新型冠状病毒RBD的重组病毒样颗粒及其构建方法

摘要

本发明涉及生物医学领域，特别涉及新型冠状病毒RBD的重组病毒样颗粒及其构建方法。本发明将SARS‑CoV‑2RBD序列插入至乙肝核心抗原序列，连接至pFastBacDual载体，转化到DH10Bac感受态细胞后获得重组杆粒。将重组杆粒转染至sf9细胞后进行病毒拯救，获得重组杆状病毒。PCR及WesternBlot结果显示，重组杆状病毒构建成功并且可以表达外源蛋白RBD‑HBc。透射电镜观察结果显示，电镜下可以看到40nm左右的病毒样颗粒，表明本研究成功构建了呈现SARS‑CoV‑2RBD的病毒样颗粒，为后期疫苗的研究奠定了基础。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学领域，特别涉及新型冠状病毒RBD的重组病毒样颗粒及其构建方法。

背景技术

2020年以来，SARS-CoV-2席卷全球，根据美国约翰霍普金斯大学数据，截至2020年12月10日，全球范围内已有约6900万人感染，157万人死亡。SARS-CoV-2属于冠状病毒科β冠状病毒属，其受体结合域(ReceptorBind Domain，RBD)位于S1蛋白，可以诱导特异性抗体及中和抗体的产生。

病毒样颗粒(Virus Like Particle，VLP)不含病毒的基因组，但是具有病毒蛋白的天然结构，具有安全性高、免疫原性好的特点。根据WHO数据，截至2020年12月8日，已有2款VLP新冠病毒疫苗进入临床试验，其中一款是通过乙肝表面抗原(Hepatitis B surfaceantigen，HBsAg)来呈递SARS-CoV-2RBD。除了HBsAg，乙肝核心抗原(Hepatitis B coreantigen，HBcAg)同样可以自组装成为VLP，并已成为最常用的VLP抗原递送平台之一，目前已发表的使用HBcAg为载体组装成为VLP的病毒包括：人免疫缺陷病毒(Humanimmunodeficiency virus，HIV)，丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)，肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)，柯萨奇病毒A16(Coxsackievirus A16，CA16)，带状疱疹病毒(Varicella-zostervirus,VZV)，戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)，寨卡病毒(Zikavirus，ZIKV)，EB病毒(Epstein-Barrvirus,EBV)，流感病毒等多种病毒。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了新型冠状病毒RBD的重组病毒样颗粒及其构建方法。本发明以HBcAg为载体，通过杆状病毒表达系统，构建了呈现SARS-CoV-2RBD的病毒样颗粒候选疫苗，为动物免疫实验奠定了基础。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了病毒样颗粒，包括但不限于新型冠状病毒(SARS-CoV-2)受体结合域(RBD)。

在本发明的一些具体实施方案中，所述病毒样颗粒以HBcAg为载体，通过杆状病毒表达系统表达。

本发明还提供了所述的病毒样颗粒的制备方法，将SARS-CoV-2RBD序列插入至乙肝核心抗原序列，连接至pFast Bac Dual载体，转化到DH10Bac感受态细胞后获得重组杆粒；将所述重组杆粒转染至sf9细胞后进行病毒拯救，获得重组杆状病毒，即获得病毒样颗粒。

基于上述研究，本发明还提供了药物组合物，包括所述的病毒样颗粒或所述制备方法制得的病毒样颗粒。在本发明的一些具体实施方案中，所述药物组合物还包括药学上可接受的保护剂、稳定剂、佐剂、稀释剂、载体或辅料。

更重要的是，本发明还提供了疫苗，包括所述的病毒样颗粒或所述制备方法制得的病毒样颗粒。在本发明的一些具体实施方案中，还包括药学上可接受的保护剂、稳定剂、佐剂、稀释剂、载体或辅料。

本发明还提供了所述的病毒样颗粒、所述制备方法制得的病毒样颗粒、所述的药物组合物、所述的疫苗在制备治疗病症或疾病的药物中的用途；所述病症或疾病包括新型冠状病毒所致的病症或疾病。

为了构建呈现新型冠状病毒(SARS-CoV-2)受体结合域(RBD)的重组病毒样颗粒(VLP)，本发明将SARS-CoV-2RBD序列插入至乙肝核心抗原序列，连接至pFastBac Dual载体，转化到DH10Bac感受态细胞后获得重组杆粒。将重组杆粒转染至sf9细胞后进行病毒拯救，获得重组杆状病毒。PCR及WesternBlot结果显示，重组杆状病毒构建成功并且可以表达外源蛋白RBD-HBc。透射电镜观察结果显示，电镜下可以看到40nm左右的病毒样颗粒，表明本研究成功构建了呈现SARS-CoV-2RBD的病毒样颗粒，为后期疫苗的研究奠定了基础。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示rBD-SARS-CoV2-RBD-HBc示意图；

图2示重组杆粒RT-PCR鉴定；其中，M：DL 5000MARKER；1-2：rBD-SARS-CoV2-RBD-HBc；3：水；4：空载体重组杆粒；

图3示重组杆状病毒感染sf9细胞病变观察(200×)；其中，A：正常sf9细胞；B：sf9细胞感染rBDV-SARS-CoV2-RBD-HBc后48h；C：sf9细胞感染rBDV-SARS-CoV2-RBD-HBc后72h；

图4示重组杆状病毒RT-PCR鉴定；其中，M：DL2000 MARKER；1-2：rBDV-SARS-CoV2-RBD-HBc；3：pFastBac Dual；4：MOCK(DH10Bac)；5：水；

图5示Western Blot鉴定重组杆状病毒外源基因表达；其中，M：蛋白MARKER；1：MOCK；2：蛋白RBD-HBc；

图6示病毒样颗粒电镜下观察。

具体实施方式

本发明公开了一种新型冠状病毒RBD的重组病毒样颗粒及其构建方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

当前，新冠肺炎疫情在全球范围内仍处于快速增长阶段，根据美国约翰霍普金斯大学数据显示，截至北京时间11月26日，每增长1000万病例的时间持续缩短，对安全有效疫苗的需求迫在眉睫。VLP疫苗不含病毒基因组，但可以呈现抗原蛋白的天然构象，是疫苗的理想类型。截至2020年12月8日，据WHO统计，全球范围内有2款VLP疫苗进入临床试验，16款VLP疫苗进入临床试验。

昆虫杆状病毒表达系统作为真核表达系统，可以使表达产物具备与天然蛋白相似的结构和功能，具备高效、安全的优点。本研究通过昆虫杆状病毒表达系统，利用HBcAg携带SARS-CoV-2RBD形成自组装颗粒，成功构建了呈现SARS-CoV-2RBD的病毒样颗粒候选疫苗，为后续的疫苗研究及筛选奠定了基础。

本发明提供的新型冠状病毒RBD的重组病毒样颗粒及其构建方法中，所用的原料以及试剂均可由市场购得。

质粒、细胞、菌株：

SARS-CoV-2RBD基因序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成并连接至pFastBacDual载体，命名为pFBD-SARS-CoV2-RBD-HBc；sf9细胞由本实验室保存；DH10Bac

主要试剂：

sf-900

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1重组杆粒制备及鉴定

将pFBD-SARS-CoV2-RBD-HBc质粒转化到DH10Bac感受态细胞中，并涂布于含10μg/ml四环素、50μg/ml硫酸卡那霉素、7μg/ml庆大霉素、100μg/mlX-gal和40μg/mlIPTG的筛选版上，37℃培养48h。挑取白色单菌落至SOC培养基，震荡培养3h，用通用引物PH：TTCATACCGTCCCACCAT和pUC/M13R：AGCGGATAACAATTTCACACAGG进行菌液PCR鉴定，将鉴定正确的菌株进行杆粒提取，命名为rBD-SARS-CoV2-RBD-HBc。

此外，将pFastBac Dual空载体按上述方法转化、筛选、培养后用作空载体重组杆粒对照。

用PH及pUC/M13R引物对rBD-SARS-CoV2-RBD-HBc和空载体重组杆粒(图1)进行菌落PCR鉴定，结果如图2所示，rBD-SARS-CoV2-RBD-HBc可扩增出长度为1857bp的片段，空载体重组杆粒可扩增出长度为678bp的片段，与预期相符。

实施例2重组杆状病毒的拯救

接种sf9细胞至六孔板，当细胞密度为2×10

将rBDV-SARS-CoV2-RBD-HBc接种至sf9细胞后，分别于48h和72h镜下观察，如图3所示：可见感染重组杆状病毒后的sf9细胞大量脱落，贴壁细胞数量减少、变圆。

实施例3 RT-PCR鉴定重组杆状病毒

将rBDV-SARS-CoV2-RBD-HBc接种于sf9细胞，培养72小时后收集细胞，加入一定体积Trizol，室温放置10分钟后提取总RNA。经反转录后，用引物RBD-HBc-F：

ATCTCGAGCCATGGTGCTAGCATGGACATCGACCCTTACAAGG和RBD-HBc-R：

CCATCTCCCGGTACCGCATGCTTACACGACAGTGGTTTCTGGC进行PCR鉴定。

收获感染rBDV-SARS-CoV2-RBD-HBc 72小时后的sf9细胞，经总RNA提取、反转录、PCR鉴定后，结果如图4所示，可见长度为1200bp的目的条带，与预期相符。

实施例4 Western Blot鉴定重组杆状病毒表达外源蛋白

将rBDV-SARS-CoV2-RBD-HBc接种于sf9细胞，培养72小时后收集细胞，加入IP裂解液后超声破碎，12000rpm，4℃离心3分钟收集上清。向上清中加入一定体积5×SDS后，沸水浴10分钟后进行SDS-PAGE电泳。用半干转方法转印后，以5％脱脂乳室温封闭2小时，经抗RBD小鼠多抗孵育、TBST清洗后，用山羊抗鼠二抗孵育、TBST清洗，最后将ECL滴加到NC膜上进行曝光。

收获感染rBDV-SARS-CoV2-RBD-HBc 72小时后的sf9细胞，超声破碎、SDS-PAGE电泳后，将蛋白转印至NC膜，经5％脱脂乳封闭、小鼠多克隆抗体孵育、山羊抗鼠孵育后曝光显色，结果如图5所示，可见大小约为43kDa的条带，与预期相符。

实施例5电镜观察

将rBDV-SARS-CoV2-RBD-HBc接种于sf9细胞，培养72小时后收集细胞，超声破碎，12000rpm，4℃离心3分钟，收集上清。将上清进行超速离心(20％蔗糖垫，35000rpm，4℃，2h)，弃掉上清后用适量PBS重悬。将重悬后的样品滴到透射电镜铜网，孵育5min，1％磷钨酸负染3分钟，电镜观察。

收获感染rBDV-SARS-CoV2-RBD-HBc 72小时后的sf9细胞，经超声破碎及高速离心后，重悬沉淀于投射电镜下观察，如图6所示，可见杆状病毒及40nm左右的病毒样颗粒。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。