一种低致敏性酪蛋白肽的生产方法及其应用

摘要

本发明提供了一种低致敏性酪蛋白肽的生产方法，包括以下步骤：(1)将酪蛋白加入纯水中，加热后保温搅拌，冷却至室温后转入超高压设备中，升压后保压，解压后得到酪蛋白溶液；(2)将瓜尔胶加入纯水中搅拌至混合均匀，加入甲基丙烯酸酐后用氢氧化钠溶液将体系的pH值调节至8‑10，继续搅拌反应后加入复合蛋白酶，加热后保温搅拌得到复合蛋白酶溶液；(3)将酪蛋白溶液与复合蛋白酶溶液混合均匀后得到混合液，置于均质机中均质，取出后调节pH值至7，加热后酶解得到酶解液；(4)将酶解液加热灭酶，冷却至室温后离心得到上清液，将上清液冷冻干燥后得到低致敏性酪蛋白肽。本发明生产出的低致敏性酪蛋白肽的致敏性较低，苦味较小且稳定性较好。

说明书

技术领域

本发明涉及一种低致敏性酪蛋白肽的生产方法及其应用。

背景技术

酪蛋白是乳中含量最高的蛋白质，主要作为食品原料或微生物培养基使用，利用蛋白质酶促水解技术制得的酪蛋白肽(也可以称为酪蛋白活性肽或酪蛋白活性多肽)具有防止矿物质流失、预防龋齿，抗氧化，防治骨质疏松与佝偻病，促进动物体外受精，调节血压，治疗缺铁性贫血、缺镁性神经炎等多种生理功效，尤其是其促进常量元素(Ca、Mg)与微量元素(Fe、Zn、Cu、Cr、Ni、Co、Mn、Se)高效吸收的功能特性使其具有“矿物质载体”的美誉，它可以和金属离子，特别是钙离子结合形成可溶性复合物，一方面有效避免了钙在小肠中性或微碱性环境中形成沉淀，另一方面还可在没有VD参与的条件下使钙被肠壁细胞吸收。现有的酪蛋白肽的生产方法往往是采用蛋白酶对酪蛋白进行酶解，存在酶解程度、产率较低的问题，而且产品的致敏性较高，苦味较重，稳定性不佳，限制了其在保健食品中的应用。

申请号为CN01115249.4的中国发明公开了“利用粗奶酪生产酪蛋白活性多肽的工艺”，该工艺是将粗奶酪经预处理后，再在酪蛋白中加入碱性液对其进行转化改性成为水溶性酪蛋白，然后将水溶性酪蛋白添加至少两种蛋白分解酶分别对其进行酶解，并将酶解液混合得酪蛋白活性多肽。该发明虽然提高了酶解程度，但是生产出的酪蛋白活性多肽仍存在致敏性较高、苦味较重、稳定性不佳的问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种低致敏性酪蛋白肽的生产方法，其生产出的低致敏性酪蛋白肽的致敏性较低，苦味较小且稳定性较好。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

一种低致敏性酪蛋白肽的生产方法，包括以下步骤：

(1)将酪蛋白加入纯水中，加热至75-90℃后保温搅拌10-15分钟，冷却至室温后转入超高压设备中，升压至500MPa后保压10-15分钟，解压后得到酪蛋白溶液；

(2)将瓜尔胶加入纯水中搅拌至混合均匀，加入甲基丙烯酸酐后用氢氧化钠溶液将体系的pH值调节至8-10，继续搅拌反应4-5小时后加入复合蛋白酶，加热至45-55℃后保温搅拌0.5-1小时得到复合蛋白酶溶液；

(3)将步骤(1)得到的酪蛋白溶液与步骤(2)得到的复合蛋白酶溶液混合均匀后得到混合液，将混合液置于均质机中均质2分钟，取出后调节pH值至7，加热至50-60℃后酶解2-3小时得到酶解液；

(4)将步骤(3)得到的酶解液加热至90-110℃后灭酶10-20分钟，冷却至室温后离心得到上清液，将上清液冷冻干燥后得到低致敏性酪蛋白肽。

进一步地，本发明所述步骤(1)中，酪蛋白与纯水的比例为(2-4)g:100mL。

进一步地，本发明所述步骤(1)中，升压的速度为100MPa/分，解压的时间为10秒。

进一步地，本发明所述步骤(2)中，瓜尔胶、纯水、甲基丙烯酸酐、复合蛋白酶的比例为1g:(150-200)mL:4mL:50mg，所述复合蛋白酶由碱性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶组成。

进一步地，本发明所述步骤(2)中，氢氧化钠溶液的浓度为1mol/L。

进一步地，本发明所述步骤(3)中，酪蛋白溶液与复合蛋白酶溶液的质量比为(40-50):1。

进一步地，本发明所述步骤(3)中，均质机的转速为8000转/分，均质机的压力为60MPa。

进一步地，本发明所述步骤(4)中，离心的速度为8000转/分。

本发明要解决的另一技术问题是提供上述生产方法得到的低致敏性酪蛋白肽以及该低致敏性酪蛋白肽在制备保健食品中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1)本发明使用的蛋白酶是由碱性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶组成的复合蛋白酶，可综合发挥这三种蛋白酶对酪蛋白中不同成分的酶解作用，而且本发明将瓜尔胶与甲基丙烯酸酯反应后与复合蛋白酶混合制得复合蛋白酶溶液，反应后的瓜尔胶对复合蛋白酶形成了包覆，提高了复合蛋白酶的稳定性，使得酪蛋白得到了适度的酶解，消除了酪蛋白中的大部分过敏原，得到了致敏性较低、苦味较小、能应用保健食品的酪蛋白肽。

2)本发明在步骤(1)中对酪蛋白还进行了高压处理，高压处理有利于加快后续的酶解过程，还能提高产品的稳定性。

3)本发明在酶解开始前还对酪蛋白溶液和复合蛋白酶溶液组成的混合液进行了短时间的均质处理，均质处理能进一步消除酪蛋白的过敏原、降低产品的致敏性，还能提高产品的抗氧化性。

具体实施方式

下面将结合具体实施例来详细说明本发明，在此本发明的示意性实施例及其说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。

实施例1

低致敏性酪蛋白肽的生产方法，包括以下步骤：

(1)将酪蛋白加入纯水中，酪蛋白与纯水的比例为3g:100mL，加热至80℃后保温搅拌12分钟，冷却至室温后转入超高压设备中，以100MPa/分的速度升压至500MPa后保压12分钟，10秒解压后得到酪蛋白溶液；

(2)将瓜尔胶加入纯水中搅拌至混合均匀，加入甲基丙烯酸酐后用浓度为1mol/L的氢氧化钠溶液将体系的pH值调节至9，继续搅拌反应4.5小时后加入由碱性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶组成的复合蛋白酶，加热至50℃后保温搅拌0.8小时得到复合蛋白酶溶液，瓜尔胶、纯水、甲基丙烯酸酐、复合蛋白酶的比例为1g:180mL:4mL:50mg；

(3)将质量比为45:1的步骤(1)得到的酪蛋白溶液与步骤(2)得到的复合蛋白酶溶液混合均匀后得到混合液，将混合液置于转速为8000转/分、压力为60MPa的均质机中均质2分钟，取出后调节pH值至7，加热至55℃后酶解2.5小时得到酶解液；

(4)将步骤(3)得到的酶解液加热至100℃后灭酶15分钟，冷却至室温后8000转/分速度下离心得到上清液，将上清液冷冻干燥后得到低致敏性酪蛋白肽。

实施例2

低致敏性酪蛋白肽的生产方法，包括以下步骤：

(1)将酪蛋白加入纯水中，酪蛋白与纯水的比例为2g:100mL，加热至90℃后保温搅拌11分钟，冷却至室温后转入超高压设备中，以100MPa/分的速度升压至500MPa后保压11分钟，10秒解压后得到酪蛋白溶液；

(2)将瓜尔胶加入纯水中搅拌至混合均匀，加入甲基丙烯酸酐后用浓度为1mol/L的氢氧化钠溶液将体系的pH值调节至8.5，继续搅拌反应5小时后加入由碱性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶组成的复合蛋白酶，加热至45℃后保温搅拌1小时得到复合蛋白酶溶液，瓜尔胶、纯水、甲基丙烯酸酐、复合蛋白酶的比例为1g:150mL:4mL:50mg；

(3)将质量比为42:1的步骤(1)得到的酪蛋白溶液与步骤(2)得到的复合蛋白酶溶液混合均匀后得到混合液，将混合液置于转速为8000转/分、压力为60MPa的均质机中均质2分钟，取出后调节pH值至7，加热至55℃后酶解2.5小时得到酶解液；

(4)将步骤(3)得到的酶解液加热至95℃后灭酶16分钟，冷却至室温后8000转/分速度下离心得到上清液，将上清液冷冻干燥后得到低致敏性酪蛋白肽。

实施例3

低致敏性酪蛋白肽的生产方法，包括以下步骤：

(1)将酪蛋白加入纯水中，酪蛋白与纯水的比例为2.5g:100mL，加热至85℃后保温搅拌15分钟，冷却至室温后转入超高压设备中，以100MPa/分的速度升压至500MPa后保压15分钟，10秒解压后得到酪蛋白溶液；

(2)将瓜尔胶加入纯水中搅拌至混合均匀，加入甲基丙烯酸酐后用浓度为1mol/L的氢氧化钠溶液将体系的pH值调节至8，继续搅拌反应4小时后加入由碱性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶组成的复合蛋白酶，加热至55℃后保温搅拌0.5小时得到复合蛋白酶溶液，瓜尔胶、纯水、甲基丙烯酸酐、复合蛋白酶的比例为1g:160mL:4mL:50mg；

(3)将质量比为40:1的步骤(1)得到的酪蛋白溶液与步骤(2)得到的复合蛋白酶溶液混合均匀后得到混合液，将混合液置于转速为8000转/分、压力为60MPa的均质机中均质2分钟，取出后调节pH值至7，加热至60℃后酶解2小时得到酶解液；

(4)将步骤(3)得到的酶解液加热至90℃后灭酶20分钟，冷却至室温后8000转/分速度下离心得到上清液，将上清液冷冻干燥后得到低致敏性酪蛋白肽。

实施例4

低致敏性酪蛋白肽的生产方法，包括以下步骤：

(1)将酪蛋白加入纯水中，酪蛋白与纯水的比例为4g:100mL，加热至75℃后保温搅拌10分钟，冷却至室温后转入超高压设备中，以100MPa/分的速度升压至500MPa后保压10分钟，10秒解压后得到酪蛋白溶液；

(2)将瓜尔胶加入纯水中搅拌至混合均匀，加入甲基丙烯酸酐后用浓度为1mol/L的氢氧化钠溶液将体系的pH值调节至10，继续搅拌反应4.5小时后加入由碱性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶组成的复合蛋白酶，加热至50℃后保温搅拌0.7小时得到复合蛋白酶溶液，瓜尔胶、纯水、甲基丙烯酸酐、复合蛋白酶的比例为1g:200mL:4mL:50mg；

(3)将质量比为50:1的步骤(1)得到的酪蛋白溶液与步骤(2)得到的复合蛋白酶溶液混合均匀后得到混合液，将混合液置于转速为8000转/分、压力为60MPa的均质机中均质2分钟，取出后调节pH值至7，加热至50℃后酶解3小时得到酶解液；

(4)将步骤(3)得到的酶解液加热至110℃后灭酶10分钟，冷却至室温后8000转/分速度下离心得到上清液，将上清液冷冻干燥后得到低致敏性酪蛋白肽。

参比实施例1

与实施例1不一样的地方在于步骤(1)为：将酪蛋白加入纯水中，酪蛋白与纯水的比例为3g:100mL，加热至80℃后保温搅拌12分钟，冷却至室温后得到酪蛋白溶液。即缺少高压处理操作。

参比实施例2

与实施例1不一样的地方在于步骤(3)为：将步骤(1)得到的酪蛋白溶液与由碱性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶组成的复合蛋白酶(复合蛋白酶的用量可根据实施例1中的质量比换算得出)混合均匀后得到混合液，将混合液置于转速为8000转/分、压力为60MPa的均质机中均质2分钟，取出后调节pH值至7，加热至55℃后酶解2.5小时得到酶解液。即缺少步骤(2)。

参比实施例3

与实施例1不一样的地方在于步骤(3)为：将质量比为45:1的步骤(1)得到的酪蛋白溶液与步骤(2)得到的复合蛋白酶溶液混合均匀后得到混合液，将混合液调节pH值至7，加热至55℃后酶解2.5小时得到酶解液。即缺少均质处理操作。

对比例

对比例是申请号为CN01115249.4的中国发明的具体实施方式。

实验例一：致敏性测试

酪蛋白中主要的过敏原为αs1-酪蛋白，因此可通过酶联免疫吸附试验测定产品中的αs1-酪蛋白含量，然后计算出与αs1-酪蛋白残留率来判断致敏性，αs1-酪蛋白残留率＝产品中的αs1-酪蛋白含量/原始酪蛋白中αs1-酪蛋白含量×100％，αs1-酪蛋白残留率越低表明产品的致敏性越低，测试结果如表1所示：

表1

由表1可看出，本发明实施例1-4得到的产品的αs1-酪蛋白残留率均显著低于对比例，表明本发明得到的产品的致敏性较低，其中实施例1的致敏性最低。参比实施例1-3的部分步骤与实施例1不同，其中参比实施例2、3的αs1-酪蛋白残留率均有所升高，表明本发明的步骤(2)和均质操作均能降低产品的致敏性。

实验例二：苦味测试

测试方法：取0.1g酪蛋白肽分别加入10、20、30、40、50、60、70、80、90、100mL的蒸馏中搅拌至混合均匀制成标准溶液，将相应的苦味值分别定义为9、8、7、6、5、4、3、2、1、0。将产品配制成浓度为0.01g/mL的样品溶液，选取20名食品专业的学生分别对比样品溶液和标准溶液，并按照苦味值对样品进行评分，计算出苦味平均值。苦味平均值越低表明苦味越小，结果如表2所示：

表2

由表2可看出，本发明实施例1-4得到的产品的苦味平均值均显著低于对比例，表明本发明得到的产品的苦味较小，其中实施例1的苦味最小。参比实施例1-3的部分步骤与实施例1不同，其中参比实施例2的苦味平均值明显升高，表明本发明的步骤(2)能有效减少产品的苦味。

实验例三：抗氧化性测试

测试方法：将产品配制成浓度为0.01g/mL的样品溶液，取500μL样品溶液加入3.8mL在734nm处吸光度为0.7的ABTS稀释工作液，室温下反应8分钟后在734nm处测定出样品溶液吸光度，计算出ABTS自由基清除率，ABTS自由基清除率＝(ABTS自由基清除能力吸光度-样品溶液吸光度)/(ABTS稀释工作液吸光度-蒸馏水吸光度)。ABTS自由基清除率越高表明抗氧化性越好，测试结果如表3所示：

表3

由表3可看出，本发明实施例1-4得到的产品的ABTS自由基清除率均显著高于对比例，表明本发明得到的产品的抗氧化性较好，其中实施例1的抗氧化性最好。参比实施例1-3的部分步骤与实施例1不同，其中参比实施例3的ABTS自由基清除率明显下降，表明本发明的均质操作能有效提高产品的抗氧化性。

实验例四：稳定性测试

测试方法：分别称取1g样品并装进透明塑料包装袋，常温放置30天后按照实验例三的方法测定ABTS自由基清除率，然后计算出ABTS自由基清除率保持率，ABTS自由基清除率保持率＝放置30天后ABTS自由基清除率/原始ABTS自由基清除率×100％。ABTS自由基清除率保持率越高表明稳定性越好，测试结果如表4所示：

表4

由表4可看出，本发明实施例1-4得到的产品的ABTS自由基清除率保持率均显著高于对比例，表明本发明得到的产品的稳定性较好，其中实施例1的稳定性最好。参比实施例1-3的部分步骤与实施例1不同，其中参比实施例1的ABTS自由基清除率保持率明显下降，表明本发明的高压操作能有效提高产品的稳定性。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。