nm、350nm、300nm、250nm、200nm、150nm、125nm、110nm、100nm、95nm、90nm、85nm、80nm、75nm、70nm、65nm、60nm、55nm或50nm的大小。

在一些实施方案中，静脉内施用根据本发明的组合物。在一些实施方案中，经由肺递送施用根据本发明的组合物。在一些实施方案中，通过气溶胶化、吸入、雾化或滴注进行肺递送。在一些实施方案中，鞘内施用根据本发明的组合物。在一些实施方案中，组合物被配制成可呼吸颗粒、可雾化脂质、或可吸入干粉。

在一些实施方案中，由所述mRNA编码的蛋白质的表达可于肝、肾、心、脾、血清、脑、骨骼肌、淋巴结、皮肤和/或脑脊液中检测到。

在一些实施方案中，由所述mRNA编码的蛋白质的表达可在施用后6、12、18、24、30、36、42、48、54、60、66和/或72小时检测到。在一些实施方案中，由所述mRNA编码的蛋白质的表达可在施用后1天、2天、3天、4天、5天、6天、和/或7天检测到。在一些实施方案中，由所述mRNA编码的蛋白质的表达可在施用后1周、2周、3周、和/或4周检测到。在一些实施方案中，由所述mRNA编码的蛋白质的表达可在施用后一个月后检测到。

在一些实施方案中，由所述mRNA编码的蛋白质为胞质蛋白质。在一些实施方案中，由所述mRNA编码的蛋白质为分泌蛋白。在一些实施方案中，由所述mRNA编码的蛋白质为酶。在一些实施方案中，所述mRNA具有为或大于约0.5kb、1kb、1.5kb、2kb、2.5kb、3kb、3.5kb、4kb、4.5kb或5kb的长度。在一些实施方案中，由所述mRNA编码的蛋白质为精氨琥珀酸合成酶(ASS1)、因子IX、运动神经元生存蛋白1、或苯丙氨酸羟化酶。

在一些实施方案中，所述mRNA以约0.1–5.0mg/kg体重的剂量范围例如约0.1–4.5、0.1–4.0、0.1–3.5、0.1–3.0、0.1–2.5、0.1–2.0、0.1–1.5、0.1–1.0、0.1-0.5、0.1-0.3、0.3–5.0、0.3-4.5、0.3–4.0、0.3–3.5、0.3–3.0、0.3–2.5、0.3–2.0、0.3–1.5、0.3–1.0、0.3-0.5、0.5–5.0、0.5-4.5、0.5–4.0、0.5–3.5、0.5–3.0、0.5–2.5、0.5–2.0、0.5–1.5、或0.5–1.0mg/kg体重施用。在一些实施方案中，所述mRNA以为或小于约5.0、4.5、4.0、3.5、3.0、2.5、2.0、1.5、1.0、0.8、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1mg/kg体重的剂量施用。

在一些实施方案中，所述mRNA包含一种或多种修饰的核苷酸。在一些实施方案中，所述一种或多种修饰的核苷酸包含假尿苷、N-1-甲基-假尿苷、2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并-嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、O(6)-甲基鸟嘌呤和/或2-硫代胞苷。在一些实施方案中，所述mRNA未被修饰。

本发明的其它特征、目标和优势在以下详细说明、附图和权利要求中是显而易知的。然而，应了解，详细说明、附图和权利要求，虽然指示本发明的实施方案，但是只为了说明来给出，不具有限制性。本发明范围内的各种变化和修饰为本领域技术人员显而易知的。

附图简述

附图仅为说明的目的而非限制。

图1示出在施用含有FIX mRNA的C12-200或cKK-E12脂质体后24小时于经处理小鼠的血清中检测的人因子IX(FIX)的水平的示例性图表。

图2示出在施用后6或24小时于用0.1、0.3、0.6、1.0或3.0mg/kg的两个比率的含有FIX mRNA的cKK-E12脂质体中之一处理的小鼠的血浆中检测的FIX的示例性图表。

图3示出在施用后24小时于用0.1、0.3、0.6、1.0或3.0mg/kg的含有ASS1 mRNA的cKK-E12脂质体处理的小鼠的肝中检测的ASS1蛋白质的水平的示例性图表。

图4示出在施用0.1、0.3、0.6、1.0或3.0mg/kg的含有ASS1 mRNA的cKK-E12脂质体后24小时于肝中ASS1蛋白质水平的示例性蛋白质印迹分析。

图5示出在单次IV注射含有ASS1 mRNA的cKK-E12脂质体(1mg/kg)后0.5、3、6、12、24、48、72小时于小鼠的肝中的ASS1蛋白质水平的示例性图表。也示出在施用后7天ASS1蛋白质的水平。

图6示出在单次IV注射1mg/kg含有ASS1 mRNA的cKK-E12脂质体后0.5、3、6、12、24、48、72小时于肝中的ASS1蛋白质水平的示例性蛋白质印迹分析。也示出在施用后7天ASS1蛋白质的水平。

图7–示出经由原位杂交检测于经处理小鼠的肝中的人ASS1信使RNA。在单剂(1.0mg/kg)的负载ASS1 mRNA的基于MD1的脂质纳米颗粒后施用后至少72小时可观察到外源性mRNA。人ASS1mRNA可在窦内皮细胞和肝细胞中检测。

图8–示出在施用1mg/kg含有ASS1 mRNA的cKK-E12脂质纳米颗粒后24小时于小鼠肝中的ASS1蛋白质水平的示例性免疫组织化学染色。人ASS1蛋白质可在窦内皮细胞和肝细胞中检测。

图9示出在施用1mg/kg含有ASS1 mRNA的cKK-E12脂质体后24小时于小鼠肝中的ASS1蛋白质水平的低放大倍数(4x)免疫组织化学染色。与未经处理的小鼠肝(左)比较表明人ASS1蛋白质在整个肝中的广泛分布。

图10示出说明cKK-E12脂质纳米颗粒经由雾化有效地递送FL mRNA的示例性结果。小鼠暴露于毫克级包封的FL mRNA并且在暴露后24小时进行分析。

图11说明经由蛋白质印迹检测源自被转染进BHK-21细胞内的外源性hSMN-1mRNA的人SMN-1蛋白质。采用各种对人SMN特异性的抗体：(A)以1:1,000稀释的抗-SMN 4F11抗体；(B)以1:10,000稀释的Pierce PA5-27309 a-SMN抗体；和(C)以1:10,000稀释的LSBioC138149a-SMN抗体。

图12A-C说明在鞘内递送后24小时于(A)颈椎、(B)胸椎和(C)腰椎组织中的人运动神经元生存蛋白(hSMN-1)mRNA的多重核酸原位检测。

图13说明在鞘内施用负载人SMN-1mRNA的脂质纳米颗粒后24小时大鼠的脊髓中产生的人SMN-1蛋白质的阳性检测。采用以1:2500稀释度的抗人SMN 4F11抗体。图A表示经处理的大鼠脊髓组织且图B表示未经处理的大鼠脊髓组织。

图14用在脂质(cKK-E12)或聚合(PEI)纳米颗粒制剂内包封的C-端His

图15说明在暴露于FFL/CO-CFTR-C-His

定义

为了更加容易地理解本发明，以下首先对某些术语进行定义。用于以下术语和其它术语的另外的定义将在整个说明书中阐述。本文引用的描述发明背景以及提供另外的关于其实施的细节的出版物和其它参考材料据此通过引用并入。

氨基酸：如本文所使用，术语“氨基酸”，在它的最广泛含义下，是指可并入多肽链中的任何化合物和/或物质。在一些实施方案中，氨基酸具有一般结构H

动物：如本文所使用，术语“动物”是指动物界的任何成员。在一些实施方案中，“动物”是指在任何发育阶段下的人。在一些实施方案中，“动物”是指在任何发育阶段下的非人动物。在某些实施方案中，非人动物为哺乳动物(例如，啮齿动物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、猫、绵羊、牛、灵长类动物和/或猪)。在一些实施方案中，动物包括但不限于哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼、昆虫和/或蠕虫。在一些实施方案中，动物可为转基因动物、遗传工程化的动物和/或克隆。

大约或约：如本文所使用，在应用于一个或多个目标值时，术语“大约”或“约”是指类似于所说明的参考值的值。在某些实施方案中，术语“大约”或“约”是指落在所说明的参考值的任一方向上的(大于或小于)25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小范围内的值范围，除非另外说明或以其它方式从上下文显而易见(除了此类数字将超过可能值的100％)。

递送：如本文所使用，术语“递送”涵盖局部递送和全身递送。例如，递送mRNA涵盖mRNA被递送至靶组织并且编码蛋白质被表达且保持在靶组织内的情况(也被称为“局部分布”或“局部递送”)，以及mRNA被递送至靶组织并且编码蛋白质被表达且分泌到患者的循环系统(例如，血清)内且全身分布并被其它组织吸收的情况(也被称为“全身分布”或“全身递送)。

表达：如本文所使用，核酸序列的“表达”是指mRNA翻译成多肽，多个多肽(例如，抗体的重链或轻链)装配成完整蛋白质(例如，抗体)和/或多肽或完全装配的蛋白质(例如，抗体)的翻译后修饰。在本申请中，术语“表达”和“产生”及语法等效物可互换地使用。

官能化：如本文所使用，“官能化”生物分子为呈其展现出具有特征的性质和/或活性的形式的生物分子。

半衰期：如本文所使用，术语“半衰期”是诸如核酸或蛋白浓度或活性的量降至其在时间段开始测量的值的半数所需的时间。

改进、增加或减少：如本文所使用，术语“改进”、“增加”或“减少”或语法等效物指示相对于基线测量的值，如在开始本文所述治疗之前的同一个体中的测量，或在不存在本文所述治疗时的对照受试者(或多个对照受试者)中的测量。“对照受试者”是与所治疗受试者大约相同年龄的罹患与所治疗受试者相同形式疾病的受试者。

体外：如本文所使用，术语“体外”是指发生在人工环境中，例如试管或反应容器中、细胞培养物等中，而不是在多细胞生物体内的事件。

体内：如本文所使用，术语“体内”是指发生在多细胞生物体，如人和非人动物内的事件。在基于细胞的系统的情况下，该术语可用于指在活细胞(如与例如体外系统相反)内发生的事件。

分离的：如本文所使用，术语“分离的”是指(1)已与当起初产生时其所结合(不管在自然界中和/或在实验环境中)的组分中的至少一些分离的，和/或(2)已借助人手产生、制备和/或制造的物质和/或实体。分离的物质和/或实体可与它们起初所结合的其它组分的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、或大于约99％分离。在一些实施方案中，分离的剂为约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、或大于约99％纯。如本文所使用，如果物质基本上不含其它组分，则其为“纯的”。如本文所使用，对分离的物质和/或实体的纯度百分比的计算不应包括赋形剂(例如，缓冲液、溶剂、水等)。

局部分布或递送：如本文所使用，术语“局部分布”、“局部递送”或语法等效物是指组织特异性递送或分布。通常，局部分布或递送需要由mRNA编码的蛋白质(例如，酶)在细胞内翻译并表达或在避免进入患者的循环系统的情况下有限分泌。

信使RNA(mRNA)：如本文所使用，术语“信使RNA(mRNA)”是指编码至少一个多肽的多核苷酸。如本文所使用的mRNA涵盖修饰和未修饰的RNA。mRNA可含有一个或多个编码和非编码区域。mRNA可从天然来源纯化、使用重组表达系统来产生并且任选地纯化、化学合成等。在适当情况下，例如，在化学合成分子的情况下，mRNA可包括核苷类似物如具有化学修饰的碱基或糖、骨架修饰等的类似物。除非另外指示，否则mRNA序列以5’至3’方向来呈现。在一些实施方案中，mRNA为或包含天然核苷(例如，腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷)；核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并-嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、O(6)-甲基鸟嘌呤和2-硫代胞苷)；化学修饰的碱基；生物修饰的碱基(例如，甲基化碱基)；夹层碱基；经修饰的糖(例如，2’-氟核糖、核糖、2’-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)；和/或经修饰的磷酸酯基团(例如，硫代磷酸酯和5’-N-亚磷酰胺键)。

在一些实施方案中，所述mRNA包含一个或多个非标准核苷酸残基。非标准核苷酸残基可以包括，例如，5-甲基-胞苷(“5mC”)、假尿苷(“ψU”)、和/或2-硫代-尿苷(“2sU”)。参见，例如，用于论述此类残基及其并入mRNA内的美国专利No.8,278,036或WO2011012316。mRNA可以是RNA，其被定义为RNA，其中25％的U残基为2-硫代-尿苷且25％的C残基为5-甲基胞苷。用于使用RNA的教义是公开的美国专利公布US20120195936和国际公布WO2011012316，这两者据此通过引用整体并入。非标准核苷酸残基的存在可致使mRNA比具有相同序列但仅含有标准残基的对照mRNA具有更高的稳定性和/或更低的免疫原性。在另外的实施方案中，所述mRNA可包含选自以下的一个或多个非标准核苷酸残基：异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、肌苷、二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤胞嘧啶、以及这些修饰与其它核碱基修饰的组合。某些实施方案还可以包括对呋喃糖环或核碱基的额外修饰。额外修饰可以包括，例如，糖修饰或取代(例如，2′-O-烷基修饰、锁核酸(LNA)的一种或多种)。在一些实施方案中，RNA可与额外多核苷酸和/或肽多核苷酸(PNA)复合或杂交。在糖修饰为2′-O-烷基修饰的实施方案中，此类修饰可以包括但不限于2′-脱氧-2′-氟修饰、2′-O-甲基修饰、2′-O-甲氧基乙基修饰和2′-脱氧修饰。在某些实施方案中，任何这些修饰可存在于0-100％的核苷酸中—例如，大于0％、1％、10％、25％、50％、75％、85％、90％、95％、或100％的单独或组合的组分核苷酸。

核酸：如本文所使用，术语“核酸”，在它的最广泛含义下，是指并入或可并入多核苷酸链中的任何化合物和/或物质。在一些实施方案中，核酸是经由磷酸二酯键并入或可并入多核苷酸链中的化合物和/或物质。在一些实施方案中，“核酸”是指个别核酸残基(例如，核苷酸和/或核苷)。在一些实施方案中，“核酸”是指包括个别核酸残基的多核苷酸链。在一些实施方案中，“核酸”涵盖RNA以及单链和/或双链DNA和/或cDNA。

患者：如本文所使用，术语“患者”或“受试者”是指例如出于实验、诊断、预防、美容和/或治疗目的可向其施用提供的组合物的任何生物体。典型患者包括动物(例如，哺乳动物如小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物和/或人)。在某些实施方案中，患者为人。人包括出生前和出生后形式。

药学上可接受的：如本文所使用的短语“药学上可接受的”是指在合理医学判断范围内、适用于与人类和动物组织接触而没有过量毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症、与合理的利益/风险比相称的物质。

全身分布或递送：如本文所使用，术语“全身分布”、“全身递送”或语法等效物是指影响整个身体或整个生物体的递送或分布机制或方法。通常，全身分布或递送经由身体的循环系统例如血流来完成。与“局部分布或递送”的定义相比较。

受试者：如本文所使用，术语“受试者”是指人或任何非人动物(例如，小鼠、大鼠、兔、犬、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类动物)。人包括出生前和出生后形式。在许多实施方案中，受试者是人类。受试者可为患者，是指送至医疗服务提供者以诊断或治疗疾病的人。术语“受试者”在本文中可与“个体”或“患者”互换使用。受试者可罹患或易患疾病或病症但是可显示或可不显示疾病或病症的症状。

基本上：如本文所使用，术语“基本上”是指展现出关注的特征或性质的全部或接近全部的范围或程度的定性条件。生物领域普通技术人员将理解生物和化学现象很少(如果有的话)完成和/或进行至完整性或实现或避免绝对结果。术语“基本上”因此在本文用于捕获在许多生物和化学现象中固有的完整性的可能缺失。

靶组织：如本文所使用，术语“靶组织”是指受待治疗的疾病影响的任何组织。在一些实施方案中，靶组织包括显示疾病相关病理学、症状或特征的那些组织。

治疗有效量：如本文所使用，术语治疗剂的“治疗有效量”意指在施用至罹患或易患疾病、病症和/或病状的受试者时足以治疗、诊断、预防疾病、病症和/或病状的症状和/或延迟其发作的量。本领域普通技术人员将认识到治疗有效量通常经由包括至少一个单位剂量的给药方案来施用。

治疗：如本文所使用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指用于部分或完全减轻、改善、缓解、抑制、防止、延迟特定疾病、病症和/或病状的发作，减少其严重性，和/或减少其一个或多个症状或特征的发生的任何方法。为了减少发展与疾病相关的病理学的风险，可向未展现疾病的症状和/或仅展现疾病的早期症状的受试者施用治疗。

详细描述

本发明尤其提供了使用并入本文所述的阳离子脂质的改进的脂质体用于体内递送mRNA的方法和组合物。

用于mRNA递送的脂质体

如本文所使用，术语“脂质体”是指任何层状、多层或固体脂质纳米颗粒囊泡。通常，如本文所使用的脂质体可通过混合一种或多种脂质或通过混合一种或多种脂质和聚合物而形成。因此，如本文所使用的术语“脂质体”涵盖基于脂质和聚合物的纳米颗粒。特别地，根据本发明的脂质体并入本文所述的阳离子脂质。作为非限制性实例，适用于本发明的阳离子脂质为cKK-E12、或(3,6-双(4-(双(2-羟基十二烷基)氨基)丁基)哌嗪-2,5-二酮)，如在下文更详细地描述。合适的脂质体也可包含第二或额外阳离子脂质、辅助脂质(例如，非阳离子脂质和/或基于胆固醇的脂质)、PEG-修饰的脂质、和/或聚合物。

在一些实施方案中，阳离子脂质(例如，cKK-E12)构成约30-50％(例如，约30-45％、约30-40％、约35-50％、约35-45％、或约35-40％)摩尔比的脂质体。在一些实施方案中，阳离子脂质(例如，cKK-E12)构成约30％、约35％、约40％、约45％、或约50％摩尔比的脂质体。

阳离子脂质

在一些实施方案中，提供的脂质体或提供的组合物包含根据式I的阳离子脂质：

或其药学上可接受的盐，

其中：

p是1至9之间的整数，包括端值；

Q的每个实例独立地为O、S或NR

R

R

L是任选取代的亚烷基、任选取代的亚烯基、任选取代的亚炔基、任选取代的亚杂烷基、任选取代的亚杂烯基、任选取代的亚杂炔基、任选取代的亚碳环基、任选取代的亚杂环基、任选取代的亚芳基、或任选取代的亚杂芳基、或其组合，以及

每个R

每次出现的R

R

式(i)、(ii)和(iii)为：

R’的每个实例独立地为氢或任选取代的烷基；

X为O、S或NR

R

Y为O、S或NR

R

R

R

前提条件是R

在一些实施方案中，在提供的组合物或方法中的阳离子脂质为式I的化合物。在一些实施方案中，在提供的组合物或方法中的阳离子脂质为式I的化合物，其中所述化合物包含一个或多个碱性基团。在一些实施方案中，在提供的组合物或方法中的阳离子脂质为式I的化合物，其中所述化合物包含一个或多个氨基。

在某些实施方案中，式(i)的基团表示式(i-a)的基团或式(i-b)的基团：

其中每个变量独立地如上文定义且本文描述。在一些实施方案中，式(i)的基团为式(i-a)的基团。在一些实施方案中，式(i)的基团为式(i-b)的基团。

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，每个R

在一些实施方案中，R’的每个实例为氢。

在一些实施方案中，L是任选取代的亚烷基。

在一些实施方案中，式(iv)的基团为式

如上文一般定义的，p是1至9之间的整数，包括端值。在某些实施方案中，p为1。在某些实施方案中，p为2。在某些实施方案中，p为3。在某些实施方案中，p为4。在某些实施方案中，p为5。在某些实施方案中，p为6。在某些实施方案中，p为7。在某些实施方案中，p为8。在某些实施方案中，p为9。

在一些实施方案中，p为1。在一些实施方案中，式I的化合物为式(I-a)的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中每个变量独立地如上文定义且本文描述。

在一些实施方案中，p为2。在一些实施方案中，式I的化合物为式(I-p2)的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中每个变量独立地如上文定义且本文描述。

在一些实施方案中，p为3。在一些实施方案中，式I的化合物为式(I-p3)的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中每个变量独立地如上文定义且本文描述。

在一些实施方案中，p为4。在一些实施方案中，式I的化合物为式(I-p4)的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中每个变量独立地如上文定义且本文描述。

在一些实施方案中，p为5。在一些实施方案中，式I的化合物为式(I-p5)的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中每个变量独立地如上文定义且本文描述。

在一些实施方案中，p为6。在一些实施方案中，式I的化合物为式(I-p6)的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中每个变量独立地如上文定义且本文描述。

在一些实施方案中，p为7。在一些实施方案中，式I的化合物为式(I-p7)的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中每个变量独立地如上文定义且本文描述。

在一些实施方案中，p为8。在一些实施方案中，式I的化合物为式(I-p8)的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中每个变量独立地如上文定义且本文描述。

在一些实施方案中，p为9。在一些实施方案中，式I的化合物为式(I-p9)的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中每个变量独立地如上文定义且本文描述。

如上文一般定义的，Q的每个实例独立地为O、S或NR

在某些实施方案中，Q的至少一个实例为O。在某些实施方案中，Q的每个实例为O。在某些实施方案中，Q的至少一个实例为S。在某些实施方案中，Q的每个实例为S。在某些实施方案中，Q的至少一个实例为NR

如上文一般定义的，R

在一些实施方案中，R

如上文一般定义的，R

在一些实施方案中，R

在某些实施方案中，R

在某些实施方案中，R

在某些实施方案中，R

在某些实施方案中，R

在某些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在某些实施方案中，R

在某些实施方案中，R

在某些实施方案中，R

其中：

L是任选取代的亚烷基、任选取代的亚烯基、任选取代的亚炔基、任选取代的亚杂烷基、任选取代的亚杂烯基、任选取代的亚杂炔基、任选取代的亚碳环基、任选取代的亚杂环基、任选取代的亚芳基、或任选取代的亚杂芳基、或其组合；以及

每个R

其中每个R’、Y、R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在某些实施方案中，R

在某些实施方案中，L是任选取代的亚烷基；例如，任选取代的C

在某些实施方案中，L是任选取代的亚烯基，例如，任选取代的C

在某些实施方案中，L是任选取代的亚炔基，例如，任选取代的C

在某些实施方案中，L是任选取代的亚杂烷基；例如，任选取代的杂C

在某些实施方案中，L是任选取代的亚杂烯基，例如，任选取代的杂C

在某些实施方案中，L是任选取代的亚杂炔基，例如，任选取代的杂C

在某些实施方案中，L是任选取代的亚碳环基，例如，任选取代的C

在某些实施方案中，L是任选取代的亚杂环基，例如，任选取代的3-14元亚杂环基、任选取代的3-10元亚杂环基、任选取代的5-8元亚杂环基、任选取代的5-6元亚杂环基、任选取代的5-元亚杂环基、或任选取代的6-元亚杂环基。

在某些实施方案中，L是任选取代的亚芳基，例如，任选取代的亚苯基。在一些实施方案中，L为任选取代的亚苯基。在一些实施方案中，L为取代的亚苯基。在一些实施方案中，L为未取代的亚苯基。

在某些实施方案中，L是任选取代的亚杂芳基，例如，任选取代的5-14元亚杂芳基、任选取代的5-10元亚杂芳基、任选取代的5-6元亚杂芳基、任选取代的5-元亚杂芳基、或任选取代的6-元亚杂芳基。

在某些实施方案中，其中L是任选取代的亚烷基，式(iv)的基团为式

在某些实施方案中，q为1至40之间的整数，包括端值。在某些实施方案中，q为1至30之间的整数，包括端值。在某些实施方案中，q为1至20之间的整数，包括端值。在某些实施方案中，q为1至10之间的整数，包括端值。在某些实施方案中，q为4至20之间的整数，包括端值。在某些实施方案中，q为6至20之间的整数，包括端值。在某些实施方案中，q为2至10之间的整数，包括端值。在某些实施方案中，q为2至9之间的整数，包括端值。在某些实施方案中，q为2至8之间的整数，包括端值。在某些实施方案中，q为2至7之间的整数，包括端值。在某些实施方案中，q为2至6之间的整数，包括端值。在某些实施方案中，q为2至5之间的整数，包括端值。在某些实施方案中，q为2至4之间的整数，包括端值。在某些实施方案中，q为3至10之间的整数，包括端值。在某些实施方案中，q为3至8之间的整数，包括端值。在某些实施方案中，q为3至7之间的整数，包括端值。在某些实施方案中，q为3至6之间的整数，包括端值。在某些实施方案中，q为3至5之间的整数，包括端值。在某些实施方案中，q为3或4。在某些实施方案中，q为3至9之间的整数，包括端值。在某些实施方案中，q为8至20之间的整数，包括端值。在某些实施方案中，q为1。在某些实施方案中，q为2。在某些实施方案中，q为3。在某些实施方案中，q为4。在某些实施方案中，q为5。在某些实施方案中，q为6。在某些实施方案中，q为7。在某些实施方案中，q为8。在某些实施方案中，q为9。在某些实施方案中，q为10。

如上文一般定义的，每个R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，例如，在任意上述实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，例如，在任意上述实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，例如，在任意上述实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

如上文一般定义的，每个R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，例如，在任意上述实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，例如，在任意上述实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，例如，在任意上述实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在某些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

如上文一般定义的，每次出现的R

在一些实施方案中，R

如上文一般定义的，R

其中每个R’、Y、R

在一些实施方案中，R

在某些实施方案中，R

在某些实施方案中，R

在某些实施方案中，R

在某些实施方案中，R

在某些实施方案中，R

在某些实施方案中，R

在某些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在某些实施方案中，R

在某些实施方案中，R

如上文一般定义的，R’的每个实例独立地为氢或任选取代的烷基。在一些实施方案中，R’为氢。在一些实施方案中，R’为取代的烷基。在某些实施方案中，R’的至少一个实例为氢。在某些实施方案中，R’的至少两个实例为氢。在某些实施方案中，R’的每个实例为氢。在某些实施方案中，R’的至少一个实例为任选取代的烷基，例如，甲基。在某些实施方案中，R’的至少两个实例任选取代的烷基，例如，甲基。在一些实施方案中，R’的至少一个实例为氢，且R’的至少一个实例为任选取代的烷基。在某些实施方案中，R’的一个实例为任选取代的烷基，其余为氢。

如上文一般定义的，X为O、S或NR

如上文一般定义的，R

如上文一般定义的，Y为O、S或NR

如上文一般定义的，R

如上文一般定义的，R

如上文一般定义的，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，例如，在任意上述实施方案中，R

在某些实施方案中，R

在某些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，例如，在任意上述实施方案中，R

示例性未取代的烯基包括但不限于：

在一些实施方案中，其中R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，例如，在任意上述实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，例如，在任意上述实施方案中，R

示例性未取代的杂烷基包括但不限于：

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，例如，在任意上述实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，例如，在任意上述实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，当R

在一些实施方案中，R

本文设想式I的上述实施方案的各种组合。

在一些实施方案中，其中Q的每个实例为O，式I的化合物为式I-a的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中每个变量独立地如上文定义且本文描述。

在某些实施方案中，至少一个R

在一些实施方案中，其中至少一个R

或其药学上可接受的盐，其中每个变量独立地如上文定义且本文描述。

在某些实施方案中，R

在一些实施方案中，其中R

或其药学上可接受的盐，其中每个变量独立地如上文定义且本文描述。

在某些实施方案中，R

在一些实施方案中，p＝1。在一些实施方案中，式I-c的化合物为式I-c1的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中每个变量独立地如上文定义且本文描述。

在某些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

或其药学上可接受的盐，其中每个变量独立地如上文定义且本文描述。

在某些实施方案中，L是任选取代的亚烷基。在某些实施方案中，R

在一些实施方案中，L是任选取代的亚烷基。在一些实施方案中，式I-c的化合物为式I-c3的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中每个变量独立地如上文定义且本文描述。

在一些实施方案中，q为1至10之间的整数，包括端值。在某些实施方案中，R

在一些实施方案中，式I的化合物为式I-d的化合物：

其中每个p、R

在一些实施方案中，式I的化合物为式I-e的化合物：

其中每个R

在一些实施方案中，式I的化合物为式I-f的化合物：

其中每个R

在一些实施方案中，提供的脂质体包括WO 2013063468和在与本申请于同一日期同时提交的标题为“Lipid Formulations for Delivery of Messenger RNA”的美国临时申请中描述的阳离子脂质，该两篇文献通过引用并入本文。在一些实施方案中，式I的化合物为式I-c1-a的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中：

每个R

每个q独立地为2至6；

每个R'独立地为氢或C

且每个R

在一些实施方案中，每个R

在一些实施方案中，每个q独立地为3至6。在一些实施方案中，每个q独立地为3至5。在一些实施方案中，每个q为4。

在一些实施方案中，每个R'独立地为氢、甲基或乙基。在一些实施方案中，每个R'独立地为氢或甲基。在一些实施方案中，每个R'独立地为氢。

在一些实施方案中，每个R

在一些实施方案中，每个R

在一些实施方案中，每个R

在一些实施方案中，每个R

在一些实施方案中，式I的化合物为式I-g的化合物：

其中每个R

在一些实施方案中，式I的化合物为式X的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中每个变量独立地如上文定义且本文描述。

在一些实施方案中，式I的化合物为式X-1的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中每个R

在一些实施方案中，式I的化合物为

或其药学上可接受的盐。

适用于本发明的阳离子脂质的另外实例于WO 2013063468中描述，其通过引用整体并入本文。

化学定义

下文更详细地描述特定官能团和化学术语的定义。化学元素是根据元素周期表(Periodic Table of the Elements)，CAS版本，化学与物理手册(Handbook of Chemistryand Physics)，第75版，内封面来鉴定，并且特定官能团一般如其中所描述来定义。此外，有机化学的一般原理以及特定官能部分和反应性描述于以下中：Organic Chemistry,ThomasSorrell,University Science Books,Sausalito,1999；Smith和March March’s AdvancedOrganic Chemistr,第5版，John Wiley&Sons,Inc.,New York,2001；Larock,Comprehensive Organic Transformations,VCH Publishers,Inc.,New York,1989；和Carruthers,Some Modern Methods of Organic Synthesis,第3版，CambridgeUniversity Press,Cambridge,1987。

本文所述的化合物可包含一个或多个不对称中心，并且因此可以不同同分异构形式存在，例如，对映异构体和/或非对映异构体。例如，本文所述的化合物可以呈单独的对映异构体、非对映异构体或几何异构体的形式，或可以呈立体异构体的混合物的形式，包括外消旋混合物和富含一种或多种立体异构体的混合物。可以通过本领域技术人员已知的方法，包括手性高效液相色谱(HPLC)和手性盐的形成和结晶来从混合物中分离异构体；或可以通过不对称合成来制备优选的异构体。参见，例如，Jacques等人,Enantiomers,Racemates and Resolutions(Wiley Interscience,New York,1981)；Wilen等人,Tetrahedron 33:2725(1977)；Eliel,E.L.Stereochemistry of Carbon Compounds(McGraw-Hill,NY,1962)；和Wilen,S.H.Tables of Resolving Agents and OpticalResolutions第268页(E.L.Eliel编,Univ.of Notre Dame Press,Notre Dame,IN 1972)。本发明此外设想作为基本上不含其它异构体的单独异构体、以及可选地，作为各种异构体的混合物的化合物。

当列出值的范围时，意图涵盖该范围内的每个值和子范围。例如，“C1-6烷基”旨在涵盖C1、C2、C3、C4、C5、C6、C1-6、C1-5、C1-4、C1-3、C1-2、C2-6、C2-5、C2-4、C2-3、C3-6、C3-5、C3-4、C4-6、C4-5、以及C5-6烷基。

如本文所使用，“烷基”是指具有1至50个碳原子的直链或支链饱和烃基的基团(“C1-50烷基”)。在一些实施方案中，烷基具有1至40个碳原子(“C1-40烷基”)。在一些实施方案中，烷基具有1至30个碳原子(“C1-30烷基”)。在一些实施方案中，烷基具有1至20个碳原子(“C1-20烷基”)。在一些实施方案中，烷基具有1至10个碳原子(“C1-10烷基”)。在一些实施方案中，烷基具有1至9个碳原子(“C1-9烷基”)。在一些实施方案中，烷基具有1至8个碳原子(“C1-8烷基”)。在一些实施方案中，烷基具有1至7个碳原子(“C1-7烷基”)。在一些实施方案中，烷基具有1至6个碳原子(“C1-6烷基”)。在一些实施方案中，烷基具有1至5个碳原子(“C1-5烷基”)。在一些实施方案中，烷基具有1至4个碳原子(“C1-4烷基”)。在一些实施方案中，烷基具有1至3个碳原子(“C1-3烷基”)。在一些实施方案中，烷基具有1至2个碳原子(“C1-2烷基”)。在一些实施方案中，烷基具有1个碳原子(“C1烷基”)。在一些实施方案中，烷基具有2至6个碳原子(“C2-6烷基”)。C1-6烷基的实例包括但不限于，甲基(C1)、乙基(C2)、正丙基(C3)、异丙基(C3)、正丁基(C4)、叔丁基(C4)、仲丁基(C4)、异丁基(C4)、正戊基(C5)、3-戊烷基(C5)、戊基(C5)、新戊基(C5)、3-甲基-2-丁烷基(C5)、叔戊基(C5)、以及正己基(C6)。烷基的另外实例包括正庚基(C7)、正辛基(C8)等。除非另有说明，否则烷基的每种情况独立地为未取代的(“未取代的烷基”)或被一个或多个取代基取代的(“取代的烷基”)。在某些实施方案中，烷基为未取代的C1-50烷基。在某些实施方案中，烷基为取代的C1-50烷基。

如本文所使用，“杂烷基”是指如本文所定义的烷基，该烷基还包括在母链内(即，插入其的相邻碳原子之间)和/或放置在母链的一个或多个末端位置处的选自氧、硫、氮、硼、硅和磷的至少一个杂原子(例如，1至25个，例如，1、2、3、或4个杂原子)。在某些实施方案中，杂烷基是指在母链内具有1至50个碳原子和1或多个杂原子的饱和基团(“杂C1-50烷基”)。在某些实施方案中，杂烷基是指在母链内具有1至40个碳原子和1或多个杂原子的饱和基团(“杂C1-40烷基”)。在某些实施方案中，杂烷基是指在母链内具有1至30个碳原子和1或多个杂原子的饱和基团(“杂C1-30烷基”)。在某些实施方案中，杂烷基是指在母链内具有1至20个碳原子和1或多个杂原子的饱和基团(“杂C1-20烷基”)。在某些实施方案中，杂烷基是指在母链内具有1至10个碳原子和1或多个杂原子的饱和基团(“杂C1-10烷基”)。在一些实施方案中，杂烷基是指在母链内具有1至9个碳原子和1或多个杂原子的饱和基团(“杂C1-9烷基”)。在一些实施方案中，杂烷基是指在母链内具有1至8个碳原子和1或多个杂原子的饱和基团(“杂C1-8烷基”)。在一些实施方案中，杂烷基是指在母链内具有1至7个碳原子和1或多个杂原子的饱和基团(“杂C1-7烷基”)。在一些实施方案中，杂烷基是指在母链内具有1至6个碳原子和1或多个杂原子的饱和基团(“杂C1-6烷基”)。在一些实施方案中，杂烷基是指在母链内具有1至5个碳原子和1或2个杂原子的饱和基团(“杂C1-5烷基”)。在一些实施方案中，杂烷基是指在母链内具有1至4个碳原子和1或2个杂原子的饱和基团(“杂C1-4烷基”)。在一些实施方案中，杂烷基是指在母链内具有1至3个碳原子和1个杂原子的饱和基团(“杂C1-3烷基”)。在一些实施方案中，杂烷基是指在母链内具有1至2个碳原子和1个杂原子的饱和基团(“杂C1-2烷基”)。在一些实施方案中，杂烷基是具有1个碳原子和1个杂原子的饱和基团(“杂C1烷基”)。在一些实施方案中，杂烷基是在母链内具有2至6个碳原子和1或2个杂原子的饱和基团(“杂C2-6烷基”)。除非另有说明，否则杂烷基的每个实例独立地是未取代的(“未取代的杂烷基”)或被一个或多个取代基取代的(“取代的杂烷基”)。在某些实施方案中，杂烷基为未取代的杂C1-50烷基。在某些实施方案中，杂烷基为取代的杂C1-50烷基。

如本文所使用，“烯基”是指具有2至50个碳原子和一个或多个碳-碳双键(例如，1、2、3、或4个双键)的直链或支链烃基的基团(“C2-50烯基”)。在一些实施方案中，烯基具有2至40个碳原子(“C2-40烯基”)。在一些实施方案中，烯基具有2至30个碳原子(“C2-30烯基”)。在一些实施方案中，烯基具有2至20个碳原子(“C2-20烯基”)。在一些实施方案中，烯基具有2至10个碳原子(“C2-10烯基”)。在一些实施方案中，烯基具有2至9个碳原子(“C2-9烯基”)。在一些实施方案中，烯基具有2至8个碳原子(“C2-8烯基”)。在一些实施方案中，烯基具有2至7个碳原子(“C2-7烯基”)。在一些实施方案中，烯基具有2至6个碳原子(“C2-6烯基”)。在一些实施方案中，烯基具有2至5个碳原子(“C2-5烯基”)。在一些实施方案中，烯基具有2至4个碳原子(“C2-4烯基”)。在一些实施方案中，烯基具有2至3个碳原子(“C2-3烯基”)。在一些实施方案中，烯基具有2个碳原子(“C2烯基”)。一个或多个碳-碳双键可以是内部的(如在2-丁烯基中)或末端的(如在1-丁烯基中)。C2-4烯基的实例包括但不限于，乙烯基(C2)、1-丙烯基(C3)、2-丙烯基(C3)、1-丁烯基(C4)、2-丁烯基(C4)、丁二烯基(C4)等。C2-6烯基的实例包括前述C2-4烯基以及戊烯基(C5)、戊二烯基(C5)、己烯基(C6)等。烯基的另外实例包括庚烯基(C7)、辛烯基(C8)、辛三烯基(C8)等。除非另有说明，否则烯基的每个实例独立地为未取代的(“未取代的烯基”)或被一个或多个取代基取代的(“取代的烯基”)。在某些实施方案中，烯基为未取代的C2-50烯基。在某些实施方案中，烯基为取代的C2-50烯基。

如本文所使用，“杂烯基”是指如本文所定义的烯基，该烯基还包括在母链内(即，插入其的相邻碳原子之间)和/或放置在母链的一个或多个末端位置处的选自氧、硫、氮、硼、硅和磷的至少一个杂原子(例如，1至25个，例如，1、2、3、或4个杂原子)。在某些实施方案中，杂烯基是指在母链内具有2至50个碳原子、至少一个双键、以及1或多个杂原子的基团(“杂C2-50烯基”)。在某些实施方案中，杂烯基是指在母链内具有2至40个碳原子、至少一个双键、以及1或多个杂原子的基团(“杂C2-40烯基”)。在某些实施方案中，杂烯基是指在母链内具有2至30个碳原子、至少一个双键、以及1或多个杂原子的基团(“杂C2-30烯基”)。在某些实施方案中，杂烯基是指在母链内具有2至20个碳原子、至少一个双键、以及1或多个杂原子的基团(“杂C2-20烯基”)。在某些实施方案中，杂烯基是指在母链内具有2至10个碳原子、至少一个双键、以及1或多个杂原子的基团(“杂C2-10烯基”)。在一些实施方案中，杂烯基在母链内具有2至9个碳原子、至少一个双键、以及1或多个杂原子(“杂C2-9烯基”)。在一些实施方案中，在母链内具有2至8个碳原子、至少一个双键、以及1或多个杂原子(“杂C2-8烯基”)。在一些实施方案中，杂烯基在母链内具有2至7个碳原子、至少一个双键、以及1或多个杂原子(“杂C2-7烯基”)。在一些实施方案中，杂烯基在母链内具有2至6个碳原子、至少一个双键、以及1或多个杂原子(“杂C2-6烯基”)。在一些实施方案中，杂烯基在母链内具有2至5个碳原子、至少一个双键、以及1或2个杂原子(“杂C2-5烯基”)。在一些实施方案中，杂烯基在母链内具有2至4个碳原子、至少一个双键、以及2个杂原子(“杂C2-4烯基”)。在一些实施方案中，杂烯基在母链内具有2至3个碳原子、至少一个双键、以及1个杂原子(“杂C2-3烯基”)。在一些实施方案中，杂烯基在母链内具有2至6个碳原子、至少一个双键、以及1或2个杂原子(“杂C2-6烯基”)。除非另有说明，否则杂烯基的每个实例独立地为未取代的(“未取代的杂烯基”)或被一个或多个取代基取代的(“取代的杂烯基”)。在某些实施方案中，杂烯基为未取代的杂C2-50烯基。在某些实施方案中，杂烯基为取代的杂C2-50烯基。

如本文所使用，“炔基”是指具有2至50个碳原子和一个或多个碳-碳三键(例如，1、2、3、或4个三键)以及任选地一个或多个双键(例如，1、2、3、或4个双键)的直链或支链烃基的基团(“C2-50炔基”)。具有一个或多个三键和一个或多个双键的炔基还被称为“烯-炔”。在一些实施方案中，炔基具有2至40个碳原子(“C2-40炔基”)。在一些实施方案中，炔基具有2至30个碳原子(“C2-30炔基”)。在一些实施方案中，炔基具有2至20个碳原子(“C2-20炔基”)。在一些实施方案中，炔基具有2至10个碳原子(“C2-10炔基”)。在一些实施方案中，炔基具有2至9个碳原子(“C2-9炔基”)。在一些实施方案中，炔基具有2至8个碳原子(“C2-8炔基”)。在一些实施方案中，炔基具有2至7个碳原子(“C2-7炔基”)。在一些实施方案中，炔基具有2至6个碳原子(“C2-6炔基”)。在一些实施方案中，炔基具有2至5个碳原子(“C2-5炔基”)。在一些实施方案中，炔基具有2至4个碳原子(“C2-4炔基”)。在一些实施方案中，炔基具有2至3个碳原子(“C2-3炔基”)。在一些实施方案中，炔基具有2个碳原子(“C2炔基”)。一个或多个碳-碳三键可以是内部的(如在2-丁炔基中)或末端的(如在1-丁炔基中)。C2-4炔基的实例包括但不限于，乙炔基(C2)、1-丙炔基(C3)、2-丙炔基(C3)、1-丁炔基(C4)、2-丁炔基(C4)等。C2-6炔基的实例包括前述C2-4炔基以及戊炔基(C5)、己炔基(C6)等。炔基的另外实例包括庚炔基(C7)、辛炔基(C8)等。除非另外说明，否则炔基的每个实例独立地为未取代的(“未取代的炔基”)或被一个或多个取代基取代的(“取代的炔基”)。在某些实施方案中，炔基为未取代的C2-50炔基。在某些实施方案中，炔基为取代的C2-50炔基。

如本文所使用，“杂炔基”是指如本文所定义的炔基，该炔基还包括在母链内(即，插入其的相邻碳原子之间)和/或放置在母链的一个或多个末端位置处的选自氧、硫、氮、硼、硅和磷的至少一个杂原子(例如，1至25个，例如，1、2、3、或4个杂原子)。在某些实施方案中，杂炔基是指在母链内具有2至50个碳原子、至少一个三键、以及1或多个杂原子的基团(“杂C2-50炔基”)。在某些实施方案中，杂炔基是指在母链内具有2至40个碳原子、至少一个三键、以及1或多个杂原子的基团(“杂C2-40炔基”)。在某些实施方案中，杂炔基是指在母链内具有2至30个碳原子、至少一个三键、以及1或多个杂原子的基团(“杂C2-30炔基”)。在某些实施方案中，杂炔基是指在母链内具有2至20个碳原子、至少一个三键、以及1或多个杂原子的基团(“杂C2-20炔基”)。在某些实施方案中，杂炔基是指在母链内具有2至10个碳原子、至少一个三键、以及1或多个杂原子的基团(“杂C2-10炔基”)。在一些实施方案中，杂炔基在母链内具有2至9个碳原子、至少一个三键、以及1或多个杂原子(“杂C2-9炔基”)。在一些实施方案中，杂炔基在母链内具有2至8个碳原子、至少一个三键、以及1或多个杂原子(“杂C2-8炔基”)。在一些实施方案中，杂炔基在母链内具有2至7个碳原子、至少一个三键、以及1或多个杂原子(“杂C2-7炔基”)。在一些实施方案中，杂炔基在母链内具有2至6个碳原子、至少一个三键、以及1或多个杂原子(“杂C2-6炔基”)。在一些实施方案中，杂炔基在母链内具有2至5个碳原子、至少一个三键、以及1或2个杂原子(“杂C2-5炔基”)。在一些实施方案中，杂炔基在母链内具有2至4个碳原子、至少一个三键、以及2个杂原子(“杂C2-4炔基”)。在一些实施方案中，杂炔基在母链内具有2至3个碳原子、至少一个三键、以及1个杂原子(“杂C2-3炔基”)。在一些实施方案中，杂炔基在母链内具有2至6个碳原子、至少一个三键、以及1或2个杂原子(“杂C2-6炔基”)。除非另有说明，否则杂炔基的每个实例独立地为未取代的(”未取代的杂炔基”)或被一个或多个取代基取代的(“取代的杂炔基”)。在某些实施方案中，杂炔基为未取代的杂C2-50炔基。在某些实施方案中，杂炔基为取代的杂C2-50炔基。

如本文所使用，“碳环基”或“碳环”是指在非芳族环系统中具有3至10个环碳原子(“C3-10碳环基”)和零个杂原子的非芳族环烃基的基团。在一些实施方案中，碳环基具有3至8个环碳原子(“C3-8碳环基”)。在一些实施方案中，碳环基具有3至7个环碳原子(“C3-7碳环基”)。在一些实施方案中，碳环基具有3至6个环碳原子(“C3-6碳环基”)。在一些实施方案中，碳环基具有4至6个环碳原子(“C4-6碳环基”)。在一些实施方案中，碳环基具有5至6个环碳原子(“C5-6碳环基”)。在一些实施方案中，碳环基具有5至10个环碳原子(“C5-10碳环基”)。示例性C3-6碳环基包括但不限于，环丙基(C3)、环丙烯基(C3)、环丁基(C4)、环丁烯基(C4)、环戊基(C5)、环戊烯基(C5)、环己基(C6)、环己烯基(C6)、环己二烯基(C6)等。示例性C3-8碳环基包括但不限于，前述C3-6碳环基以及环庚基(C7)、环庚烯基(C7)、环庚二烯基(C7)、环庚三烯基(C7)、环辛基(C8)、环辛烯基(C8)、双环[2.2.1]庚烷基(C7)、双环[2.2.2]辛烷基(C8)等。示例性C3-10碳环基包括但不限于，前述C3-8碳环基以及环壬基(C9)、环壬烯基(C9)、环癸基(C10)、环癸烯基(C10)、八氢-1H-茚基(C9)、十氢萘基(C10)、螺[4.5]癸烷基(C10)等。如以上实例说明，在某些实施方案中，碳环基是单环的(“单环碳环基”)或多环的(例如，含有稠合、桥联或螺环系统如双环系统(“双环碳环基”)或三环系统(“三环碳环基”))，并且可以是饱和的或可包含一个或多个碳-碳双键或三键。“碳环基”还包括以下环系统，其中如以上所定义的碳环基环与一个或多个芳基或杂芳基稠合，其中连接点是在碳环基环上，并且在此类情况下，碳的数目继续指代该碳环系统中碳的数目。除非另有说明，否则碳环基的每个实例独立地为未取代的(“未取代的碳环基”)或被一个或多个取代基取代的(“取代的碳环基”)。在某些实施方案中，碳环基为未取代的C3-10碳环基。在某些实施方案中，碳环基为取代的C3-10碳环基。

在一些实施方案中，“碳环基”或“碳环”被称为“环烷基”，即具有3至10个环碳原子的单环饱和的碳环基(“C3-10环烷基”)。在一些实施方案中，环烷基具有3至8个环碳原子(“C3-8环烷基”)。在一些实施方案中，环烷基具有3至6个环碳原子(“C3-6,环烷基”)。在一些实施方案中，环烷基具有4至6个环碳原子(“C4-6环烷基”)。在一些实施方案中，环烷基具有5至6个环碳原子(“C5-6环烷基”)。在一些实施方案中，环烷基具有5至10个环碳原子(“C5-10环烷基”)。C5-6环烷基的实例包括环戊基(C5)和环己基(C5)。C3-6环烷基的实例包括前述C5-6环烷基以及环丙基(C3)和环丁基(C4)。C3-8环烷基的实例包括前述C3-6环烷基以及环庚基(C7)和环辛基(C8)。除非另有说明，否则环烷基的每个实例独立地为未取代的(“未取代的环烷基”)或被一个或多个取代基取代的(“取代的环烷基”)。在某些实施方案中，环烷基为未取代的C3-10环烷基。在某些实施方案中，环烷基为取代的C3-10环烷基。

如本文所使用，“杂环基”或“杂环”是指具有环碳原子和1或多个(例如，1、2、3、或4个)环杂原子的3至14元非芳族环系统的基团，其中每个杂原子独立地选自氧、硫、氮、硼、硅和磷(“3至14元杂环基”)。在包含一个或多个氮原子的杂环基中，连接点可以是碳或氮原子，只要化合价允许。杂环基可以是单环的(“单环杂环基”)或多环的(例如，稠合、桥联或螺环系统如双环系统(“双环杂环基”)或三环系统(“三环杂环基”))，并且可以是饱和的或可包含一个或多个碳-碳双键或三键。杂环基多环系统可以在一个或两个环中包含一个或多个杂原子。“杂环基”还包括其中如以上所定义的杂环基环与一个或多个碳环基稠合的环系统，其中连接点是在碳环基或杂环基环上；或其中如以上所定义的杂环基环与一个或多个芳基或杂芳基稠合的环系统，其中连接点是在杂环基环上，并且在此类情况下，环成员的数目继续指代该杂环基环系统中环成员的数目。除非另外说明，否则杂环基的每个实例独立地是未取代的(“未取代的杂环基”)或被一个或多个取代基取代的(“取代的杂环基”)。在某些实施方案中，杂环基为未取代的3-14元杂环基。在某些实施方案中，杂环基为取代的3-14元杂环基。

在一些实施方案中，杂环基是具有环碳原子和1或多个(例如，1、2、3、或4个)环杂原子的5至10元非芳族环系统，其中每个杂原子独立地选自氧、硫、氮、硼、硅和磷(“5-10元杂环基”)。在一些实施方案中，杂环基是具有环碳原子和1或多个(例如，1、2、3、或4个)环杂原子的5至8元非芳族环系统，其中每个杂原子独立地选自氧、硫、氮、硼、硅和磷(“5-8元杂环基”)。在一些实施方案中，在一些实施方案中，杂环基是具有环碳原子和1或多个(例如，1、2、3、或4个)环杂原子的5至6元非芳族环系统，其中每个杂原子独立地选自氧、硫、氮、硼、硅和磷(“5至6元杂环基”)。在一些实施方案中，5至6元杂环基具有选自氧、硫、氮、硼、硅和磷的1或多个(例如，1、2、或3个)环杂原子。在一些实施方案中，5至6元杂环基具有选自氧、硫、氮、硼、硅和磷的1或2个环杂原子。在一些实施方案中，5至6元杂环基具有选自氧、硫、氮、硼、硅和磷的1个环杂原子。

含有1个杂原子的示例性3元杂环基包括但不限于，氮杂环丙烷基、氧杂环丙烷基、硫杂环丙烷基。含有1个杂原子的示例性4元杂环基包括但不限于，氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基和硫杂环丁烷基。含有1个杂原子的示例性5元杂环基包括但不限于四氢呋喃基、二氢呋喃基、四氢噻吩基、二氢噻吩基、吡咯烷基、二氢吡咯基和吡咯基-2,5-二酮。含有2个杂原子的示例性5元杂环基包括但不限于，二氧戊环基、氧硫杂戊环基和二硫戊环基。含有3个杂原子的示例性5元杂环基包括但不限于，三唑啉基、噁二唑啉基和噻二唑啉基。含有1个杂原子的示例性6元杂环基包括但不限于，哌啶基、四氢吡喃基、二氢吡啶基、以及噻烷基。含有2个杂原子的示例性6元杂环基包括但不限于，哌嗪基、吗啉基、二噻烷基、二噁烷基。含有2个杂原子的示例性6元杂环基包括但不限于，三嗪烷基。含有1个杂原子的示例性7元杂环基包括但不限于，氮杂环庚烷基、氧杂环庚烷基和硫杂环庚烷基。含有1个杂原子的示例性8元杂环基包括但不限于，氮杂环辛烷基、氧杂环辛烷基、以及硫杂环辛烷基。示例性双环杂环基包括但不限于，吲哚啉基、异吲哚啉基、二氢苯并呋喃基、二氢苯并噻吩基、四氢苯并噻吩基、四氢苯并呋喃基、四氢吲哚基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、十氢喹啉基、十氢异喹啉基、八氢色烯基、八氢异色烯基、十氢萘啶基、十氢-1,8-萘啶基、八氢吡咯并[3,2-b]吡咯、吲哚啉基、邻苯二甲酰亚胺基、萘二甲酰亚胺基、色满基、色烯基、1H-苯并[e][1,4]二氮杂

如本文所使用，“芳基”是指单环或多环(例如，双环或三环)4n+2芳族环系统(例如，具有在环阵列中共享的6、10、或14个π电子)的基团(“C6-14芳基”)，在该芳族环系统中具有6至14个环碳原子和零个杂原子。在一些实施方案中，芳基具有6个环碳原子(“C6芳基”；例如，苯基)。在一些实施方案中，芳基具有10个环碳原子(“C10芳基”；例如，萘基诸如1-萘基和2-萘基)。在一些实施方案中，芳基具有14个环碳原子(“C14芳基”；例如，蒽基)。“芳基”还包括以下环系统，其中如以上所定义的芳基环与一个或多个碳环基或杂环基稠合，其中该基团或连接点是在芳基环上，并且在此类情况下，碳原子的数目继续指代芳基环系统中碳原子的数目。除非另外说明，否则芳基的每个实例独立地为未取代的(“未取代的芳基”)或被一个或多个取代基取代的(“取代的芳基”)。在某些实施方案中，芳基为未取代的C6-14芳基。在某些实施方案中，芳基为取代的C6-14芳基。

如本文所使用，“杂芳基”是指5至14元单环或多环(例如，双环或三环)4n+2芳族环系统(例如，具有在环阵列中共享的6、10或14个π电子)的基团(“5-14元杂芳基”)，在该芳族环系统中具有环碳原子和1或多个(例如，1、2、3、或4个环杂原子)环杂原子，其中每个杂原子独立地选自氧、硫、氮、硼、硅和磷。在包含一个或多个氮原子的杂芳基中，连接点可以是碳或氮原子，只要化合价允许。杂芳基多环系统可以在一个或两个环中包含一个或多个杂原子。“杂芳基”包括以下环系统，其中如以上所定义的杂芳基环与一个或多个碳环基或杂环基稠合，其中连接点是在杂芳基环上，并且在此类情况下，环成员的数目继续指代杂芳基环系统中环成员的数目。“杂芳基”还包括以下环系统，其中如以上所定义的杂芳基环与一个或多个芳基稠合，其中连接点是在芳基或杂芳基环上，并且在此类情况下，环成员的数目指代稠合的多环(芳基/杂芳基)环系统中环成员的数目。在其中一个环不包含杂原子的多环杂芳基(例如，吲哚基、喹啉基、咔唑基等)中，连接点可以是在任一个环上，即带有杂原子的环(例如，2-吲哚基)或不包含杂原子的环(例如，5-吲哚基)。

在一些实施方案中，杂芳基是在芳族环系统中具有环碳原子和1或多个(例如，1、2、3、或4个)环杂原子的5至10元芳族环系统(“5-10元杂芳基”)，其中每个杂原子独立地选自氧、硫、氮、硼、硅和磷。在一些实施方案中，杂芳基是在芳族环系统中具有环碳原子和1或多个(例如，1、2、3、或4个)环杂原子的5至8元芳族环系统(“5-8元杂芳基”)，其中每个杂原子独立地选自氧、硫、氮、硼、硅和磷。在一些实施方案中，杂芳基是在芳族环系统中具有环碳原子和1或多个(例如，1、2、3、或4个)环杂原子的5至6元芳族环系统(“5-6元杂芳基”)，其中每个杂原子独立地选自氧、硫、氮、硼、硅和磷。在一些实施方案中，5至6元杂芳基具有选自氧、硫、氮、硼、硅和磷的1或多个(例如，1、2、或3个)环杂原子。在一些实施方案中，5-6元杂芳基具有选自氧、硫、氮、硼、硅和磷的1或2个环杂原子。在一些实施方案中，5-6元杂芳基具有选自氧、硫、氮、硼、硅和磷的1个环杂原子。除非另有说明，否则杂芳基的每个实例独立地为未取代的(“未取代的杂芳基”)或被一个或多个取代基取代的(“取代的杂芳基”)。在某些实施方案中，杂芳基为未取代的5-14元杂芳基。在某些实施方案中，杂芳基为取代的5-14元杂芳基。

含有1个杂原子的示例性5元杂芳基包括但不限于，吡咯基、呋喃基和噻吩基。含有2个杂原子的示例性5元杂芳基包括但不限于，咪唑基、吡唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基和异噻唑基。含有3个杂原子的示例性5-元杂芳基包括但不限于，三唑基、噁二唑基和噻二唑基。含有4个杂原子的示例性5元杂芳基包括但不限于，四唑基。含有1个杂原子的示例性6元杂芳基包括但不限于吡啶基。含有2个杂原子的示例性6元杂芳基包括但不限于，哒嗪基、嘧啶基和吡嗪基。含有3或4个杂原子的示例性6元杂芳基分别包括但不限于，三嗪基和四嗪基。示含有1个杂原子的示例性7元杂芳基包括但不限于，氮杂

如本文所使用，术语“部分不饱和的”是指包含至少一个双键或三键的环部分。术语“部分不饱和的”意图涵盖具有多个不饱和位点的环，但不旨在包括如本文所定义的芳族基团(例如，芳基或杂芳基部分)。

如本文所使用，术语“饱和的”是指不包含双键或三键的环部分，即，该环全部包含单键。

对基团加上后缀“-ene”指示该基团是二价部分，例如，亚烷基是烷基的二价部分，亚烯基是烯基的二价部分，

亚炔基是炔基的二价部分，亚杂烷基是杂烷基的二价部分，亚杂烯基是杂烯基的二价部分，亚杂炔基是杂炔基的二价部分，亚碳环基是碳环基的二价部分，亚杂环基是杂环基的二价部分，亚芳基是芳基的二价部分，并且亚杂芳基是杂芳基的二价部分。

如从上文所理解，如本文所定义的烷基、烯基、炔基、杂烷基、杂烯基、杂炔基、碳环基、杂环基、芳基、以及杂芳基在某些实施方案中是任选取代的。任选取代的是指可以是取代的或未取代的基团(例如，“取代的”或“未取代的”烷基、“取代的”或“未取代的”烯基、“取代的”或“未取代的”炔基、“取代的”或“未取代的”杂烷基、“取代的”或“未取代的”杂烯基、“取代的”或“未取代的”杂炔基、“取代的”或“未取代的”碳环基、“取代的”或“未取代的”杂环基、“取代的”或“未取代的”芳基、或“取代的”或“未取代的”杂芳基)。通常，术语“取代的”意指基团上存在的至少一个氢被替换为可允许的取代基，例如在取代之后产生稳定的化合物的取代基，该稳定的化合物例如是不会自发地经历(如)通过重排、环化、消除或其它反应的转化的化合物。除非另外指明，否则“取代的”基团在该基团的一个或多个可取代的位置处具有取代基，并且当任何给定结构中的一个以上的位置被取代时，该取代基在每个位置处是相同的或不同的。术语“取代的”设想包括用有机化合物的所有可允许的取代基、本文所述的导致稳定化合物形成的任何取代基的取代。本发明设想任何和所有此类组合以便达成稳定的化合物。出于本发明的目的，杂原子如氮可以具有氢取代基和/或如本文所述的满足这些杂原子的化合价并且导致稳定部分形成的任何合适的取代基。

示例性碳原子取代基包括但不限于，卤素、-CN、-NO2、-N3、-SO2H、-SO3H、-OH、-ORaa、-ON(Rbb)2、-N(Rbb)2、-N(Rbb)3+X-、-N(ORcc)Rbb、-SeH、-SeRaa、-SH、-SRaa、-SSRcc、-C(＝O)Raa、-CO2H、-CHO、-C(ORcc)2、-CO2Raa、-OC(＝O)Raa、-OCO2Raa、-C(＝O)N(Rbb)2、-OC(＝O)N(Rbb)2、-NRbbC(＝O)Raa、-NRbbCO2Raa、-NRbbC(＝O)N(Rbb)2、-C(＝NRbb)Raa、-C(＝NRb b)ORaa、-OC(＝NRbb)Raa、-OC(＝NRbb)ORaa、-C(＝NRbb)N(Rbb)2、-OC(＝NRbb)N(Rbb)2、-NRbbC(＝NRbb)N(Rbb)2、-C(＝O)NRb bSO2Raa、-NRbbSO2Raa、-SO2N(Rbb)2、-SO2Raa、-SO2ORaa、-OSO2Raa、-S(＝O)Raa、-OS(＝O)Raa、-Si(Raa)3-OSi(Raa)3-C(＝S)N(Rbb)2、-C(＝O)SRaa、-C(＝S)SRaa、-SC(＝S)SRaa、-SC(＝O)S Raa、-OC(＝O)SRaa、-SC(＝O)ORaa、-SC(＝O)Raa、-P(＝O)2Raa、-OP(＝O)2Raa、-P(＝O)(Raa)2、-OP(＝O)(Raa)2、-OP(＝O)(ORcc)2、-P(＝O)2N(Rbb)2、-OP(＝O)2N(Rbb)2、-P(＝O)(NRbb)2、-OP(＝O)(N Rbb)2、-NRbbP(＝O)(ORcc)2、-NRbbP(＝O)(NRbb)2、-P(Rcc)2、-P(Rcc)3、-OP(Rcc)2、-OP(Rcc)3、-B(Raa)2、-B(ORcc)2、-BRaa(O Rcc)、C1-50烷基、C2-50烯基、C2-50炔基、C3-14碳环基、3-14元杂环基、C6-14芳基和5-14元杂芳基，其中每个烷基、烯基、炔基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基独立地被0、1、2、3、4、或5个Rdd基团取代；

或碳原子上的两个偕氢被替换为基团＝O、＝S、＝NN(Rbb)2、＝NNRbbC(＝O)Raa、＝NNRbbC(＝O)ORaa、＝NNRbbS(＝O)2Raa、＝NRbb、或＝NORcc；

Raa的每个实例独立地选自C1-50烷基、C2-50烯基、C2-50炔基、C3-10碳环基、3-14元杂环基、C6-14芳基和5-14元杂芳基，或两个Raa基团联接以形成3-14元杂环基或5-14元杂芳基环，其中每个烷基、烯基、炔基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基独立地被0、1、2、3、4或5个Rdd基团取代；

Rbb的每个实例独立地选自氢、-OH、-ORaa、-N(Rcc)2、-CN、-C(＝O)Raa、-C(＝O)N(Rcc)2、-CO2Raa、-SO2Raa、-C(＝NRcc)ORaa、-C(＝NRcc)N(Rcc)2、-SO2N(Rcc)2、-SO2Rcc、-SO20Rcc、-SORaa、-C(＝S)N(Rcc)2、-C(＝O)SRcc、-C(＝S)SRcc、-P(＝O)2Raa、-P(＝O)(Raa)2、-P(＝O)2N(Rcc)2、-P(＝O)(NRcc)2、C1-50烷基、C2-50烯基、C2-50炔基、C3-10碳环基、3-14元杂环基、C6-14芳基和5-14元杂芳基，或两个Rbb基团与它们所连接的杂原子一起形成3-14元杂环基或5-14元杂芳基环，其中每个烷基、烯基、炔基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基独立地被0、1、2、3、4或5个Rdd基团取代；

Rcc的每个实例独立地选自氢、C1-50烷基、C2-50烯基、C2-50炔基、C3-10碳环基、3-14元杂环基、C6-14芳基和5-14元杂芳基，或两个Rcc基团与它们所连接的杂原子一起形成3-14元杂环基或5-14元杂芳基环，其中每个烷基、烯基、炔基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基独立地被0、1、2、3、4或5个Rdd基团取代；

Rdd的每个实例独立地选自卤素、-CN、-NO2、-N3、-SO2H、-SO3H、-OH、-ORee、-ON(Rff)2、-N(Rff)2、-N(Rff)3+X-、-N(ORee)Rff、-SH、-SRee、-SSRee、-C(＝O)Ree、-CO2H、-CO2Ree、-OC(＝O)Ree、-OCO2Ree、-C(＝O)N(Rff)2、-OC(＝O)N(Rff)2、-NRffC(＝O)Ree、-NRffCO2Ree、-NRffC(＝O)N(Rff)2、-C(＝NRff)ORee、-OC(＝NRff)Ree、-OC(＝NRff)ORee、-C(＝NRff)N(Rff)2、-OC(＝NRff)N(Rff)2、-NRffC(＝NRff)N(Rff)2、-NRffSO2Ree、-SO2N(Rff)2、-SO2Ree、-SO2ORee、-OSO2Ree、-S(＝O)Ree、-Si(Ree)3、-OSi(Ree)3、-C(＝S)N(Rff)2、-C(＝O)SRee、-C(＝S)SRee、-SC(＝S)SRee、-P(＝O)2Ree、-P(＝O)(Ree)2、-OP(＝O)(Ree)2、-OP(＝O)(ORee)2、C1-50烷基、C2-50烯基、C2-50炔基、C3-10碳环基、3-10元杂环基、C6-10芳基、5-10元杂芳基，其中每个烷基、烯基、炔基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基独立地被0、1、2、3、4或5个Rgg基团取代，或两个偕Rdd取代基可以联接以形成＝O或＝S；

Ree的每个实例独立地选自C1-50烷基、C2-50烯基、C2-50炔基、C3-10碳环基、C6-10芳基、3-10元杂环基和3-10元杂芳基，其中每个烷基、烯基、炔基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基独立地被0、1、2、3、4或5个Rgg基团取代；

Rff的每个实例独立地选自氢、C1-50烷基、C2-50烯基、C2-50炔基、C3-10碳环基、3-10元杂环基、C6-10芳基和5-10元杂芳基，或两个Rff基团与它们所连接的杂原子一起形成3-14元杂环基或5-14元杂芳基环，其中每个烷基、烯基、炔基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基独立地被0、1、2、3、4或5个Rgg基团取代；以及

Rgg的每个实例独立地为卤素、-CN、-NO2、-N3、-SO2H、-SO3H、-OH、-OC1-50烷基、-ON(C1-50烷基)2、-N(C1-50烷基)2、-N(C1-50烷基)3+X-、-NH(C1-50烷基)2+X-、-NH2(C1-50烷基)+X-、-NH3+X-、-N(OC1-50烷基)(C1-50烷基)、-N(OH)(C1-50烷基)、-NH(OH)、-SH、-SC1-50烷基、-SS(C1-50烷基)、-C(＝O)(C1-50烷基)、-CO2H、-CO2(C1-50烷基)、-OC(＝O)(C1-50烷基)、-OCO2(C1-50烷基)、-C(＝O)NH2、-C(＝O)N(C1-50烷基)2、-OC(＝O)NH(C1-50烷基)、-NHC(＝O)(C1-50烷基)、-N(C1-50烷基)C(＝O)(C1-50烷基)、-NHCO2(C1-50烷基)、-NHC(＝O)N(C1-50烷基)2、-NHC(＝O)NH(C1-50烷基)、-NHC(＝O)NH2、-C(＝NH)O(C1-50烷基)、-OC(＝NH)(C1-50烷基)、-OC(＝NH)OC1-50烷基、-C(＝NH)N(C1-50烷基)2、-C(＝NH)NH(C1-50烷基)、-C(＝NH)NH2、-OC(＝NH)N(C1-50烷基)2、-OC(NH)NH(C1-50烷基)、-OC(NH)NH2、-NHC(NH)N(C1-50烷基)2、-NHC(＝NH)NH2、-NHSO2(C1-50烷基)、-SO2N(C1-50烷基)2、-SO2NH(C 1-50烷基)、-SO2NH2,-SO2C1-50烷基、-SO2OC1-50烷基、-OSO2C1-6烷基、-SOC1-6烷基、-Si(C1-50烷基)3、-OSi(C1-6烷基)3-C(＝S)N(C1-50烷基)2、C(＝S)NH(C1-50烷基)、C(＝S)NH2、-C(＝O)S(C1-6烷基)、-C(＝S)SC1-6烷基、-SC(＝S)SC1-6烷基、-P(＝O)2(C1-50烷基)、-P(＝O)(C1-50烷基)2、-OP(＝O)(C1-50烷基)2、-OP(＝O)(OC1-50烷基)2、C1-50烷基、C2-50烯基、C2-50炔基、C3-10碳环基、C6-10芳基、3-10元杂环基、5-10元杂芳基；或两个偕Rgg取代基可联接以形成＝O或＝S；

其中X-为抗衡离子。

如本文所使用，术语“卤代”或“卤素”是指氟(氟代，-F)、氯(氯代，-Cl)、溴(溴代，-Br)、或碘(碘代，-I)。

如本文所使用，“抗衡离子”是与带正电荷的季胺缔合以维持电中性的带负电荷的基团。示例性抗衡离子包括卤离子(例如，F-、C1-、Br-、I-)、NO3-、C1O4-、OH-、H2PO4-、HSO4-、磺酸根离子(例如，甲磺酸根、三氟甲磺酸根、对甲苯磺酸根、苯磺酸根、10-樟脑磺酸根、萘-2-磺酸根、萘-1-磺酸-5-磺酸根、乙烷-1-磺酸-2-磺酸根等)、以及羧酸根离子(例如，乙酸根、醋酸根、丙酸根、苯甲酸根、甘油酸根、乳酸根、酒石酸根、乙醇酸根等)。

只要化合价允许，氮原子可以是取代的或未取代的，并且包括伯、仲、叔以及季氮原子。示例性氮原子取代基包括但不限于，氢、-OH、-ORaa、-N(Rcc)2、-CN、-C(＝O)Raa、-C(＝O)N(Rcc)2、-CO2Raa、-SO2Raa、-C(＝NRbb)Raa、-C(＝NRcc)ORaa、-C(＝NRcc)N(Rcc)2、-SO2N(Rcc)2、-SO2Rcc、-SO2ORcc、-SORaa、-C(＝S)N(Rcc)2、-C(＝O)SRcc、-C(＝S)SRcc、-P(＝O)2Raa、-P(＝O)(Raa)2、-P(＝O)2N(Rcc)2、-P(＝O)(NRcc)2、C1-50烷基、C2-50烯基、C2-50炔基、C3-10碳环基、3-14元杂环基、C6-14芳基和5-14元杂芳基，或两个Rcc基团与它们所连接的N原子一起形成3-14元杂环基或5-14元杂芳基环，其中每个烷基、烯基、炔基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基独立地被0、1、2、3、4或5个Rdd基团取代，且其中Raa、Rbb、Rcc和Rdd如上文定义的。

如果化合价允许，氮原子可以是取代的或未取代的，并且包括伯、仲、叔以及季氮原子。示例性氮原子取代基包括但不限于，氢、-OH、-ORaa、-N(Rcc)2、-CN、-C(＝O)Raa、-C(＝O)N(Rcc)2、-CO2Raa、-SO2Raa、-C(＝NRbb)Raa、-C(＝NRcc)ORaa、-C(＝NRcc)N(Rcc)2、-SO2N(Rcc)2、-SO2Rcc、-SO2ORcc、-SORaa、-C(＝S)N(Rcc)2、-C(＝O)SRcc、-C(＝S)SRcc、-P(＝O)2Raa、-P(＝O)(Raa)2、-P(＝O)2N(Rcc)2、-P(＝O)(NRcc)2、C1-10烷基、C1-10全卤代烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-10碳环基、3-14元杂环基、C6-14芳基和5-14元杂芳基，或两个Rcc基团与它们所连接的氮原子一起形成3-14元杂环基或5-14元杂芳基环，其中每个烷基、烯基、炔基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基独立地被0、1、2、3、4或5个Rdd基团取代，且其中Raa、Rbb、Rcc和Rdd如上文定义的。

在某些实施方案中，氮原子上存在的取代基为氮保护基团(也被称为氨基保护基团)。氮保护基团包括但不限于，-OH、-ORaa、-N(Rcc)2、-C(＝O)Raa、-C(＝O)N(Rcc)2、-CO2Raa、-SO2Raa、-C(＝NRcc)Raa、-C(＝NRcc)ORaa、-C(＝NRcc)N(Rcc)2、-SO2N(Rcc)2、-SO2Rcc、-SO2ORcc、-SORaa、-C(＝S)N(Rcc)2、-C(＝O)SRcc、-C(＝S)SRcc、C1-10烷基(例如，芳烷基、杂芳烷基)、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-10碳环基、3-14元杂环基、C6-14芳基和5-14元杂芳基，其中每个烷基、烯基、炔基、碳环基、杂环基、芳烷基、芳基和杂芳基独立地被0、1、2、3、4或5个Rdd基团取代，且其中Raa、Rbb、Rcc和Rdd如本文所定义。氮保护基团是本领域熟知的，并且包括于Protecting Groups in Organic Synthesis,T.W.Greene和P.G.M.Wuts，第3版，John Wiley&Sons,1999(通过引用并入本文)中详细地描述的那些。

例如，氮保护基团诸如酰胺基团(例如，-C(＝O)Raa)包括但不限于，甲酰胺、乙酰胺、氯乙酰胺、三氯乙酰胺、三氟乙酰胺、苯基乙酰胺、3-苯基丙酰胺、吡啶酰胺、3-吡啶基甲酰胺、N-苯甲酰基苯基丙氨酰基衍生物、苯甲酰胺、对苯基苯甲酰胺、邻硝基苯基乙酰胺、邻硝基苯氧基乙酰胺、乙酰乙酰胺、(N’-二硫代苄基氧基酰基氨基)乙酰胺、3-(对羟基苯基)丙酰胺、3-(邻硝基苯基)丙酰胺、2-甲基-2-(邻硝基苯氧基)丙酰胺、2-甲基-2-(邻苯基偶氮苯氧基)丙酰胺、4-氯丁酰胺、3-甲基-3-硝基丁酰胺、邻硝基肉桂酰胺、N-乙酰基甲硫氨酸衍生物、邻硝基苯甲酰胺和邻(苯甲酰基氧基甲基)苯甲酰胺。

氮保护基团诸如氨基甲酸酯基团(例如，-C(＝O)ORaa)包括但不限于，氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯、氨基甲酸9-芴基甲酯(Fmoc)、氨基甲酸9-(2-磺基)芴基甲酯、氨基甲酸9-(2,7-二溴)芴基甲酯、氨基甲酸2,7-二-叔丁基-[9-(10,10-二氧代-10,10,10,10-四氢噻吨基)]甲酯(DBD-Tmoc)、氨基甲酸4-甲氧基苯甲酰甲酯(Phenoc)、氨基甲酸2,2,2-三氯乙酯(Troc)、氨基甲酸2-三甲基甲硅烷基乙酯(Teoc)、氨基甲酸2-苯乙酯(hZ)、氨基甲酸1-(1-金刚烷基)-1-甲基乙酯(Adpoc)、氨基甲酸1,1-二甲基-2-卤代乙酯、氨基甲酸1,1-二甲基-2,2-二溴乙酯(DB-t-BOC)、氨基甲酸1,1-二甲基-2,2,2-三氯乙酯(TCBOC)、氨基甲酸1-甲基-1-(4-联苯基)乙酯(Bpoc)、氨基甲酸1-(3,5-二-叔丁基苯基)-1-甲基乙酯(t-Bumeoc)、氨基甲酸2-(2’-和4’-吡啶基)乙酯(Pyoc)、氨基甲酸2-(N,N-二环己基甲酰胺基)乙酯、氨基甲酸叔丁酯(BOC)、氨基甲酸1-金刚烷酯(Adoc)、氨基甲酸乙烯酯(Voc)、氨基甲酸烯丙酯(Alloc)、氨基甲酸1-异丙基烯丙酯(Ipaoc)、氨基甲酸肉桂酯(Coc)、氨基甲酸4-硝基肉桂酯(Noc)、氨基甲酸8-喹啉基酯、氨基甲酸N-羟基哌啶基酯、二硫代氨基甲酸烷酯、氨基甲酸苄酯(Cbz)、氨基甲酸对甲氧基苄酯(Moz)、氨基甲酸对硝基苄酯、氨基甲酸对溴苄酯、氨基甲酸对氯苄酯、氨基甲酸2,4-二氯苄酯、氨基甲酸4-甲基亚磺酰基苄酯(Msz)、氨基甲酸9-蒽基甲酯、氨基甲酸二苯基甲酯、氨基甲酸2-甲基硫代乙酯、氨基甲酸2-甲基磺酰基乙酯、氨基甲酸2-(对甲苯磺酰基)乙酯、氨基甲酸[2-(1,3-二噻烷基)]甲酯(Dmoc)、氨基甲酸4-甲基噻吩基酯(Mtpc)、氨基甲酸2,4-二甲基噻吩基酯(Bmpc)、氨基甲酸2-磷鎓基乙酯(Peoc)、氨基甲酸2-三苯基磷鎓基异丙酯(Ppoc)、氨基甲酸1,1-二甲基-2-氰基乙酯、氨基甲酸间氯-对酰基氧基苄酯、氨基甲酸对(二羟基氧硼基)苄酯、氨基甲酸5-苯并异噁唑基甲酯、氨基甲酸2-(三氟甲基)-6-色酮基甲酯(Tcroc)、氨基甲酸间硝基苯酯、氨基甲酸3,5-二甲氧基苄酯、氨基甲酸邻硝基苄酯、氨基甲酸3,4-二甲氧基-6-硝基苄酯、氨基甲酸苯基(邻硝基苯基)甲酯、氨基甲酸叔戊酯、硫代氨基甲酸S-苄酯、氨基甲酸对氰基苄酯、氨基甲酸环丁酯、氨基甲酸环己酯、氨基甲酸环戊酯、氨基甲酸环丙基甲酯、氨基甲酸对癸基氧基苄酯、氨基甲酸2,2-二甲氧基酰基乙烯酯、氨基甲酸邻(N,N-二甲基甲酰胺基)苄酯、氨基甲酸1,1-二甲基-3-(N,N-二甲基甲酰胺基)丙酯、氨基甲酸1,1-二甲基丙炔酯、氨基甲酸二(2-吡啶基)甲酯、氨基甲酸2-呋喃基甲酯、氨基甲酸2-碘乙酯、氨基甲酸异冰片酯、氨基甲酸异丁酯、氨基甲酸异烟酰基酯、氨基甲酸对(p’-甲氧基苯基偶氮)苄酯、氨基甲酸1-甲基环丁酯、氨基甲酸1-甲基环己酯、氨基甲酸1-甲基-1-环丙基甲酯、氨基甲酸1-甲基-1(3,5-二甲氧基苯基)乙酯、氨基甲酸1-甲基-1-(对苯基偶氮苯基)乙酯、1-甲基-1-苯乙基氨基甲酸酯、氨基甲酸1-甲基-1-(4-吡啶基)乙酯、氨基甲酸苯酯、氨基甲酸对(苯基偶氮)苄酯、氨基甲酸2,4,6-三-叔丁基苯酯、氨基甲酸4-(三甲基铵)苄酯和氨基甲酸2,4,6-三甲基苄酯。

氮保护基团诸如磺酰胺基团(例如，-S(＝O)2Raa)包括但不限于，对甲苯磺酰胺(Ts)、苯磺酰胺、2,3,6,-三甲基-4-甲氧基苯磺酰胺(Mtr)、2,4,6-三甲氧基苯磺酰胺(Mtb)、2,6-二甲基-4-甲氧基苯磺酰胺(Pme)、2,3,5,6-四甲基-4-甲氧基苯磺酰胺(Mte)、4-甲氧基苯磺酰胺(Mbs)、2,4,6-三甲基苯磺酰胺(Mts)、2,6-二甲氧基-4-甲基苯磺酰胺(iMds)、2,2,5,7,8-五甲基色满-6-磺酰胺(Pmc)、甲烷磺酰胺(Ms)、β-三甲基甲硅烷基乙磺酰胺(SES)、9-蒽磺酰胺、4-(4’,8’-二甲氧基萘基甲基)苯磺酰胺(DNMBS)、苄基磺酰胺、三氟甲基磺酰胺和苯甲酰甲基磺酰胺。

其它氮保护基团包括但不限于，吩噻嗪基-(10)-酰基衍生物、N’-对甲苯磺酰基氨基酰基衍生物、N’-苯基氨基硫代酰基衍生物、N-苯甲酰基苯丙氨酰基衍生物、N-乙酰基甲硫氨酸衍生物、4,5-二苯基-3-噁唑啉-2-酮、N-邻苯二甲酰亚胺、N-二硫杂琥珀酰亚胺(Dts)、N-2,3-二苯基马来酰亚胺、N-2,5-二甲基吡咯、N-1,1,4,4-四甲基二甲硅烷基氮杂环戊烷加合物(STABASE)、5-取代的1,3-二甲基-1,3,5-三氮杂环己-2-酮、5-取代的1,3-二苄基-1,3,5-三氮杂环己-2-酮、1-取代的3,5-二硝基-4-吡啶酮、N-甲胺、N-烯丙基胺、N-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲胺(SEM)、N-3-乙酰氧基丙胺、N-(1-异丙基-4-硝基-2-氧代-3-吡咯啉-3-基)胺、季铵盐、N-苄胺、N-二(4-甲氧基苯基)甲胺、Ν-5-二苯并环庚胺、N-三苯基甲胺(Tr)、N-[(4-甲氧基苯基)二苯基甲基]胺(MMTr)、N-9-苯基芴基胺(PhF)、N-2,7-二氯-9-芴基亚甲胺、N-二茂铁基甲基氨基(Fcm)、N-2-吡啶甲基氨基N’-氧化物、N-1,1-二甲基硫代亚甲胺、N-亚苄胺、N-对甲氧基亚苄胺、N-二苯基亚甲胺、N-[(2-吡啶基)三甲苯基]亚甲胺、N-(N’,N’-二甲基氨基亚甲基)胺、N,N’-亚异丙基二胺、N-对硝基亚苄胺、N-亚水杨基胺、N-5-氯亚水杨基胺、N-(5-氯-2-羟基苯基)苯基亚甲胺、N-亚环己基胺、N-(5,5-二甲基-3-氧代-1-环己烯基)胺、N-硼烷衍生物、N-二苯基硼酸衍生物、N-[苯基(五酰基铬或钨)酰基]胺、N-铜螯合物、N-锌螯合物、N-硝基胺、N-亚硝胺、胺N-氧化物、二苯基膦酰胺(Dpp)、二甲基硫代膦酰胺(Mpt)、二苯基硫代膦酰胺(Ppt)、氨基磷酸二烷基酯、氨基磷酸二苄基酯、氨基磷酸二苯基酯、苯亚磺酰胺、邻硝基苯亚磺酰胺(Nps)、2,4-二硝基苯亚磺酰胺、五氯苯亚磺酰胺、2-硝基-4-甲氧基苯亚磺酰胺、三苯基甲基亚磺酰胺、以及3-硝基吡啶亚磺酰胺(Npys)。

在某些实施方案中，氧原子上存在的取代基是氧保护基团(也被称为羟基保护基团)。氧保护基团包括但不限于，-Raa、-N(Rbb)2、-C(＝O)SRaa、-C(＝O)Raa、-CO2Raa、-C(＝O)N(Rbb)2、-C(＝NRbb)Raa、-C(＝NRbb)ORaa、-C(＝NRbb)N(Rbb)2、-S(＝O)Raa、-SO2Raa,Si(Raa)3、-P(Rcc)2、-P(Rcc)3、-P(＝O)2Raa、-P(＝O)(Raa)2、-P(＝O)(ORcc)2、-P(＝O)2N(Rbb)2和-P(＝O)(NRbb)2，其中Raa、Rbb和Rcc如本文所定义。氧保护基团是本领域熟知的，并且包括于Protecting Groups in Organic Synthesis,T.W.Greene和P.G.M.Wuts，第3版，John Wiley&Sons,1999(通过引用并入本文)中详细地描述的那些。

示例性氧保护基团包括但不限于，甲基、甲氧基甲基(MOM)、甲基硫代甲基(MTM)、叔丁基硫代甲基、(苯基二甲基甲硅烷基)甲氧基甲基(SMOM)、苄基氧基甲基(BOM)、对甲氧基苄基氧基甲基(PMBM)、(4-甲氧基苯氧基)甲基(p-AOM)、愈创木酚甲基(GUM)、叔丁氧基甲基、4-戊烯基氧基甲基(POM)、硅氧基甲基、2-甲氧基乙氧基甲基(MEM)、2,2,2-三氯乙氧基甲基、双(2-氯乙氧基)甲基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基(SEMOR)、四氢吡喃基(THP)、3-溴四氢吡喃基、四氢噻喃基、1-甲氧基环己基、4-甲氧基四氢吡喃基(MTHP)、4-甲氧基四氢噻喃基、4-甲氧基四氢噻喃基S,S-二氧化物、1-[(2-氯-4-甲基)苯基]-4-甲氧基哌啶-4-基(CTMP)、1,4-二噁烷-2-基、四氢呋喃基、四氢硫代呋喃基、2,3,3a,4,5,6,7,7a-八氢-7,8,8-三甲基-4,7-桥亚甲基苯并呋喃-2-基、1-乙氧基乙基、1-(2-氯乙氧基)乙基、1-甲基-1-甲氧基乙基、1-甲基-1-苄基氧基乙基、1-甲基-1-苄氧基-2-氟乙基、2,2,2-三氯乙基、2-三甲基甲硅烷基乙基、2-(苯基氢硒基乙基、叔丁基、烯丙基、对氯苯基、对甲氧基苯基、2,4-二硝基苯基、苄基(Bn)、对甲氧基苄基、3,4-二甲氧基苄基、邻硝基苄基、对硝基苄基、对卤代苄基、2,6-二氯苄基、对氰基苄基、对苯基苄基、2-吡啶甲基、4-吡啶甲基、3-甲基-2-吡啶甲基N-氧化物、二苯基甲基、p,p’-二硝基二苯甲基、5-二苯并环庚基、三苯基甲基、α-萘基二苯基甲基、对甲氧基苯基二苯基甲基、二(对甲氧基苯基)苯基甲基、三(对甲氧基苯基)甲基、4-(4’-溴苯甲酰甲基氧基苯基)二苯基甲基、4,4’,4”-三(4,5-二氯邻苯二甲酰亚胺基苯基)甲基、4,4’,4”-三(乙酰丙酰基氧基苯基)甲基、4,4’,4”-三(苯甲酰基氧基苯基)甲基、3-(咪唑-1-基)双(4’,4”-二甲氧基苯基)甲基、1,1-双(4-甲氧基苯基)-1’-芘基甲基、9-蒽基、9-(9-苯基)呫吨基、9-(9-苯基-10-氧代)蒽基、1,3-苯并二硫呋喃-2-基、苯并异噻唑基S,S-二氧化物、三甲基甲硅烷基(TMS)、三乙基甲硅烷基(TES)、三异丙基甲硅烷基(TIPS)、二甲基异丙基甲硅烷基(IPDMS)、二乙基异丙基甲硅烷基(DEIPS)、二甲基己基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)、三苄基甲硅烷基、三-对二甲苯基甲硅烷基、三苯基甲硅烷基、二苯基甲基甲硅烷基(DPMS)、叔丁基甲氧基苯基甲硅烷基(TBMPS)、甲酸酯、苯甲酰甲酸酯、乙酸酯、氯乙酸酯、二氯乙酸酯、三氯乙酸酯、三氟乙酸酯、甲氧基乙酸酯、三苯基甲氧基乙酸酯、苯氧基乙酸酯、对氯苯氧基乙酸酯、3-苯基丙酸酯、4-氧代戊酸酯(乙酰丙酸酯)、4,4-(亚乙基二硫代)戊酸酯(乙酰丙酰基二硫缩醛)、新戊酸酯、金刚烷酸酯(adamantoate)、巴豆酸酯、4-甲氧基巴豆酸酯、苯甲酸酯、对苯基苯甲酸酯、2,4,6-三甲基苯甲酸酯(mesitoate)、碳酸烷基甲酯、碳酸9-芴基甲酯(Fmoc)、碳酸烷基乙酯、碳酸烷基2,2,2-三氯乙酯(Troc)、碳酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(TMSEC)、碳酸2-(苯基磺酰基)乙酯(Psec)、碳酸2-(三苯基磷基)乙酯(Peoc)、碳酸烷基异丁酯、碳酸烷基乙烯酯、碳酸烷基烯丙酯、碳酸烷基对硝基苯酯、碳酸烷基苄酯、碳酸烷基对甲氧基苄酯、碳酸烷基3,4-二甲氧基苄酯、碳酸烷基邻硝基苄酯、碳酸烷基对硝基苄酯、硫代碳酸烷基S-苄酯、碳酸4-乙氧基-1-萘酯、二硫代碳酸甲酯、2-碘代苯甲酸酯、4-叠氮基丁酸酯、戊酸4-硝基-4-甲酯、苯甲酸邻(二溴甲基)酯、苯磺酸2-甲酰基酯、2-(甲基硫代甲氧基)乙基、丁酸4-(甲基硫代甲氧基)酯、苯甲酸2-(甲基硫代甲氧基甲基)酯、苯氧基乙酸2,6-二氯-4-甲基酯、苯氧基乙酸2,6-二氯-4-(1,1,3,3-四甲基丁基)酯、苯氧基乙酸2,4-双(1,1-二甲基丙基)酯、氯二苯基乙酸酯、异丁酸酯、单丁二酸酯、(E)-2-甲基-2-丁烯酸酯、苯甲酸邻(甲氧基酰基)酯、α-萘甲酸酯、硝酸酯、二氨基磷酸烷基N,N,N’,N’-四甲酯、氨基甲酸烷基N-苯基酯、硼酸酯、二甲基硫膦基、苯基亚磺酸烷基2,4-二硝基酯、硫酸酯、甲烷磺酸酯(甲磺酸酯)、苄基磺酸酯、以及甲苯磺酸酯(Ts)。

在某些实施方案中，硫原子上存在的取代基是硫保护基团(也被称为硫醇保护基团)。硫保护基团包括但不限于，-Raa、-N(Rbb)2、-C(＝O)SRaa、-C(＝O)Raa、-CO2Raa、C(＝O)N(Rbb)2、-C(＝NRbb)Raa、-C(＝NRbb)ORaa、-C(＝NRbb)N(Rbb)2、-S(＝O)Raa、-SO2Raa、-Si(Raa)3、-P(Rcc)2、-P(Rcc)3、-P(＝O)2Raa、-P(＝O)(Raa)2、-P(＝O)(ORcc)2、-P(＝O)2N(Rbb)2和-P(＝O)(NRbb)2，其中Raa、Rbb和Rcc如本文所定义。硫保护基团是本领域熟知的，并且包括于Protecting Groups in Organic Synthesis,T.W.Greene和P.G.M.Wuts，第3版，John Wiley&Sons,1999(通过引用并入本文)中详细地描述的那些。

如本文所使用，“离去基团”是本领域可理解的术语，是指在异键裂解中带着一对电子离开的分子片段，其中该分子片段是阴离子或中性分子。参见，例如，Smith,March'sAdvanced Organic Chemistry第6版(501-502)。示例性离去基团包括但不限于，卤基(例如，氯、溴、碘)和磺酰基取代的羟基(例如，甲苯磺酰基、甲磺酰基、苯磺酰基)。

其它定义

如本文所使用，短语“至少一个实例”的使用是指一个实例，但还涵盖多于一个实例，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个实例，并且高达100个实例。

如本文所使用，“聚合物”是指由至少3个(例如，至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100等个)重复共价结合的结构单元组成的化合物。

“连接”是指基团的共价连接。

如本文所使用，“亲脂性”是指基团溶解于脂肪、油、脂质、以及亲脂性非极性溶剂(如己烷或甲苯)中的能力。通常，亲脂性基团是指具有6至50个碳原子，例如，6至40个、6至30个、6至20个、8至20个、8至19个、8至18个、8至17个、8至16个、或8至15个碳原子的未取代的正烷基或未取代的正烯基。

如本文所使用，术语“盐”或“药学上可接受的盐”是指在合理的医学判断范围内适合用于与人和低等动物的组织相接触，而无不当毒性、刺激、过敏反应等，并且与合理的利益/风险比相称的那些盐。药学上可接受的盐是本领域熟知的。例如，S.M.Berge等人于J.Pharmaceutical Sciences(1977)66:1-19中详细地描述了药学上可接受的盐。本发明的化合物的药学上可接受的盐包括来源于合适的无机酸和有机酸和碱的那些。药学上可接受的无毒酸加成盐的实例是氨基与无机酸(如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸以及高氯酸)或与有机酸(如乙酸、草酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸)形成的盐，或通过使用本领域中所用的其它方法(如离子交换法)形成的盐。其它药学上可接受的盐包括己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、葡糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖醛酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸盐等。来源于适当碱的盐包括碱金属盐、碱土金属盐、铵盐以及N+(C1-4烷基)4盐。代表性碱或碱土金属盐包括钠盐、锂盐、钾盐、钙盐、镁盐等。适当时，另外的药学上可接受的盐包括使用如卤离子、氢氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、磺酸根、以及芳基磺酸根等抗衡离子形成的无毒铵、季铵以及胺阳离子。另外的药学上可接受的盐包括从使用适当的亲电子试剂(例如，烷基卤)使胺季铵化以形成季铵化的烷基化的氨基盐形成的盐。

第二或额外阳离子脂质

在一些实施方案中，脂质体可包含第二或额外阳离子脂质。如本文所使用，短语"阳离子脂质"是指在选定的pH诸如生理pH下具有净正电荷的许多脂质种类中的任一种。若干阳离子脂质已于文献中描述，其中的很多种是商购可得的。特别适合用于本发明的组合物和方法的阳离子脂质包括于国际专利公布WO 2010/053572(特别是，在段落[00225]中描述的C12-200)和WO 2012/170930中描述的那些，这两篇均通过引用并入本文。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法采用包含于2012年3月29日提交的美国临时专利申请61/617,468(通过引用并入本文)中描述的可离子化阳离子脂质(诸如例如(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)二十四碳-15,18-二烯-1-胺(HGT5000)、(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)二十四碳-4,15,18-三烯-1-胺(HGT5001)和(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)二十四碳-5,15,18-三烯-1-胺(HGT5002))的脂质纳米颗粒。

在一些实施方案中，使用第二或额外阳离子脂质N-[l-(2,3-二油基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵或"DOTMA"。(Feigner等人(Proc.Nat'l Acad.Sci.84,7413(1987)；美国专利No.4,897,355)。DOTMA可被单独配制或可与中性脂质、二油酰基磷脂酰-乙醇胺或"DOPE"或其它阳离子或非阳离子脂质组合至脂质体转移媒介物或脂质纳米颗粒，且此类脂质体可用于增强核酸至靶细胞内的递送。其它合适的阳离子脂质包括，例如，5-羧基精胺基甘氨酸双十八烷基酰胺或"DOGS"、2,3-二油基氧基-N-[2(精胺-甲酰胺基)乙基]-N,N-二甲基-l-丙铵或"DOSPA"(Behr等人Proc.Nat.'l Acad.Sci.86,6982(1989)；美国专利No.5,171,678；美国专利No.5,334,761)、1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷或"DODAP"、1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷或"DOTAP"。额外示例性阳离子脂质也包括1,2-二硬脂酰基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷或"DSDMA"、1,2-二油基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷或"DODMA"、1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷或"DLinDMA"、1,2-二亚油酰基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷或"DLenDMA"、N-二油基-N,N-二甲基氯化铵或"DODAC"、N,N-二硬脂酰基-N,N-二甲基溴化铵或"DDAB"、N-(l,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵或"DMRIE"、3-二甲氨基-2-(胆甾-5-烯-3-β-氧基丁-4-氧基)-1-(顺式,顺式-9,12-十八碳二烯氧基)丙烷或"CLinDMA"、2-[5'-(胆甾-5-烯-3-β-氧基)-3'-氧杂戊氧基)-3-二甲基-1-(顺式,顺式-9',1-2'-十八碳二烯氧基)丙烷或"CpLinDMA"、N,N-二甲基-3,4-二油基氧基苄胺或"DMOBA"、1,2-N,N'-二油基氨基甲酰基-3-二甲氨基丙烷或"DOcarbDAP"、2,3-二亚油酰基氧基-Ν,Ν-二甲基丙胺或"DLinDAP"、1,2-N,N'-二亚油基氨基甲酰基-3-二甲氨基丙烷或"DLincarbDAP"、1,2-二亚油酰基氨基甲酰基-3-二甲氨基丙烷或"DLinCDAP"、2,2-二亚油基-4-二甲氨基甲基-[l,3]-二氧戊环或"DLin--DMA"、2,2-二亚油基-4-二甲氨基乙基-[l,3]-二氧戊环或"DLin-K-XTC2-DMA"和2-(2,2-二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)-l,3-二氧戊环-4-基)-N,N-二甲基乙胺(DLin-KC2-DMA))(参见，WO 2010/042877；Semple等人,Nature Biotech.28:172-176(2010))或其混合物。(Heyes,J.,等人,JControlled Release 107:276-287(2005)；Morrissey,DV.,等人,Nat.Biotechnol.23(8):1003-1007(2005)；PCT公布WO2005/121348A1)。在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质包含咪唑、二烷基氨基、或胍盐部分中的至少一个。

在一些实施方案中，第二或额外阳离子脂质可选自XTC(2,2-二亚油基-4-二甲氨基乙基-[1,3]-二氧戊环)、MC3(((6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲氨基)丁酸酯)、ALNY-100((3aR,5s,6aS)-N,N-二甲基-2,2-二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)四氢-3aH-环戊[d][1,3]间二氧杂环戊烯-5-胺))、NC98-5(4,7,13-三(3-氧代-3-(十一烷基氨基)丙基)-N1,N16-双十一烷基-4,7,10,13-四氮杂十六烷-1,16-二酰胺)、DODAP(1,2-二油基-3-二甲基铵丙烷)、HGT4003(WO2012/170889，其教义通过引用整体并入本文)、ICE(WO 2011/068810，其教义通过引用整体并入本文)、HGT5000(美国临时专利申请No.61/617,468，其教义通过引用整体并入本文)或HGT5001(顺式或反式)(临时专利申请No.61/617,468)、氨基醇类脂质诸如公开于WO2010/053572中的那些、DOTAP(1,2-二油基-3-三甲基铵丙烷)、DOTMA(1,2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷)、DLinDMA(Heyes,J.；Palmer,L.；Bremner,K.；MacLachlan,I.“Cationic lipid saturation influencesintracellular delivery of encapsulated nucleic acids”J.Contr.Rel.2005,107,276-287)、DLin-KC2-DMA(Semple,S.C.等人“Rational Design of Cationic Lipids forsiRNA|Delivery”Nature Biotech.2010,28,172-176)、C12-200(Love,K.T.等人“Lipid-like materials for low-dose in vivo gene silencing”PNAS 2010,107,1864-1869)。

非阳离子/辅助脂质

在一些实施方案中，提供的脂质体含有一种或多种非阳离子(“辅助(helper)”)脂质。如本文所使用，短语"非阳离子脂质"是指任何中性、两性离子或阴离子脂质。如本文所使用，短语"阴离子脂质"是指在选定的pH诸如生理pH下携带净负电荷的许多脂质种类中的任一种。非阳离子脂质包括但不限于，二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰基油酰基-磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰基-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-l-羧酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰基-磷脂酰-乙醇胺(DSPE)、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、或其混合物。

在一些实施方案中，此类非阳离子脂质可以单独使用，但优选使用时与其它赋形剂，例如，阳离子脂质组合。在一些实施方案中，非阳离子脂质可包含约5％至约90％、或约10％至约70％摩尔比的存在于脂质体中的总脂质。在一些实施方案中，非阳离子脂质为中性脂质，即，在组合物被配制和/或施用所处的条件下不携带净电荷的脂质。在一些实施方案中，脂质体中的非阳离子脂质的百分比可以大于5％、大于10％、大于20％、大于30％、或大于40％。

基于胆固醇的脂质

在一些实施方案中，提供的脂质体包含一种或多种基于胆固醇的脂质。例如，合适的基于胆固醇的阳离子脂质包括，例如，DC-Choi(N,N-二甲基-N-乙基甲酰胺基胆固醇)、1,4-双(3-N-油基氨基-丙基)哌嗪(Gao,等人Biochem.Biophys.Res.Comm.179,280(1991)；Wolf等人BioTechniques 23,139(1997)；美国专利No.5,744,335)、或ICE。在一些实施方案中，基于胆固醇的脂质可包含约2％至约30％、或约5％至约20％摩尔比的存在于脂质体中的总脂质。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒中基于胆固醇的脂质的百分比可以大于5,％、10％、大于20％、大于30％、或大于40％。

聚乙二醇化的脂质

在一些实施方案中，提供的脂质体包含一种或多种聚乙二醇化的脂质。例如，本发明还设想聚乙二醇(PEG)-修饰的磷脂和衍生的脂质诸如衍生的神经酰胺(PEG-CER)(包括N-辛酰基-鞘氨醇-1-[琥珀酰基(甲氧基聚乙二醇)-2000](C8 PEG-2000神经酰胺))与一种或多种阳离子和在一些实施方案中连同包含脂质体的其它脂质组合使用。设想的PEG-修饰的脂质包括但不限于，共价连接至具有C

在一些实施方案中，特别使用的可交换脂质为具有较短酰基链(例如，C

根据各个实施方案，构成脂质纳米颗粒的第二或额外阳离子脂质、非阳离子脂质和/或PEG-修饰的脂质、以及此类脂质彼此的相对摩尔比的选择基于选定的脂质的特征、预期靶细胞的特性、待递送的mRNA的特征。额外考虑因素包括，例如，烷基链的饱和度、以及选定的脂质的大小、电荷、pH、pKa、融合性和毒性。由此，可相应地调节摩尔比。在一些实施方案中，脂质体中的PEG-修饰的脂质的百分比可以大于1％、大于2％、大于5％、大于10％、或大于15％。

聚合物

在一些实施方案中，合适的根据本发明的脂质体还包括与所述的一种或多种阳离子脂质和在一些实施方案中其它载体(包括本文所述的各种脂质)组合的聚合物。因此，在一些实施方案中，如本文所使用的脂质体递送媒介物还涵盖含有聚合物的纳米颗粒。合适的聚合物可以包括，例如，聚丙烯酸酯、聚烷基氰基丙烯酸酯、聚丙交酯、聚丙交酯-聚乙交酯共聚物、聚已酸内酯、葡聚糖、白蛋白、明胶、藻酸盐、胶原、壳聚糖、环糊精、鱼精蛋白、聚乙二醇化的鱼精蛋白、PLL、聚乙二醇化的PLL和聚乙烯亚胺(PEI)。当存在PEI时，其可以为具有在10至40kDA范围内的分子量的支链PEI，例如，25kDa支链PEI(Sigma#408727)。

在一些实施方案中，合适的脂质体制剂含有一种或多种阳离子脂质、一种或多种非阳离子脂质、一种或多种基于胆固醇的脂质一种或多种PEG-修饰的脂质、和/或一种或多种聚合物的组合。作为非限制性实例，合适的脂质体包含cKK-E12、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2K。在一些实施方案中，阳离子脂质：非阳离子脂质：基于胆固醇的脂质：聚乙二醇化的脂质的比率可以分别为约30-50:25-35:20-30:1-15。在一些实施方案中，阳离子脂质：非阳离子脂质：基于胆固醇的脂质：聚乙二醇化的脂质的比率可以分别为约40:30:20:10。在一些实施方案中，阳离子脂质：非阳离子脂质：基于胆固醇的脂质：聚乙二醇化的脂质的比率可以分别为约40:30:25:5。在一些实施方案中，阳离子脂质：非阳离子脂质：基于胆固醇的脂质：聚乙二醇化的脂质的比率可以分别为约40:32:25:3。

mRNA

本发明可用于递送任何mRNA。mRNA通常被认为是携带信息从DNA至核糖体的RNA类型。mRNA的存在通常是非常短暂的且包括加工和翻译，接着是降解。通常，于真核细胞生物体中，mRNA加工包括在N-端(5’)末端上添加“帽”以及在C-端(3’)末端上添加“尾部”。典型的帽为7-甲基鸟苷帽，其为通过5’-5’-三磷酸键连接至首先转录的核苷酸的鸟苷。帽的存在在提供对大多数真核细胞中发现的核酸酶的抗性方面是重要的。尾部通常为聚腺苷酸化事件，由此向所述mRNA分子的3’末端添加聚腺苷酸部分。该“尾部”的存在用来保护所述mRNA免受核酸外切酶降解。信使RNA通常被核糖体翻译成一系列构成蛋白质的氨基酸。

能够被翻译成一种或多种肽(例如，蛋白质)或肽片段的任何mRNA被设想为在本发明的范围内。在一些实施方案中，mRNA编码一种或多种天然存在的肽。在一些实施方案中，mRNA编码一种或多种修饰的或非天然的肽。

在一些实施方案中mRNA编码胞内蛋白质。在一些实施方案中，mRNA编码胞质蛋白质。在一些实施方案中，mRNA编码与肌动蛋白细胞骨架相关的蛋白质。在一些实施方案中，mRNA编码与质膜相关的蛋白质。在一些特定的实施方案中，mRNA编码跨膜蛋白质。在一些特定的实施方案中，mRNA编码离子通道蛋白质。在一些实施方案中，mRNA编码核周蛋白质。在一些实施方案中，mRNA编码核蛋白质。在一些特定的实施方案中，mRNA编码转录因子。在一些实施方案中，mRNA编码伴侣蛋白质。在一些实施方案中，mRNA编码胞内酶(例如，编码与尿素循环或溶酶体贮积代谢障碍相关的酶的mRNA)。在一些实施方案中，所述mRNA编码涉及细胞代谢、DNA修复、转录和/或翻译的蛋白质。在一些实施方案中，mRNA编码胞外蛋白质。在一些实施方案中，mRNA编码与胞外基质相关的蛋白质。在一些实施方案中mRNA编码分泌蛋白。在特定实施方案中，用于本发明组合物和方法中的mRNA可用于表达由一种或多种靶细胞排泄或分泌至周围细胞外液中的功能性蛋白质或酶(例如，编码激素和/或神经递质的mRNA)。

在一些实施方案中，本发明的组合物和方法提供递送编码分泌蛋白的mRNA。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法提供递送编码表1列出的一种或多种分泌蛋白的mRNA；因此，本发明的组合物可包含编码表1列出的蛋白质(或其同源物)的mRNA连同在本文中阐明的其它组分，并且本发明的方法可包括制备和/或施用包含编码表1列出的蛋白质(或其同源物)的mRNA连同在本文中阐明的其它组分的组合物。

表1.分泌蛋白

在一些实施方案中，本发明的组合物和方法提供递送编码表2中列出的一种或多种额外示例性蛋白质的一种或多种mRNA；因此，本发明的组合物可包含编码表2中列出的蛋白质(或其同源物)的mRNA连同在本文中阐明的其它组分，并且本发明的方法可包括制备和/或施用包含编码选自表2中列出的蛋白质(或其同源物)的蛋白质的mRNA连同在本文中阐明的其它组分的组合物。

表2.额外示例性蛋白质

表1和表2中阐明的Uniprot ID是指所列出的蛋白质的人型式并且每种蛋白质的序列可从Uniprot数据库获得。所列出蛋白质的序列也可一般用于各种动物，包括各种哺乳动物和兽医或工业有兴趣的动物。因此，在一些实施方案中，本发明的组合物和方法提供递送编码选自表1或表2中列出的分泌蛋白质的哺乳动物同源物或来自兽医或工业有兴趣的动物的同源物的一种或多种蛋白质的一种或多种mRNA；因而，本发明的组合物可包含编码选自表1或表2中列出的蛋白质的哺乳动物同源物或来自兽医或工业有兴趣的动物的同源物的蛋白质的mRNA连同在本文中阐明的其它组分，并且本发明的方法可包括制备和/或施用包含编码选自表1或表2中列出的蛋白质的哺乳动物同源物或来自兽医或工业有兴趣的动物的同源物的蛋白质的mRNA连同在本文中阐明的其它组分的组合物。在一些实施方案中，哺乳动物同源物选自小鼠、大鼠、仓鼠、沙鼠、马、猪、牛、美洲驼、羊驼、水貂、犬、猫、雪貂、绵羊、山羊或骆驼同源物。在一些实施方案中，兽医或工业有兴趣的动物选自以上列出的哺乳动物和/或鸡、鸭、火鸡、鲑鱼、鲶鱼或罗非鱼。

在实施方案中，本发明的组合物和方法提供递送编码选自表3的溶酶体蛋白质的mRNA。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法提供递送编码表3中列出的一种或多种溶酶体蛋白质和/或相关蛋白质的一种或多种mRNA；因此，本发明的组合物可包含编码表3中列出的蛋白质(或其同源物)的mRNA连同在本文中阐明的其它组分，并且本发明的方法可包括制备和/或施用包含编码选自表3中列出的蛋白质(或其同源物)的蛋白质的mRNA连同在本文中阐明的其它组分的组合物。

表3.溶酶体和相关蛋白

关于溶酶体蛋白质的信息可从Lubke等人,“Proteomics of the Lysosome,”Biochim Biophys Acta.(2009)1793:625–635获得。在一些实施方案中，表3中列出并且在本发明的组合物和方法中由mRNA编码的蛋白质是人蛋白质。所列出蛋白质的序列也可用于各种动物，包括如上所述各种哺乳动物和兽医或工业有兴趣的动物。

在一些实施方案中，本发明的组合物和方法提供递送编码治疗性蛋白(如，细胞质、跨膜或分泌的)诸如表4中列出的那些蛋白质的mRNA。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法提供递送编码用于治疗表4中列出的疾病或病症(即，适应症)的治疗性蛋白质的mRNA；因此，本发明的组合物可包含编码表4中列出或未列出的治疗性蛋白质(或其同源物，如下论述)的mRNA连同在本文中阐明的用于治疗表4中列出的疾病或病症(即，适应症)的其它组分，并且本发明的方法可包括制备和/或施用包含编码此类蛋白质(或其同源物，如下论述)的mRNA连同在本文中阐明的用于治疗表4中列出的疾病或病症的其它组分的组合物。

表4.示例性适应症和相关蛋白

在一些实施方案中，本发明用于预防、治疗和/或治愈受表1、2、3或4中列出的或与表1、2、3或4中列出的蛋白质相关的疾病或病症影响的受试者。在一些实施方案中，mRNA编码精氨琥珀酸合成酶(ASS1)、因子IX、运动神经元生存蛋白1(SMN1)、或苯丙氨酸羟化酶中的一种或多种。

mRNA的合成

根据本发明的mRNA可根据多种已知方法中的任一种来合成。例如，根据本发明的mRNA可经由体外转录(IVT)合成。简言之，IVT通常用含有启动子的线性或环状DNA模板、核糖核苷三磷酸酸池、可以包括DTT和镁离子的缓冲液系统、和适当的RNA聚合酶(例如，T3、T7或SP6 RNA聚合酶)、DNA酶I、焦磷酸酶和/或RNA酶抑制剂来进行。准确条件将根据特定应用而变化。

在一些实施方案中，为了制备根据本发明的mRNA，将DNA模板进行体外转录。合适的DNA模板通常具有用于体外转录的启动子，例如T3、T7或SP6启动子，紧跟着针对所需mRNA的所需核苷酸序列和终止信号。

根据本发明的所需mRNA序列可使用标准方法进行确定且并入DNA模板。例如，从所需氨基酸序列(例如，酶序列)开始，虚拟的逆向翻译基于简并的遗传密码来进行。优化算法然后可用于选择合适的密码子。通常，一方面，G/C含量可被优化以达到最高的可能G/C含量，另一方面，根据密码子使用将tRNA的频率纳入最可能的原因。可建立优化的RNA序列并且例如借助于适当的显示设备来显示，并与原始(野生型)序列比较。也可分析二级结构来计算稳定和失稳性能，或分别计算RNA的区域。

修饰的mRNA

在一些实施方案中，根据本发明的mRNA可被合成为未修饰的或修饰的mRNA。通常，对mRNA进行修饰以增强稳定性。对mRNA的修饰可包括，例如，对RNA的核苷酸的修饰。根据本发明的修饰mRNA可因此包括，例如，骨架修饰、糖修饰或碱基修饰。在一些实施方案中，mRNA可由天然存在的核苷酸和/或核苷酸类似物(修饰的核苷酸)合成，包括但不限于，嘌呤(腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G))或嘧啶(胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U))，以及嘌呤和嘧啶的经修饰的核苷酸类似物或衍生物，诸如例如1-甲基-腺嘌呤、2-甲基-腺嘌呤、2-甲基硫代-N-6-异戊烯基-腺嘌呤、N6-甲基-腺嘌呤、N6-异戊烯基-腺嘌呤、2-硫代-胞嘧啶、3-甲基-胞嘧啶、4-乙酰基-胞嘧啶、5-甲基-胞嘧啶、2,6-二氨基嘌呤、1-甲基-鸟嘌呤、2-甲基-鸟嘌呤、2,2-二甲基-鸟嘌呤、7-甲基-鸟嘌呤、肌苷、1-甲基-肌苷、假尿嘧啶(5-尿嘧啶)、二氢-尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶、4-硫代-尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代-尿嘧啶、5-(羧基羟基甲基)-尿嘧啶、5-氟-尿嘧啶、5-溴-尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-尿嘧啶、5-甲基-2-硫代-尿嘧啶、5-甲基-尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、5-甲基氨基甲基-尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫代-尿嘧啶、5'-甲氧基羰基甲基-尿嘧啶、5-甲氧基-尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、1-甲基-假尿嘧啶、Q核苷(queosine)、.β.-D-甘露糖基-Q核苷、怀丁氧苷(wybutoxosine)和氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、肽核苷酸、甲基膦酸酯、7-脱氮鸟苷、5-甲基胞苷和肌苷。例如由美国专利No.4,373,071、美国专利No.4,401,796、美国专利No.4,415,732、美国专利No.4,458,066、美国专利No.4,500,707、美国专利No.4,668,777、美国专利No.4,973,679、美国专利No.5,047,524、美国专利No.5,132,418、美国专利No.5,153,319、美国专利No.5,262,530和5,700,642，本领域技术人员已知此类类似物的制备，所述专利的公开通过引用整体并入。

在一些实施方案中，mRNA(例如，编码mRNA的酶)可含有RNA骨架修饰。通常，骨架修饰是RNA中含有的核苷酸的骨架的磷酸被化学修饰的修饰。示例性骨架修饰通常包括但不限于，由以下组成的组的修饰：甲基膦酸酯、甲基氨基磷酸酯、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯(例如胞苷5'-O-(1-硫代磷酸酯))、硼代磷酸酯、荷正电的胍盐基团等，这意指用其它阴离子、阳离子或中性基团替换磷酸二酯键联。

在一些实施方案中，mRNA (例如，编码mRNA的酶)可含有糖修饰。典型的糖修饰为其所含的核苷酸的糖的化学修饰，包括但不限于，选自由以下组成的组的糖修饰：2'-脱氧-2'-氟-寡核糖核苷酸(2'-氟-2'-脱氧胞苷5'-三磷酸、2'-氟-2'-脱氧尿苷5'-三磷酸)、2'-脱氧-2'-脱胺-寡核糖核苷酸(2'-氨基-2'-脱氧胞苷5'-三磷酸、2'-氨基-2'-脱氧尿苷5'-三磷酸)、2'-O-烷基寡核糖核苷酸、2'-脱氧-2'-C-烷基寡核糖核苷酸(2'-O-甲基胞苷5'-三磷酸、2'-甲基尿苷5'-三磷酸)、2'-C-烷基寡核糖核苷酸及其异构体(2'-阿糖胞苷5'-三磷酸、2'-阿糖尿苷5'-三磷酸)、或叠氮基三磷酸(2'-叠氮基-2'-脱氧胞苷5'-三磷酸、2'-叠氮基-2'-脱氧尿苷5'-三磷酸)。

在一些实施方案中，mRNA(例如，编码mRNA的酶)可含有核苷酸的碱基的修饰(碱基修饰)。含有碱基修饰的修饰核苷酸也被称为碱基修饰的核苷酸。此类碱基修饰的核苷酸的实例包括但不限于，2-氨基-6-氯嘌呤核苷5'-三磷酸、2-氨基腺苷5'-三磷酸、2-硫代胞苷5'-三磷酸、2-硫代尿苷5'-三磷酸、4-硫代尿苷5'-三磷酸、5-氨基烯丙基胞苷5'-三磷酸、5-氨基烯丙基尿苷5'-三磷酸、5-溴胞苷5'-三磷酸、5-溴尿苷5'-三磷酸、5-碘胞苷5'-三磷酸、5-碘尿苷5'-三磷酸、5-甲基胞苷5'-三磷酸、5-甲基尿苷5'-三磷酸、6-氮杂胞苷5'-三磷酸、6-氮杂尿苷5'-三磷酸、6-氯嘌呤核苷5'-三磷酸、7-脱氮腺苷5'-三磷酸、7-脱氮鸟苷5'-三磷酸、8-氮杂腺苷5'-三磷酸、8-叠氮基腺苷5'-三磷酸、苯并咪唑核苷5'-三磷酸、N1-甲基腺苷5'-三磷酸、N1-甲基鸟苷5'-三磷酸、N6-甲基腺苷5'-三磷酸、O6-甲基鸟苷5'-三磷酸、假尿苷5'-三磷酸、嘌呤霉素5'-三磷酸或黄嘌呤核苷5'-三磷酸。

通常，mRNA合成包括在N-端(5’)末端上添加“帽”以及在C-端(3’)末端上添加“尾部”。帽的存在在提供对大多数真核细胞中发现的核酸酶的抗性方面是重要的。该“尾部”的存在用来保护所述mRNA免受核酸外切酶降解。

因此，在一些实施方案中，mRNA(例如，编码mRNA的酶)包括5’帽结构。5’帽通常如下添加：首先，RNA末端磷酸酶从5’核苷酸去除一个末端磷酸基团，留下两个末端磷酸；然后经由鸟苷酰基转移酶向末端磷酸添加鸟苷三磷酸(GTP)，产生5’5’5三磷酸键联；然后通过甲基转移酶使鸟嘌呤的7-氮甲基化。帽结构的实例包括但不限于，m7G(5')ppp(5'(A,G(5')ppp(5')A和G(5')ppp(5')G。

在一些实施方案中，天然存在的帽结构包含经由三磷酸桥连接至首先转录的核苷酸的5'-端的7-甲基鸟苷，产生m

通过体外转录生成的mRNA的常见帽为m

迄今为止，体外翻译实验中使用的合成的二核苷酸帽的常见形式为抗反转帽类似物(“ARCA”)或修饰的ARCA，其一般为2'或3'OH基团被替换为-OCH

额外帽类似物包括但不限于，选自由以下组成的组的化学结构：m

在一些实施方案中，合适的帽为经由三磷酸桥连接至首先转录的核苷酸的5'-端的7-甲基鸟苷酸(“m

在一些实施方案中，所述帽为Cap0结构。Cap0结构缺失连接至碱基1和2的核糖的2'-O-甲基残基。在一些实施方案中，所述帽为Cap1结构。Cap1结构具有在碱基2处的2'-O-甲基残基。在一些实施方案中，所述帽为Cap2结构。Cap2结构具有连接至碱基2和3的2'-O-甲基残基。

多种m

通常，“尾部”的存在用来保护mRNA免受核酸外切酶降解。聚A尾部被认为稳定天然信使且合成有义RNA。因此，在某些实施方案中长的聚A尾部可被添加至mRNA分子，因此致使RNA更稳定。聚A尾部可使用多种本领域公认的技术来添加。例如，使用聚A聚合酶可将长的聚A尾部添加至合成的或体外转录的RNA(Yokoe,等人Nature Biotechnology.1996；14:1252-1256)。转录载体也可编码长的聚A尾部。此外，聚A尾部可通过直接从PCR产物转录而添加。聚A也可用RNA连接酶连接至有义RNA的3'端(参见，例如，Molecular Cloning ALaboratory Manual，第2版，由Sambrook、Fritsch和Maniatis编辑(Cold Spring HarborLaboratory Press:1991版))。

在一些实施方案中，mRNA(例如，编码mRNA的酶)包括3’聚(A)尾部结构。通常，聚A尾部的长度可以为至少约10、50、100、200、300、400、至少500个核苷酸(SEQ ID NO:12)。在一些实施方案中，mRNA的3'末端上的聚-A尾部通常包括约10至300个腺苷核苷酸(SEQ IDNO:13)(例如，约10至200个腺苷核苷酸、约10至150个腺苷核苷酸、约10至100个腺苷核苷酸、约20至70个腺苷核苷酸、或约20至60个腺苷核苷酸)。在一些实施方案中，mRNA包括3’聚(C)尾部结构。mRNA的3'末端上的合适的聚-C尾部通常包括约10至200个胞嘧啶核苷酸(SEQID NO:14)(例如，约10至150个胞嘧啶核苷酸、约10至100个胞嘧啶核苷酸、约20至70个胞嘧啶核苷酸、约20至60个胞嘧啶核苷酸、或约10至40个胞嘧啶核苷酸)。聚-C尾部可被添加至聚-A尾部或可取代聚-A尾部。

在一些实施方案中，调节聚A或聚C尾部的长度以控制本发明的修饰的有义mRNA分子的稳定性，因此，控制蛋白质的转录。例如，因为聚A尾部的长度可影响有义mRNA分子的半衰期，因此可调节聚A尾部的长度来修饰所述mRNA对核酸酶的抗性的水平，从而控制靶细胞中多核苷酸表达和/或多肽产生的时程。

在一些实施方案中，mRNA包括5’和/或3’非翻译区。在一些实施方案中，5’非翻译区包括影响mRNA的稳定性或翻译的一个或多个元件，例如，铁反应元件。在一些实施方案中，5’非翻译区的长度可以为约50至500个核苷酸之间。

在一些实施方案中，3’非翻译区包括以下的一个或多个：聚腺苷酸化信号、影响细胞中mRNA的位置稳定性的蛋白质的结合位点、或者一个或多个miRNA结合位点。在一些实施方案中，3’非翻译区的长度可以为50至500个核苷酸之间或更长。

示例性3'和/或5'UTR序列可源自稳定的mRNA分子(例如，珠蛋白、肌动蛋白、GAPDH、微管蛋白、组蛋白或柠檬酸循环酶)以增加有义mRNA分子的稳定性。例如，5’UTR序列可以包括CMV立即早期1(IE1)基因的部分序列、或其片段以改善核酸酶抗性和/或改善多核苷酸的半衰期。也设想将编码人生长激素(hGH)的序列、或其片段包含至多核苷酸(例如，mRNA)的3’端或非翻译区以进一步稳定多核苷酸。一般来说，这些修饰与未修饰对应物相比，改善多核苷酸的稳定性和/或药代动力学性质(例如，半衰期)，并且包括例如为改善此类多核苷酸对体内核酸酶消化的抗性所作出的修饰。

根据各个实施方案，任何大小的mRNA可被提供的脂质体包封。在一些实施方案中，提供的脂质体可包封长度大于约0.5kb、1kb、1.5kb、2kb、2.5kb、3kb、3.5kb、4kb、4.5kb或5kb的mRNA。

脂质体的形成

提供的组合物中所用的脂质体可通过目前本领域中已知的各种技术来制备。例如，通过常见技术可制备多层囊泡(MLV)，例如，通过将选择的脂质沉积在合适容器或器皿的内壁上；通过将脂质溶解在合适溶剂中，以及然后蒸发溶剂以在器皿的内侧留下薄膜或者通过喷雾干燥。可将水相加入涡旋运动着的器皿，其导致形成MLV。然后通过均质化、超声处理或挤压多层囊泡能够形成单层囊泡(ULV)。此外，通过洗涤剂去除技术能够形成单层囊泡。

在某些实施方案中，提供的组合物包含脂质体，其中所述mRNA与脂质体的两个表面缔合，并包封在相同的脂质体内。例如，在制备本发明的组合物过程中，阳离子脂质体可与mRNA通过静电相互作用缔合。例如，在制备本发明的组合物过程中，阳离子脂质体可与mRNA通过静电相互作用缔合。

在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包含包封于脂质体中的mRNA。在一些实施方案中，一个或多个mRNA种类可包封于相同的脂质体中。在一些实施方案中，一个或多个mRNA种类可包封于不同脂质体中。在一些实施方案中，所述mRNA包封于一种或多种脂质体中，其脂质组成、脂质组分的摩尔比、大小、电荷(ζ电位)、靶向配体和/或其组合不同。在一些实施方案中，一种或多种脂质体可具有阳离子脂质、中性脂质、PEG-修饰的脂质和/或其组合的不同组成。在一些实施方案中一种或多种脂质体可具有不同摩尔比的使用的阳离子脂质、中性脂质、胆固醇和PEG-修饰的脂质以产生脂质体。

所需mRNA并入脂质体的过程通常被称为“负载”。示例性方法描述于Lasic,等人,FEBS Lett.,312:255-258,1992(通过引用并入本文)中。并入脂质体的核酸可完全或部分位于脂质体的内部空间内，位于脂质体的双层膜内，或与脂质体膜的外表面缔合。核酸并入脂质体中在本文也称为“包封”，其中核酸被完全包含在脂质体的内部空间内。mRNA并入转移媒介物诸如脂质体中的目的通常是保护核酸免受可含有降解核酸的酶或化学物质的环境和/或导致核酸快速排泄的系统或受体的影响。因此，在一些实施方案中，合适的递送媒介物能够增强包含于其中的mRNA的稳定性和/或促进mRNA递送至靶细胞或组织。

脂质体大小

根据本发明的适合脂质体可被制备成各种大小。在一些实施方案中，提供的脂质体可被制备成小于先前已知的mRNA包封脂质体。在一些实施方案中，减少的大小的脂质体与更有效地递送mRNA相关。选择适当的脂质体大小可考虑靶细胞或组织的位点以及正制备的脂质体的应用程度。

在一些实施方案中，选择适当大小的脂质体来促进由mRNA编码的抗体的全身分布。在一些实施方案中，可期望限制mRNA向某些靶细胞或组织的转染。例如，为了靶向肝细胞，可以规定脂质体的大小以使其尺寸比在肝中内皮层衬里肝窦状隙的开窗(fenestration)要小；在这种情况下，脂质体可容易地渗透此类内皮开窗以到达靶肝细胞。

可选地或此外，可定脂质体的大小以使脂质体的尺寸具有足够大的直径以限制或明显避免分布至某些细胞或组织。例如，可定脂质体的大小以使其尺寸大于内皮层衬里肝窦状隙的开窗，从而限制脂质体分布至肝细胞。

在一些实施方案中，脂质体的大小由脂质体颗粒的最大直径的长度确定。在一些实施方案中，合适的脂质体具有为或小于约500nm、450nm、400nm,350nm、300nm、250nm、200nm、150nm、125nm、110nm、100nm、95nm、90nm、85nm、80nm、75nm、70nm、65nm、60nm、55nm或50nm的大小。在一些实施方案中，合适的脂质体具有不超过约250nm(例如，不超过约225nm、200nm、175nm、150nm、125nm、100nm、75nm或50nm)的大小。在一些实施方案中，合适的脂质体具有在约10-250nm范围内(例如，在约10-225nm、10-200nm、10-175nm、10-150nm、10-125nm、10-100nm、10-75nm、或10-50nm范围内)的大小。在一些实施方案中，合适的脂质体具有在约100-250nm范围内(例如，在约100-225nm、100-200nm、100-175nm、100-150nm范围内)的大小。在一些实施方案中，合适的脂质体具有在约10-100nm范围内(例如，在约10-90nm、10-80nm、10-70nm、10-60nm、或10-50nm范围内)的大小。

本领域已知的多种可选方法可用于规定脂质体群体的大小。此类规定大小的方法之一描述于美国专利No.4,737,323(其通过引用并入本文)中。通过水浴或探针超声处理来对脂质体混悬液进行超声以产生逐渐尺寸降低至直径小于约0.05微米的小ULV。均质化是取决于将大脂质体撕裂为较小脂质体的剪切能量的另一种方法。在典型的均质化过程中，将MLV通过标准乳剂均化器再循环直至观察到通常介于约0.1至0.5微米之间的选择的脂质体大小。通过如在Bloomfield,Ann.Rev.Biophys.Bioeng.,10:421-150(1981)(其通过引用并入本文)描述的准弹性光散射(QELS)可确定脂质体的尺寸。通过对形成的脂质体超声处理可降低平均脂质体直径。使用QELS评估可替代间歇的超声处理循环以引导有效的脂质体合成。

药物组合物

为促进mRNA体内的表达，递送媒介物诸如脂质体可与一种或多种额外核酸、载体、靶向配体或稳定试剂组合地配制，或于其混合有合适的赋形剂的药理学组合物中配制。用于配制和施用药物的技术可于"Remington's Pharmaceutical Sciences,"MackPublishing Co.,Easton,Pa.,最新版本中发现。

根据目前的医疗实践，并考虑受试者的临床条件、施用位点和方法、施用方案、受试者的年龄、性别、体重和与本领域普通临床医生相关的其它因素可施用和给予提供的脂质体包封或缔合的mRNA以及含有其的组合物。通过如实验临床研究、药理学、临床和医学领域普通技术人员已知的此类相关考虑可确定用于本文的“有效量”。在一些实施方案中，施用的量有效地达到症状的至少某些稳定、改善或消除和如通过本领域技术人员适当测定疾病进展、退化或改善所选择的其它指标。例如，合适的量和给药方案是至少导致瞬时蛋白(例如，酶)产生的原因之一。

合适的施用途径包括例如口服、直肠、阴道、经粘膜、经肺(包括气管内或吸入)，或者肠部施用；胃肠外递送，包括皮内、经皮(局部)、肌内、皮下、髓内注射、以及鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内和/或鼻内施用。

交替地或此外，可局部施用本发明的脂质体包封的mRNA和组合物，而不是全身方式，例如，通过直接注射药物组合物至靶向组织内，优选在持续释放的制剂中。取决于待靶向的组织，能够以各种方式影响局部递送。例如，能够吸入(用于经鼻、经气管或经支气管递送)含有本发明的组合物的气溶胶；能够将本发明的组合物注射至受损伤、疾病迹象或疼痛的位点，例如；组合物能够以用于口服、气管或食管应用的锭剂形式提供；能够以施用至胃或小肠的液体、片剂或胶囊剂形式提供；能够以用于直肠或阴道应用的栓剂形式提供；或者甚至能够通过使用霜剂、滴剂或者甚至注射递送至眼。甚至能够手术施用包含与治疗性分子或配体复合的所提供的组合物的制剂，例如与聚合物或其它结构或者物质缔合，这能够使得组合物从植入位点扩散至周围细胞。可选地，在没有使用聚合物或支持物下能够将它们手术施用。

在一些实施方案中，配制所提供的脂质体和/或组合物以使它们适合于延长释放包含于其中的mRNA。在延长的给药间隔下可方便地向受试者施用此类延长释放的组合物。例如，在一个实施方案中，每日两次、每日一次或隔日一次向受试者施用本发明的组合物。在一个优选的实施方案中，每周两次、每周一次、每十天一次、每两周一次、每三周一次，或者更优选每四周一次、每月一次、每六周一次、每八周一次、隔月一次、每三个月一次、每四个月一次、每六个月一次、每八个月一次、每九个月一次或每年一次向受试者施用本发明的组合物。也设想组合物和脂质体，将其配制用于储库施用(例如，肌肉内、皮下、玻璃体内)以在延长的时间段内递送或释放mRNA。优选地，将采用的延长释放方式与对mRNA进行的修饰联合使用以增强稳定性。

本文也设想包含本文公开的一种或多种脂质体的冻干的药物组合物以及使用如在例如2011年6月8日提交的美国临时申请No.61/494,882中公开的此类组合物的相关的方法，其教义通过引用整体并入本文。例如，在施用之前可重构或者能够体内重构根据本发明的冻干的药物组合物。例如，冻干的药物组合物可被配制为适当的剂型(例如，皮内剂型，例如片、棒或膜)并施用它们使得随着时间推移通过个体的体液在体内使剂型再水化。

提供的脂质体和组合物可施用至任何所需组织。在一些实施方案中，通过提供的脂质体或组合物递送的mRNA在施用脂质体和/或组合物的组织中表达。在一些实施方案中，递送的所述mRNA在不同于施用脂质体和/或组合物的组织的组织中表达。递送的mRNA可被递送和/或表达的示例性组织包括但不限于肝、肾、心、脾、血清、脑、骨骼肌、淋巴结、皮肤和/或脑脊液中。

根据各个实施方案，可调节递送的mRNA的表达时机以适合特定的医疗需要。在一些实施方案中，由递送的mRNA编码的蛋白质的表达可在单次施用提供的脂质体或组合物后1、2、3、6、12、18、24、30、36、42、48、54、60、66和/或72小时于血清或靶组织中检测到。在一些实施方案中，由所述mRNA编码的蛋白质的表达可在单次施用提供的脂质体或组合物后1天、2天、3天、4天、5天、6天和/或7天于血清或靶组织中检测到。在一些实施方案中，由所述mRNA编码的蛋白质的表达可在单次施用提供的脂质体或组合物后1周、2周、3周和/或4周于血清或靶组织中检测到。在一些实施方案中，由所述mRNA编码的蛋白质的表达可在单次施用提供的脂质体或组合物后1个月或更长时间后检测到。

本发明可用于以不同剂量递送mRNA。在一些实施方案中，mRNA以约0.1–5.0mg/kg体重范围内的剂量例如约0.1–4.5、0.1–4.0、0.1–3.5、0.1–3.0、0.1–2.5、0.1–2.0、0.1–1.5、0.1–1.0、0.1-0.5、0.1-0.3、0.3–5.0、0.3-4.5、0.3–4.0、0.3–3.5、0.3–3.0、0.3–2.5、0.3–2.0、0.3–1.5、0.3–1.0、0.3-0.5、0.5–5.0、0.5-4.5、0.5–4.0、0.5–3.5、0.5–3.0、0.5–2.5、0.5–2.0、0.5–1.5、或0.5–1.0mg/kg体重施用。在一些实施方案中，mRNA以为或小于约5.0、4.5、4.0、3.5、3.0、2.5、2.0、1.5、1.0、0.8、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1mg/kg体重的剂量施用。

本发明还包括以下实施方案

实施方案1.一种体内递送信使RNA(mRNA)的方法，所述方法包括：

向需要递送的受试者施用包含包封在脂质体内的编码蛋白质的mRNA的组合物，以使施用所述组合物导致由所述mRNA编码的蛋白质的体内表达；

其中所述脂质体包含式I-c的阳离子脂质：

或其药学上可接受的盐，

其中：

p是1至9之间的整数，包括端值；

R

R

式(i)、(ii)和(iii)为：

其中：

R’的每个实例独立地为氢或任选取代的烷基；

X为O、S或NR

Y为O、S或NR

R

R

实施方案2.如实施方案1所述的方法，其中所述阳离子脂质为cKK-E12：

实施方案3.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述脂质体还包含一种或多种非阳离子脂质、一种或多种基于胆固醇的脂质和/或一种或多种PEG-修饰的脂质。

实施方案4.如实施方案3所述的方法，其中所述一种或多种非阳离子脂质选自DSPC(1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、DPPC(1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、DOPE(1，2-二油基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DOPC(1，2-二油基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱)DPPE(1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DMPE(1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DOPG(1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1′-rac-甘油))。

实施方案5.如实施方案3或4所述的方法，其中所述一种或多种基于胆固醇的脂质是胆固醇和/或聚乙二醇化的胆固醇。

实施方案6.如实施方案3-5中任一项所述的方法，其中所述一种或多种PEG-修饰的脂质包含共价连接至具有C

实施方案7.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述脂质体包含cKK-E12、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2K。

实施方案8.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述阳离子脂质构成约30-50％摩尔比的所述脂质体。

实施方案9.如实施方案8所述的方法，其中所述阳离子脂质构成约40％摩尔比的所述脂质体。

实施方案10.如实施方案7-9中任一项所述的方法，其中cKK-E12∶DOPE∶胆固醇∶DMG-PEG2K的比率为约40∶30∶20∶10摩尔比。

实施方案11.如实施方案7-9中任一项所述的方法，其中cKK-E12∶DOPE∶胆固醇∶DMG-PEG2K的比率为约40∶30∶25∶5摩尔比。

实施方案12.如实施方案7-9中任一项所述的方法，其中cKK-E12∶DOPE∶胆固醇∶DMG-PEG2K的比率为约40∶32∶25∶3摩尔比。

实施方案13.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述脂质体具有小于约250nm、200nm、150nm、100nm、75nm或50nm的大小。

实施方案14.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中静脉内施用所述组合物。

实施方案15.如实施方案1-13中任一项所述的方法，其中经由肺递送施用所述组合物。

实施方案16.如实施方案15所述的方法，其中通过气溶胶化、吸入、雾化或滴注进行所述肺递送。

实施方案17.如实施方案1-13中任一项所述的方法，其中鞘内施用所述组合物。

实施方案18.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中由所述mRNA编码的蛋白质的表达可于肝、肾、心、脾、血清、脑、骨骼肌、淋巴结、皮肤和脑脊液中检测到。

实施方案19.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中由所述mRNA编码的蛋白质的表达可在所述施用后3小时检测到。

实施方案20.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中由所述mRNA编码的蛋白质的表达可在所述施用后6小时检测到。

实施方案21.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中由所述mRNA编码的蛋白质的表达可在所述施用后12小时检测到。

实施方案22.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中由所述mRNA编码的蛋白质的表达可在所述施用后24小时检测到。

实施方案23.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中由所述mRNA编码的蛋白质的表达可在所述施用后1周检测到。

实施方案24.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述mRNA具有为或大于约0.5kb、1kb、1.5kb、2kb、2.5kb、3kb、3.5kb、4kb、4.5kb或5kb的长度。

实施方案25.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中由所述mRNA编码的蛋白质为胞质蛋白质。

实施方案26.如实施方案1-24中任一项所述的方法，其中由所述mRNA编码的蛋白质为分泌蛋白。

实施方案27.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中由所述mRNA编码的蛋白质为酶。

实施方案28.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中由所述mRNA编码的蛋白质为精氨琥珀酸合成酶(ASS1)、因子IX、运动神经元生存蛋白1、或苯丙氨酸羟化酶。

实施方案29.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述mRNA以约0.1-2.0mg/kg体重范围内的剂量施用。

实施方案30.如实施方案1-28中任一项所述的方法，其中所述mRNA以为或小于约1.0mg/kg体重的剂量施用。

实施方案31.如实施方案1-28中任一项所述的方法，其中所述mRNA以为或小于约0.5mg/kg体重的剂量施用。

实施方案32.如实施方案1-28中任一项所述的方法，其中所述mRNA以为或小于约0.3mg/kg体重的剂量施用。

实施方案33.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述mRNA包含一种或多种修饰的核苷酸。

实施方案34.如实施方案33所述的方法，其中所述一种或多种修饰的核苷酸包含假尿苷、N-1-甲基-假尿苷、2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并-嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、O(6)-甲基鸟嘌呤和/或2-硫代胞苷。

实施方案35.如实施方案1-32中任一项所述的方法，其中所述mRNA未经修饰。

实施方案36.一种治疗疾病或病症的方法，其包括

向需要治疗的受试者施用包含包封在脂质体内的编码治疗性蛋白的mRNA的组合物，以使施用所述组合物导致受所述疾病或病症影响的一个或多个组织中由所述mRNA编码的蛋白质的表达；

其中所述脂质体包含式I-c的阳离子脂质：

或其药学上可接受的盐，

其中：

p是1至9之间的整数，包括端值；

R2的每个实例独立地为氢或任选取代的C

R6和R7的每个实例独立地为式(i)、(ii)或(iii)的基团；

式(i)、(ii)和(iii)为：

其中：

R’的每个实例独立地为氢或任选取代的烷基；

X为O、S或NR

Y为O、S或NR

R

R

实施方案37.如实施方案36所述的方法，其中所述阳离子脂质为cKK-E12：

实施方案38.一种用于递送信使RNA(mRNA)的组合物，其包含包封在脂质体内的编码蛋白质的mRNA，其中所述脂质体包含式I-c的阳离子脂质：

或其药学上可接受的盐，

其中：

p是1至9之间的整数，包括端值；

R

R

式(i)、(ii)和(iii)为：

其中：

R’的每个实例独立地为氢或任选取代的烷基；

X为O、S或NR

Y为O、S或NR

R

R

实施方案39.如实施方案38所述的组合物，其中所述阳离子脂质为cKK-E12：

实施方案40.如实施方案38或39所述的组合物，其中所述脂质体还包含一种或多种非阳离子脂质、一种或多种基于胆固醇的脂质和/或一种或多种PEG-修饰的脂质。

实施方案41.如实施方案38-40中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种非阳离子脂质选自DSPC(1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、DPPC(1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、DOPE(1，2-二油基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DOPC(1，2-二油基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱)DPPE(1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DMPE(1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DOPG(1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1′-rac-甘油))。

实施方案42.如实施方案40或41所述的组合物，其中所述脂质体还包含一种或多种非阳离子脂质、一种或多种基于胆固醇的脂质和/或一种或多种PEG-修饰的脂质。

实施方案43.如实施方案40-42中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种PEG-修饰的脂质包含共价连接至具有C

实施方案44.如实施方案40-43中任一项所述的组合物，其中所述脂质体包含cKK-E12、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2K。

实施方案45.如实施方案40-44中任一项所述的组合物，其中所述阳离子脂质构成约30-50％摩尔比的所述脂质体。

实施方案46.如实施方案45所述的组合物，其中所述阳离子脂质构成约40％摩尔比的所述脂质体。

实施方案47.如实施方案40-46中任一项所述的组合物，其中cKK-E12∶DOPE∶胆固醇∶DMG-PEG2K的比率为约40∶30∶20∶10摩尔比。

实施方案48.如实施方案40-46中任一项所述的组合物，其中cKK-E12∶DOPE∶胆固醇∶DMG-PEG2K的比率为约40∶30∶25∶5摩尔比。

实施方案49.如实施方案40-46中任一项所述的组合物，其中cKK-E12∶DOPE∶胆固醇∶DMG-PEG2K的比率为约40∶32∶25∶3摩尔比。

实施方案50.如实施方案38-50中任一项所述的组合物，其中所述脂质体具有小于约250nm、200nm、150nm、100nm、75nm或50nm的大小。

实施方案51.如实施方案38-50中任一项所述的组合物，其中所述组合物被配制用于静脉内施用。

实施方案52.如实施方案38-50中任一项所述的组合物，其中所述组合物被配制用于肺递送。

实施方案53.如实施方案52所述的组合物，其中所述组合物被配制成可呼吸颗粒、可雾化脂质、或可吸入干粉。

实施方案54.如实施方案38-50中任一项所述的组合物，其中所述组合物被配制用于鞘内施用。

实施方案55.如实施方案38-54中任一项所述的组合物，其中所述mRNA具有为或大于约0.5kb、1kb、1.5kb、2kb、2.5kb、3kb、3.5kb、4kb、4.5kb或5kb的长度。

实施方案56.如实施方案38-55中任一项所述的组合物，其中由所述mRNA编码的蛋白质为精氨琥珀酸合成酶(ASS1)、因子IX、运动神经元生存蛋白1、或苯丙氨酸羟化酶。

实施例

尽管已根据某些实施方案具体描述本发明的某些化合物、组合物和方法，但是下列实施例仅用来说明本发明的化合物并不旨在限制它们。

实施例1.用于mRNA递送和表达的示例性脂质体制剂

该实施例提供并入本申请中描述的阳离子脂质(例如cKK-E12)的示例性脂质体制剂，用于在体内有效地递送和表达编码治疗性蛋白质的mRNA。

脂质材料

通常，本文所述的制剂基于各种比率的多组分脂质混合物，采用设计用来包封各种基于核酸的材料的一种或多种阳离子脂质、一种或多种辅助脂质(例如，非阳离子脂质和/或基于胆固醇的脂质)、以及一种或多种聚乙二醇化的脂质。作为非限制性实例，cKK-E12(3,6-双(4-(双(2-羟基十二烷基)氨基)丁基)哌嗪-2,5-二酮)用于本文所述的的各种制剂中。示例性辅助脂质包括以下的一种或多种：DSPC(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、DPPC(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、DOPE(1,2-二油基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DOPC(1,2-二油基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱)DPPE(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DMPE(1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DOPG(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油))、胆固醇等。示例性聚乙二醇化的脂质包括共价连接至具有C

信使RNA材料

本文所述的制剂可用于递送任何mRNA，特别地是，治疗性mRNA。如本文所使用，治疗性mRNA是指编码治疗性蛋白质的mRNA。本文所述的制剂也可用于递送任何修饰的或未修饰的mRNA、或具有天然存在的序列或密码子优化的mRNA。

作为非限制性实例，人因子IX(FIX)、密码子优化的萤火虫荧光素酶(FFL)、密码子优化的人精氨琥珀酸合成酶(ASS1)信使RNA、密码子优化的人运动神经元生存蛋白1(SMN)mRNA通过如下合成：从编码基因的质粒DNA模板体外转录，之后添加5’帽结构(Cap 1)(Fechter,P.；Brownlee,G.G.“Recognition of mRNA cap structures by viral andcellular proteins”J.Gen.Virology 2005,86,1239-1249)和例如长度约250个核苷酸的3’聚(A)尾部(SEQ ID NO:15)，如通过凝胶电泳确定的。通常，5’和3’非翻译区(UTR)存在于每个mRNA产物中并且分别被表示为X和Y。下面描述实施例5’和3’UTR序列。下面列出在本文实施例中使用的FIX、ASS1和FFL mRNA的示例性序列。也示出5’和3’UTR序列。

人因子IX(FIX)mRNA：

密码子优化的人精氨琥珀酸合成酶(ASS1)mRNA：

密码子优化的萤火虫荧光素酶(FFL)mRNA：

密码子优化的人运动神经元生存蛋白1(SMN)mRNA：

5’和3’UTR序列

X(5’UTR序列)＝

Y(3’UTR序列)＝

或

C-端His

密码子优化的人CFTR mRNA：

具有生长激素前导序列(斜体且加下划线的)的密码子优化的人CFTR mRNA编码序列：

将cKK-E12、DOPE、Chol和DMG-PEG2K的50mg/mL乙醇溶液的等分试样以40:30:25:5的摩尔比混合且用乙醇稀释至3mL最终体积。分别地，FIX、ASS1或FFL mRNA的水性缓冲液(10mM柠檬酸盐/150mM NaCl，pH 4.5)由1mg/mL储备液制备。将脂质溶液快速注入到mRNA水溶液中并振摇以得到于20％乙醇中的最终悬浮液。过滤所得纳米颗粒悬浮液，用1x PBS(pH7.4)透析过滤，浓缩且于2-8℃下贮存。FIX mRNA的最终浓度为约0.77mg/mL FIX mRNA(包封的)，Z

实施例2.施用负载mRNA的脂质体纳米颗粒

本实施例说明施用负载mRNA的脂质体纳米颗粒的示例性方法和用于在体内各个靶组织中分析递送的mRNA和随后表达的蛋白质的方法。

所有研究在每个实验开始时使用约6-8周龄的雄性CD-1小鼠进行。通过单次弹丸尾静脉注射1.0mg/kg等效总剂量(或另有指明)的包封的FIX、FFL或ASS1 mRNA来引入样品。处死小鼠并在指定时间点处用盐水灌注。

收集每只小鼠的各个器官组织诸如肝、脾、肾和心，分配到各部分，且贮存于10％中性缓冲福尔马林中或速冻且在-80℃下贮存用于分析。

所有动物在剂量施用后的指定时间点(±5％)通过CO

酶联免疫吸附测定(ELISA)分析

A.人FIX ELISA

按照对于人FIX ELISA试剂盒(AssayMax,Assay Pro,Catalog#EF1009-1)报道的程序进行FIX蛋白的定量。

B.人ASS1 ELISA

标准ELISA程序采用小鼠抗-ASS1 2D1-2E12 IgG作为捕获抗体，使用兔抗-ASS1#3285IgG作为二级(检测)抗体(Shire Human Genetic Therapies)来进行。辣根过氧化物酶(HRP)-缀合的山羊抗-兔IgG用于激活3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)基质溶液。在20分钟后使用2N H2SO4淬灭反应。在Molecular Device SpectraMax仪器上经由吸收(450nm)来监测检测。未经处理的小鼠血清和器官以及人ASS1蛋白质分别用作阴性和阳性对照。

IVIS生物光度计测量

为了使经处理小鼠中的发光可视化，进行数个步骤。起初使用异氟烷喷雾器以1-3％(通常以2.5％)进行麻醉。使用微型喷雾器，经由气管内/鼻内以60mg/mL施用50μL/动物于PBS中的荧光素。使荧光素分布5-10分钟。将动物置于异氟烷室中直至麻醉。将经麻醉的动物放于IVIS成像室的背靠板(dorsal recumbency)处且置于歧管中。给小鼠拍照。在这些实施例中，提供最高敏感度的获取设置如下：照相机高度处于D水平，F/Stop为f1，像素组合(binning)为高分辨率且曝光时间为5分钟。重复曝光至多3次(荧光素注入后5、10和15分钟)。

原位杂交(ISH)分析

原位杂交使用“ZZ”探针技术来进行。探针基于密码子优化的人信使RNA序列产生。将组织于10％中性缓冲福尔马林中固定24-48小时且包埋于石蜡中。通过6个连续扩增步骤、随后使用3,3’-二氨基联苯胺(DAB)进行生色可视化而实现所需mRNA的阳性检测。将阳性信号与未经处理的小鼠进行比较。

实施例3.高度有效地体内产生治疗性蛋白质

本实施例表明由通过并入本文所述的阳离子脂质(例如，cKK-E12)的脂质体递送的mRNA编码的蛋白质在血清和各种器官组织中的高度有效和持久的产生。

体内人FIX蛋白产生的结果

在CD-1小鼠中通过单次静脉内弹丸注射，测试经由负载hFIX mRNA的基于cKK-E12的脂质纳米颗粒的人FIX蛋白的产生。图1显示了相较于包封hFIX mRNA的基于C12-200的脂质纳米颗粒，当用负载人FIX mRNA的基于cKK-E12的脂质纳米颗粒处理小鼠时经由ELISA检测到的人FIX蛋白的量。注射后24小时处死小鼠，并收获器官(如上所述)。

已显示基于C12-200的脂质纳米颗粒为在体内递送和表达mRNA的有效媒介物(参见，PCT申请公布NO.WO2012170930，其公开内容据此通过引用并入)。令人惊讶地，如图1中所示，基于cKK-E12的脂质纳米颗粒在体内递送人FIX mRNA方面甚至更有效，导致比基于C12-200的脂质纳米颗粒高近50％的在经处理小鼠的血浆中检测到的蛋白质表达。

图2示出当以不同剂量用负载人FIX mRNA的基于cKK-E12的脂质纳米颗粒处理小鼠时，如由经由ELISA检测的人FIX蛋白的量所示的剂量-响应实验的结果。在6小时时对小鼠取血，注射后24小时处死小鼠，并收获器官(如上所述)。

当测量人FIX蛋白的肝水平时获得明确的剂量响应。给药范围为0.10–3.0mg/kg的包封的人FIX mRNA。这些数据表明脂质纳米颗粒高效递送信使RNA，释放有效负载和经由翻译来加工该外源性mRNA以产生人FIX蛋白的能力，所述蛋白随后被分泌至血流中。当以1.0mg/kg或更高剂量给药时，人FIX蛋白的水平大大高于治疗水平(>100ng/mL血浆)和超过正常生理水平(～5ug/mL血浆)。此外，该人蛋白的血浆停留时间在施用后持续至少24小时。

体内人ASS1蛋白产生的结果

在CD-1小鼠中通过单次静脉内弹丸注射，测试经由密码子优化的负载hASS1 mRNA的基于cKK-E12的脂质纳米颗粒的人ASS1蛋白的产生。图3示出当以不同剂量用负载人ASS1mRNA的基于cKK-E12的脂质纳米颗粒处理小鼠时，经由ELISA检测的人ASS1蛋白的量。在注射后24小时处死小鼠，并收获器官(如上所述)。

当测量人ASS1蛋白的肝水平时获得明确的剂量响应。如表5中所示，剂量范围为0.10–2.0mg/kg的在cKK-E12脂质纳米颗粒中的包封的人ASS1 mRNA。这些数据表明脂质纳米颗粒在肝中蓄积并释放所述mRNA有效负载以及肝经由翻译加工该外源性mRNA以产生人ASS1蛋白的能力。

表5.如经由ELISA分析测量的人ASS1蛋白的原始值(如图1中所描绘的)。经由基于cKK-E12的脂质纳米颗粒递送密码子优化的人ASS1 mRNA。剂量基于包封的ASS1 mRNA。值被描绘为肝中每毫克总蛋白质的人ASS1蛋白的纳克数。BLD＝ELISA的检测下限。

虽然ELISA的灵敏度的限值处于较低值，但免疫印迹分析允许在较低剂量(0.3–3.0mg/kg)上产生人ASS1蛋白的清楚可视化(参见图4)。图4描绘了在单次静脉内剂量的包封人ASS1 mRNA的cKK-E12脂质纳米颗粒后，经由免疫印迹分析的随剂量而变化的肝中的人ASS1蛋白水平的比较。在施用后24小时处死CD1小鼠，收获肝，并如上所述进行分析。

为了进一步理解包封ASS1 mRNA的脂质纳米颗粒的促进mRNA至选定的器官(肝)中的递送的能力，进行药代动力学分析，在一周的时期内监测肝中的人ASS1蛋白水平。图5描绘了在直至负载人ASS1的脂质纳米颗粒(cKK-E12)施用后7天的不同时间点上的肝中检测到的人ASS1蛋白的量。这通过静脉内给予的单次剂量(1.0mg/kg的包封的mRNA)来实现。

在这种情况下，我们观察到在施用后约24-48小时时人ASS1蛋白的最大血清水平。在施用后1周仍然观察到可测量水平的蛋白质，如通过ELISA和免疫印迹(分别为图5和6)二者所测定的。图6描绘了在包封人ASS1 mRNA的脂质纳米颗粒的单次静脉内剂量(1.0mg/kg的剂量)后经由免疫印迹分析的随时间推移的肝中的人ASS1蛋白水平的比较。

使用基于原位杂交(ISH)的方法实现经处理小鼠的肝中的活性药物成分(ASS1mRNA)的直接检测。如图7和8中所显示的，在测试的最早时间点(30分钟)可检测到最高水平的外源性人ASS1信使RNA，并且信号在给药后48小时仍然很强。此外，在施用后72小时仍然可检测到人ASS1 mRNA。

除了ISH以外，还使用免疫组织化学(IHC)方法实现所得的人ASS1蛋白的检测。通过将小鼠单克隆抗体(02D2-2E12)用于特异性结合，可容易地观察到经处理的肝的肝细胞的细胞质中的靶人ASS1蛋白的存在。图9显示施用后24小时在处理的小鼠肝中的人ASS1蛋白的免疫组织化学染色。

经由雾化体内递送FFL mRNA

为了评估另外的递送途径是否可行，将FFL mRNA包封在cKK-E12脂质体中，并且将这些脂质体进行雾化。如图10中所示，有可能高效地雾化包封mRNA的基于cKK-E12的脂质纳米颗粒。图10显示在暴露于雾化的负载FFL mRNA的cKK-E12脂质纳米颗粒后24小时利用荧光素处理的小鼠。

实施例4.hSMN-1mRNA的CNS递送

本实施例提供了用于在CNS中有效递送和表达mRNA的示例性cKK-E12脂质体制剂。具体地，本实施例显示了递送人运动神经元生存蛋白-1(hSMN-1)mRNA至脑和脊髓的各种组织中。

信使RNA材料

通过如下合成密码子优化的人运动神经元生存蛋白-1(hSMN-1)信使RNA(参见SEQID NO:4)：从编码基因的质粒DNA模板体外转录，随后添加5’帽结构(Cap 1)(Fechter,P.；Brownlee,G.G.“Recognition of mRNA cap structures by viral and cellularproteins”J.Gen.Virology2005,86,1239-1249)和长度约250个核苷酸的3’聚(A)尾部(SEQID NO:15)，如通过凝胶电泳测定的。存在于每一个mRNA产物中的5’和3’非翻译区分别表示为X和Y，并且如实施例1中所述进行定义。

配制方案

经由标准乙醇注射法(Ponsa,M.；Foradada,M.；Estelrich,J.“Liposomesobtained by the ethanol injection method”Int.J.Pharm.1993,95,51-56)形成脂质纳米颗粒(LNP)。对于各种脂质组分，制备50mg/ml的乙醇储备溶液，将其于-20℃储存。在表6中所列的cKK-E12脂质纳米颗粒制剂的制备中，将每一种指定的脂质组分添加至乙醇溶液中以获得预定的终浓度和摩尔比，并将其缩放至3ml的乙醇终体积。分别从1mg/ml储备液制备hSMN-1mRNA的水性缓冲液(10mM柠檬酸盐/150mM NaCl，pH 4.5)。将所述脂质溶液迅速注入mRNA水溶液中，并振摇以在20％乙醇中产生最终的混悬液。将所得的纳米颗粒混悬剂过滤，随后针对1xPBS(pH 7.4)进行透析，浓缩，并在2-8℃贮存。经由Ribogreen测定(Invitrogen)来确定SMN-1mRNA浓度。通过在0.1％Triton-X 100存在和不存在的情况下进行Ribogreen测定来计算mRNA的包封。使用Malvern Zetasizer仪分别在1x PBS和1mM KCl溶液中确定颗粒大小(动态光散射(DLS))和ζ电位。

表6.示例性cKK-E12脂质纳米颗粒制剂

负载mRNA的脂质体纳米颗粒的鞘内施用

在每个实验开始时使用约6-8周龄的大鼠或小鼠进行所有体内研究。在实验开始时，通过吸入利用异氟烷(1-3％，可起效)麻醉每一只动物。一旦被麻醉，在准确的注射位点(L4-L5或L5-L6)剃除每一只动物的毛。在插入针后，将尾巴的反射摆动用于指示硬脑膜的穿刺和确认鞘内放置。每一只动物接受表6中所列的测试制剂的单次鞘内弹丸注射。在注射后24小时处死所有动物并用盐水进行灌注。

用于分析的器官组织的分离

收获所有动物的完整脑和脊髓。将脑纵向切开，并以每只动物一个组织盒置于组织盒中。将完整脊髓在15ml含有10％中性缓冲福尔马林(NBF)的管中于环境中贮存至少24小时并且不超过72小时，随后转移至70％组织学级醇溶液中。将每一个脊髓样品切成颈椎、胸椎和腰椎段。将每一个脊髓段切成两半，将两半以每段(颈椎、胸椎和腰椎段)单个盒置于盒中以进行处理。将所有三个盒以每只动物一个石蜡块包埋在石蜡块中。当适用时，将脑和脊髓的部分快速冷冻并于-80℃贮存。

hSMN-1免疫印迹分析

使用各种识别hSMN蛋白的抗体诸如：(A)以1:1,000稀释的抗-SMN 4F11抗体；(B)以1:1,000稀释的Pierce PA5-27309 a-SMN抗体和(C)以1:1,000稀释的LSBio C138149a-SMN抗体进行标准免疫印迹程序。对于每一个实验，使用Lipofectamine 2000将1微克的hSMN mRNA转染进～1x10

原位杂交(ISH)分析

利用使用

免疫组织化学分析

经由鞘内注射向大鼠施用负载人SMN-1mRNA的脂质纳米颗粒，并按照上文所述的方法在施用后24小时收集和加工组织样品。随后测定大鼠脊柱组织样品的hSMN-1蛋白表达。简言之，加工包埋在石蜡中的固定组织并将其置于载玻片上。使载玻片脱蜡，再水化，以及使用压力锅，利用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复。使用几种封闭缓冲液，随后使用1:2500稀释的4F11抗体在4℃进行一级抗体孵育过夜。洗涤所得的载玻片，将其用二级抗体聚合物在环境温度下孵育，随后进行洗涤和随后的生色团显影。数据表明在短至hSMN-1mRNA的鞘内施用后24小时，观察到当与未处理对照比较时的针对人SMN-1蛋白的染色(图13)。这支持先前的表明hSMN-1mRNA至脊柱组织的递送的发现。此外，数据还表明一旦被递送至细胞，就可有效表达hSMN-1mRNA以产生hSMN-1蛋白。

结果

本实施例中提供的数据表明负载hSMN-1mRNA的脂质体(例如，基于脂质或聚合物的纳米颗粒)的鞘内施用导致在脑和脊髓的神经元(包括那些难以处理的细胞，诸如前角细胞和背根神经节)中成功地细胞内递送mRNA。

结果已显示，在鞘内施用后，包封在脂质纳米颗粒(例如，包含cKK-E12的脂质纳米颗粒)中的mRNA可被有效地递送至CNS的各种组织。通过使用表6中公开的示例性制剂，mRNA在脊髓的各种神经元中被有效地递送和内化(图12A-12C)，如通过原位杂交测定验证的。令人惊讶地，胞内mRNA递送在位于脊柱组织内的深处的难以到达的前角的神经元细胞中得到证实(图12A-12C)。对于小鼠或大鼠SMN-1很少甚至没有观察到背景，这表明了对于人SMN-1探针的特异性。将阳性SMN信号与未经处理的和媒介物对照处理的大鼠或小鼠组织的阳性SMN信号相比较。在标准亮视野显微镜下对染色的样品进行可视化。

这些数据表明本文所述的基于脂质或聚合物纳米颗粒的mRNA递送方法能够成功地穿过脊髓神经元的复杂致密的细胞膜并递送mRNA有效负载用于在神经元内产生编码的蛋白质。特别令人惊讶的是，本文所述的mRNA递送方法在穿透难以处理的神经元诸如前角细胞和背根神经节中获得同样的成功。因此，本文中提供的数据表明脂质或聚合物纳米颗粒诸如包含cKK-E12的所述纳米颗粒可用作用于在CNS疾病的治疗中将mRNA递送至神经元细胞的有前景的选择。具体地，本实施例证明，负载hSMN mRNA的纳米颗粒可被有效地递送至神经元，包括脊髓中的那些难以处理的运动神经元，并且可用于产生SMN蛋白和治疗脊髓性肌萎缩。

实施例5.体内CO-CFTR-C-His

信使RNA合成。对于本实验，通过使用标准方法从质粒DNA模板体外转录来合成C-端His

经由气管内施用的负载mRNA的纳米颗粒产生的人CFTR蛋白的分析。对于本研究，使用CFTR敲除小鼠。使用PARI Boy喷射喷雾器引入CFTR mRNA制剂或媒介物对照。在预定的时间段(以允许蛋白质从mRNA表达)后，处死小鼠并用盐水进行灌注。

PEI制剂。PEI制剂已被用于将CFTR mRNA递送至肺，并且在本实验中用作对照。如下制备具有25kDa支链PEI的聚合物纳米颗粒制剂。正好在于注射用水(Braun,Melsungen)中应用前将所需量的mRNA稀释至4ml的总体积，并使用移液器以10的N/P比率将其迅速添加至4ml的支链PEI 25kDa的水溶液中。通过上下吸打10次来混合溶液，使用指定的喷雾器将其作为两个单独的4.0ml级分依次喷雾至小鼠肺。

cKK-E12制剂。对于基于脂质的纳米颗粒实验，使用cKK-E12:DOPE:Chol:PEGDMG2K(相对量50:25:20:5(mg:mg:mg:mg))的制剂中的CO-CFTR-C-His

喷雾(气溶胶)施用人CO-CFTR-C-His

施用人CO-CFTR-C-His

安乐死。将动物在剂量施用后的代表性时间(±5％)通过CO

灌注。在放血后，将所有动物经历利用盐水的心脏灌注。简言之，通过将连接于10mL含有盐水的注射器的23/21号针插入左心室的腔内进行灌注来进行全身心内灌注。切开右心房以提供灌注液的排出口。对柱塞施加温和稳定的压力以在将针置于心脏中后灌注动物。确保冲洗溶液的充分流动，当排出的灌注液流清澈(不含可见的血液)时，表明冲洗液已饱和身体并且该程序完成。

组织收集。在灌注后，收获所有动物的肺(右肺和左肺)。将两个(右和左)肺在液氮中速冻并分别于标称-70℃下贮存。

CFTR敲除小鼠中的CO-CFTR-C-His

实施例6：肺中的体内表达

本实施例还表明在负载mRNA的基于ckk-E12的纳米颗粒的气溶胶递送后在肺中的成功体内表达。使用从Technical University Munich,Weihenstephan,Germany获得的German Landrace的猪进行所有研究。所述猪的体重在35-90kg范围内。使用Pari喷射喷雾器引入FFL/CO-CFTR-C-His10 mRNA制剂或媒介物对照。在预定的时间段后(以允许蛋白质从mRNA表达)，处死猪并用盐水灌注。

信使RNA合成。在本实施例中，通过从质粒DNA模板体外转录合成密码子优化的萤火虫荧光素酶(CO-FFL)mRNA。

cKK-E12制剂。对于基于脂质的纳米颗粒实验，使用包封在cKK-E12:DOPE:Chol:PEGDMG2K(相对量40:30:25:5(摩尔比))的制剂中的1mg FFL+9mg CO-CFTR-C-His

气溶胶施用。将气溶胶(盐水或CO-FFL cKK-E12制剂)雾化并吸入麻醉的猪中。通过利用2mg/kg体重的阿扎哌隆、15mg/kg体重的氯胺酮、0.1mg/kg体重的阿托品和随后将静脉管线插入侧耳静脉进行麻醉前用药来开始使猪镇静。根据需要，通过静脉内注射3-5mg/kg体重的异丙酚来麻醉猪。利用异氟烷(2-3％)(按需要利用4至8mg/kg体重的1％异丙酚弹丸注射以增强麻醉)保持麻醉。麻醉的持续时间为约1-3小时。通过经由侧耳静脉的戊巴比妥(100mg/kg体重)和氯化钾的弹丸注射处死猪。切取肺，从不同的肺区域收集组织样品，随后在细胞培养基中孵育过夜。将储存的样品经历生物发光检测。

生物发光分析。为了进行荧光素酶活性的测量，将组织样品匀浆化，随后在管发光计中进行分析，或在包含D-荧光素底物的培养基浴中孵育，以及经历离体荧光素酶BLI。数据表明当与(B)来自对照组猪(盐水媒介物对照)的对照肺组织样品比较时，对于每一只(A)CO-FFL/CO-CFTR-C-His

这些数据表明通过基于cKK-E12的脂质制剂的气溶胶施用，FFL/CFTR mRNA被成功地递送至肺中并且在肺中表达。

等效物

本领域技术人员将认识到，或能够确定只使用常规实验，许多实施方案等同于本文中描述的本发明的具体实施方案。本发明的范围不旨在限定于上述描述，相反地示于下列权利要求中：

序列表

<110> 夏尔人类遗传性治疗公司

麻省理工学院

<120> 用于递送信使RNA的脂质制剂

<130> 2006685-0687

<140>

<141>

<150> 61/953,516

<151> 2014-03-14

<150> 61/894,299

<151> 2013-10-22

<160> 15

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 1632

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成

多核苷酸"

<220>

<221> 变异

<222> (1527)..(1527)

<223> /替换=" "

<220>

<221> 变异

<222> (1627)..(1627)

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<221> misc_feature

<222> (1)..(1632)

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<400> 1

ggacagaucg ccuggagacg ccauccacgc uguuuugacc uccauagaag acaccgggac 60

cgauccagcc uccgcggccg ggaacggugc auuggaacgc ggauuccccg ugccaagagu 120

gacucaccgu ccuugacacg augcagcgcg ugaacaugau cauggcagaa ucaccaggcc 180

ucaucaccau cugccuuuua ggauaucuac ucagugcuga auguacaguu uuucuugauc 240

augaaaacgc caacaaaauu cugaggcgga gaaggaggua uaauucaggu aaauuggaag 300

aguuuguuca agggaaccuu gagagagaau guauggaaga aaaguguagu uuugaagaag 360

cacgagaagu uuuugaaaac acugaaagaa caacugaauu uuggaagcag uauguugaug 420

gagaucagug ugaguccaau ccauguuuaa auggcggcag uugcaaggau gacauuaauu 480

ccuaugaaug uugguguccc uuuggauuug aaggaaagaa cugugaauua gauguaacau 540

guaacauuaa gaauggcaga ugcgagcagu uuuguaaaaa uagugcugau aacaaggugg 600

uuugcuccug uacugaggga uaucgacuug cagaaaacca gaaguccugu gaaccagcag 660

ugccauuucc auguggaaga guuucuguuu cacaaacuuc uaagcucacc cgugcugagg 720

cuguuuuucc ugauguggac uauguaaauu cuacugaagc ugaaaccauu uuggauaaca 780

ucacucaaag cacccaauca uuuaaugacu ucacucgggu uguuggugga gaagaugcca 840

aaccagguca auucccuugg cagguuguuu ugaaugguaa aguugaugca uucuguggag 900

gcucuaucgu uaaugaaaaa uggauuguaa cugcugccca cuguguugaa acugguguua 960

aaauuacagu ugucgcaggu gaacauaaua uugaggagac agaacauaca gagcaaaagc 1020

gaaaugugau ucgaauuauu ccucaccaca acuacaaugc agcuauuaau aaguacaacc 1080

augacauugc ccuucuggaa cuggacgaac ccuuagugcu aaacagcuac guuacaccua 1140

uuugcauugc ugacaaggaa uacacgaaca ucuuccucaa auuuggaucu ggcuauguaa 1200

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uuccacuugu ugaccgagcc acaugucuuc gaucuacaaa guucaccauc uauaacaaca 1320

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agugugcaau gaaaggcaaa uauggaauau auaccaaggu aucccgguau gucaacugga 1500

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ugcaucaaag cu 1632

<210> 2

<211> 1485

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

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多核苷酸"

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<221> 变异

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<222> (1)..(1485)

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ccaaggcccc caacaccccc gacauccugg agaucgaguu caagaagggc gugcccguga 840

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<210> 3

<211> 1899

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

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多核苷酸"

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<400> 3

ggacagaucg ccuggagacg ccauccacgc uguuuugacc uccauagaag acaccgggac 60

cgauccagcc uccgcggccg ggaacggugc auuggaacgc ggauuccccg ugccaagagu 120

gacucaccgu ccuugacacg auggaagaug ccaaaaacau uaagaagggc ccagcgccau 180

ucuacccacu cgaagacggg accgccggcg agcagcugca caaagccaug aagcgcuacg 240

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ccgaguacuu cgagaugagc guucggcugg cagaagcuau gaagcgcuau gggcugaaua 360

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<210> 4

<211> 1131

<212> RNA

<213> 人工序列

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多核苷酸"

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<221> misc_feature

<222> (1)..(1131)

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<400> 4

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cgauccagcc uccgcggccg ggaacggugc auuggaacgc ggauuccccg ugccaagagu 120

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uugucgggag ggcagcgagc gcggaucagc cucgcgagag cgguauacaa agaugcagau 1800

uuguaucugc uugauucacc guuuggauac cucgacguau ugacagaaaa agaaaucuuc 1860

gagucgugcg uguguaaacu uauggcuaau aagacgagaa uccuggugac aucaaaaaug 1920

gaacaccuua agaaggcgga caagauccug auccuccacg aaggaucguc cuacuuuuac 1980

ggcacuuucu cagaguugca aaacuugcag ccggacuucu caagcaaacu cauggggugu 2040

gacucauucg accaguucag cgcggaacgg cggaacucga ucuugacgga aacgcugcac 2100

cgauucucgc uugaggguga ugccccggua ucguggaccg agacaaagaa gcagucguuu 2160

aagcagacag gagaauuugg ugagaaaaga aagaacagua ucuugaaucc uauuaacuca 2220

auucgcaagu ucucaaucgu ccagaaaacu ccacugcaga ugaauggaau ugaagaggau 2280

ucggacgaac cccuggagcg caggcuuagc cucgugccgg auucagagca aggggaggcc 2340

auucuucccc ggauuucggu gauuucaacc ggaccuacac uucaggcgag gcgaaggcaa 2400

uccgugcuca accucaugac gcauucggua aaccaggggc aaaacauuca ccgcaaaacg 2460

acggccucaa cgagaaaagu gucacuugca ccccaggcga auuugacuga acucgacauc 2520

uacagccgua ggcuuucgca agaaaccgga cuugagauca gcgaagaaau caaugaagaa 2580

gauuugaaag aguguuucuu ugaugacaug gaaucaaucc cagcggugac aacguggaac 2640

acauacuugc guuacaucac ggugcacaag uccuugauuu ucguccucau cuggugucuc 2700

gugaucuuuc ucgcugaggu cgcagcguca cuuguggucc ucuggcugcu ugguaauacg 2760

cccuugcaag acaaaggcaa uucuacacac ucaagaaaca auuccuaugc cgugauuauc 2820

acuucuacaa gcucguauua cguguuuuac aucuacguag gaguggccga cacucugcuc 2880

gcgauggguu ucuuccgagg acucccacuc guucacacgc uuaucacugu cuccaagauu 2940

cuccaccaua agaugcuuca uagcguacug caggcuccca uguccaccuu gaauacgcuc 3000

aaggcgggag guauuuugaa ucgcuucuca aaagauauug caauuuugga ugaccuucug 3060

ccccugacga ucuucgacuu cauccaguug uugcugaucg ugauuggggc uauugcagua 3120

gucgcugucc uccagccuua cauuuuuguc gcgaccguuc cggugaucgu ggcguuuauc 3180

augcugcggg ccuauuucuu gcagacguca cagcagcuua agcaacugga gucugaaggg 3240

aggucgccua ucuuuacgca ucuugugacc aguuugaagg gauuguggac guugcgcgcc 3300

uuuggcaggc agcccuacuu ugaaacacug uuccacaaag cgcugaaucu ccauacggca 3360

aauugguuuu uguauuugag uacccuccga ugguuucaga ugcgcauuga gaugauuuuu 3420

gugaucuucu uuaucgcggu gacuuuuauc uccaucuuga ccacgggaga gggcgaggga 3480

cgggucggua uuauccugac acucgccaug aacauuauga gcacuuugca gugggcagug 3540

aacagcucga uugaugugga uagccugaug agguccguuu cgagggucuu uaaguucauc 3600

gacaugccga cggagggaaa gcccacaaaa aguacgaaac ccuauaagaa ugggcaauug 3660

aguaagguaa ugaucaucga gaacagucac gugaagaagg augacaucug gccuagcggg 3720

ggucagauga ccgugaagga ccugacggca aaauacaccg agggagggaa cgcaauccuu 3780

gaaaacaucu cguucagcau uagccccggu cagcgugugg gguugcucgg gaggaccggg 3840

ucaggaaaau cgacguugcu gucggccuuc uugagacuuc ugaauacaga gggugagauc 3900

cagaucgacg gcguuucgug ggauagcauc accuugcagc aguggcggaa agcguuugga 3960

guaauccccc aaaaggucuu uaucuuuagc ggaaccuucc gaaagaaucu cgauccuuau 4020

gaacaguggu cagaucaaga gauuuggaaa gucgcggacg agguuggccu ucggagugua 4080

aucgagcagu uuccgggaaa acucgacuuu guccuuguag augggggaug cguccugucg 4140

caugggcaca agcagcucau gugccuggcg cgauccgucc ucucuaaagc gaaaauucuu 4200

cucuuggaug aaccuucggc ccaucuggac ccgguaacgu aucagaucau cagaaggaca 4260

cuuaagcagg cguuugccga cugcacggug auucucugug agcaucguau cgaggccaug 4320

cucgaaugcc agcaauuucu ugucaucgaa gagaauaagg uccgccagua cgacuccauc 4380

cagaagcugc uuaaugagag aucauuguuc cggcaggcga uuucaccauc cgauagggug 4440

aaacuuuuuc cacacagaaa uucgucgaag ugcaagucca aaccgcagau cgcggccuug 4500

aaagaagaga cugaagaaga aguucaagac acgcgucuuu aa 4542

<210> 11

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成

10xHis标签"

<400> 11

His His His His His His His His His His

1 5 10

<210> 12

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成

多核苷酸"

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(500)

<223> /注释="该序列可包含10-500个核苷酸"

<220>

<221> 变异

<222> (11)..(500)

<223> /替换=" "

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(500)

<223> /注释="所述序列中给出的变体核苷酸相对于注解中针对变体位置的那些核苷酸没有优先性"

<220>

<221> 来源

<223> /注释="参见所提交的针对置换的详细描述和优选实施方案的说明书"

<400> 12

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 180

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 240

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 300

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 360

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 420

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 480

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 500

<210> 13

<211> 300

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成

多核苷酸"

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(300)

<223> /注释="该序列可包含10-300个核苷酸"

<220>

<221> 变异

<222> (11)..(300)

<223> /替换=" "

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(300)

<223> /注释="所述序列中给出的变体核苷酸相对于注解中针对变体位置的那些核苷酸没有优先性"

<220>

<221> 来源

<223> /注释="参见所提交的针对置换的详细描述和优选实施方案的说明书"

<400> 13

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 180

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 240

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 300

<210> 14

<211> 200

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成

多核苷酸"

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(200)

<223> /注释="该序列可包含10-200个核苷酸"

<220>

<221> 变异

<222> (11)..(200)

<223> /替换=" "

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(200)

<223> /注释="所述序列中给出的变体核苷酸相对于注解中针对变体位置的那些核苷酸没有优先性"

<220>

<221> 来源

<223> /注释="参见所提交的针对置换的详细描述和优选实施方案的说明书"

<400> 14

cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc 60

cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc 120

cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc 180

cccccccccc cccccccccc 200

<210> 15

<211> 250

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成

多核苷酸"

<220>

<221> 来源

<223> /注释="参见所提交的针对置换的详细描述和优选实施方案的说明书"

<400> 15

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 180

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 240

aaaaaaaaaa 250