一种基于纳米孔测序的病原分子检测方法

摘要

本发明属于生物技术领域，公开了一种基于纳米孔测序的病原分子检测方法，所述基于纳米孔测序的病原分子检测方法包括：获取咽拭子样本或鼻咽拭子样本；对获取的咽拭子或鼻咽拭子样本进行核酸提取及纯化；cDNA的制备；cDNA的扩增及纯化；纳米孔文库的制备及测序；进行生物信息学分析，即可得病原分子检测结果。本发明能够基于临床样本直接进行病原分子检测，测序速度快，且能够进行实时监控；同时灵敏度高，检出限低。本发明的纳米孔文库构建逆转录时通用接头的添加和一步法PCR扩增，可实现临床样本中所有序列无偏差的扩增，不仅真实地反映了样本中的病原分子组成和丰度，更重要的是大大提高了检测的灵敏度和准确度。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种基于纳米孔测序的病原分子检测方法。

背景技术

目前：流感是一个主要的全球公共卫生威胁，因为它的高度致病性变体、大型人畜共患病库和大流行可能性。基因组学病毒测序为流感病毒的诊断试验提供了可能还提供了关于传播、进化和耐药性的见解，同时检测其他病毒。

现有大多数流感病毒的临床诊断试验依赖于病毒的检测呼吸道病毒核酸的抗原或PCR扩增；抗原测试通常快速，但敏感性较低；而PCR更耗时，但更敏感。但是不管测试结果如何，大多数临床诊断设备报告非定量(二进制)诊断结果，常规产生的用于流感诊断的数据能力提供流行病学联系、疫苗效力或抗病毒药物敏感性的见解有限。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有的病原分子检测方法敏感性低、检测时间长，同时用于流感诊断的数据能力提供流行病学联系、疫苗效力或抗病毒药物敏感性的见解有限。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于纳米孔测序的病原分子检测方法。

本发明是这样实现的，一种基于纳米孔测序的病原分子检测方法，所述基于纳米孔测序的病原分子检测方法包括：

步骤一，获取咽拭子或鼻咽拭子样本；对获取的咽拭子或鼻咽拭子样本中进行RNA核酸提取及纯化；

步骤二，cDNA的制备:以不依赖于序列的单引物扩增法制备带通用接头的逆转录的cDNA；

步骤三，cDNA的扩增及纯化:以cDNA为模板,接头序列为引物,进行cDNA随机片段的PCR扩增，用AMPure XP磁珠纯化PCR产物；

步骤四，纳米孔测序文库的制备及测序：用基于条形码的文库构建技术纳米孔测序文库，每个样本的测序DNA总量保持相等；将制备好的纳米孔测序文库添加到纳米孔测序芯片中并上机测序

步骤五，病原微生物生物信息学分析：将测序获得的序列进行定量分析，然后进行病原微生物数据库比对，获取病原微生物的相对丰度及组成，即病原分子检测结果。

进一步，步骤一中，所述从获取的咽拭子样本或鼻咽拭子样本中进行核酸提取包括：

(1)取新鲜咽拭子或鼻咽拭子样本于1.5ml无RNA酶的离心管中；同时利用无菌无RNA酶的移液枪头向该离心管中加入800μL生理盐水，涮洗20秒，贴离心管壁挤干拭子上的液体，16,000rpm离心2min，弃700μL上清，剩余100μL上清，充分振荡混匀；

(2)加入200μL裂解液和20μL消化液，振荡混匀，56水浴10min；

(3)加入500μL析出液，轻轻颠倒混匀；

(4)将上述溶液转移至带有收集管的吸附柱中，静置2min，4℃，12000rpm离心1min，弃收集管中的废液；

(5)向吸附柱中加500μL洗涤液，4℃，12000rpm离心1min，弃收集管中的废液；

(6)将吸附柱放回收集管中，4℃，12000rpm离心2min；

(7)取出吸附柱，放入新的1.5mL无RNA酶的离心管，加入30-50μL无RNA酶的水，静置3min，并在4℃、12000rpm条件下离心2min，收集RNA溶液，即获得样本中的病原微生物的RNA核酸；

(8)用RNA Clean&Concentrator-5(Zymo Research)试剂盒对将提取的病原微生物的RNA进行纯化。

进一步，步骤(1)中，所述所述离心力为16000rpm，离心时间为2min。进一步，所述裂解液为异硫氰酸胍、碘化锂、柠檬酸、Tween20中的其中一种。

进一步，步骤二中，所述cDNA的制备包括：

(1)将4μl RNA和1μl引物A(5’-GTTTCCCACTGGAGGATA-N9-3’，40pmol/μl)混合并在65℃孵育5min，然后冷却到室温。

(2)向以上产物中添加2μL SuperScript IV first-strand buffer(ThermoFisher)，1μl 12.5mM二磷酸三核苷(dNTPs)，0.5μL 0.1M二硫苏糖醇(DTT)，1μL H

进一步，步骤三中，所述cDNA的扩增及纯化包括：

(1)cDNA的扩增体系的配置：以上cDNA模板5μL，加入5μL AccuTaq LA(Sigma)reaction mixture，以及1μl引物B(5’-GTTTCCCACTGGAGGATA-3’)进行cDNA扩增。

(2)PCR扩增条件：98℃30s，30个循环(94℃15s，50℃20s，68℃2min)，68℃10min。

(3)扩增产物用AMPure XP磁珠(Beckman Coulter，Brea，CA)纯化，并使用Qubit高灵敏度双链DNA(dsDNA)试剂盒(Thermo Fisher)进行定量。

进一步，步骤四中，所述纳米孔测序文库的制备及测序包括：

(1)通过NEBNext末端修复/dA尾添加模块进行修复和dA尾添加，并用AMPure XP磁珠纯化S-dsDNA-A，将不同样本中纯化的S-dsDNA-A连接相应的条形码后，再次用AMPure XP磁珠纯化，即可得纳米孔测序文库。

(2)将利用制备好的纳米孔测序文库载入纳米孔测序芯片，通过MinION测序平台进行测序。

进一步，步骤五中，所述病原微生物生物信息学分析包括：

首先，对纳米孔测序数据过滤测序接头序列、过滤质量值小于7的reads、过滤长度小于500bp的reads；同时将干净数据mapping到参考基因组，进行比对效率、全基因组reads覆盖度、测序深度统计；

其次，进行纳米孔测序数据整体比对质量评估，判断三代数据异常，若比对效率高于70％，并且全基因组覆盖度高于50％，则进行下游分析；并基于比对结果挖掘within-alignmentreads和split reads信息；

然后，基于reads支持信息界定结构变异和分型；进行多样本数据变异类型整合；同时基于整合结果对纳米孔测序数据对变异处的碱基位置进行最大可能性的碱基型和质量值预测；

最后，根据最大可能性的碱基型和质量值，将所述多个变异片段整合为一条读长。

进一步，步骤五中，所述生物信息学分析包括：

第一步，建立含有300多条Refseq标准病毒数据库，并根据RefSeq数据库对得到的序列进行分类；

第二步，将测序得到的序列映射到选择的引用序列上，通过使用生成一致序列草案确定每个位置的核苷酸的，并得到协商一致草案序列；

第三步，对病毒序列数据库进行BLAST搜索；读取再次映射到引用序列；读取映射的百分比和覆盖深度即可。

本发明的另一目的在于提供一种实施所述基于纳米孔测序的病原分子检测方法的终端。

本发明的另一目的在于提供一种所述基于纳米孔测序的病原分子检测方法在检测流感病毒中的应用。

结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明能够基于临床样本直接进行病原分子检测，测序速度快，且能够进行实时监控；同时灵敏度高，检出限低。本发明的纳米孔文库构建通过不依赖于序列的单引物PCR扩增法建库，可直接加接头测序，不仅提高了样本中所有病原微生物的丰度，更重要的是更加真实反映样本中的病原分子组成和丰度，准确度/吻合度远高。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的基于纳米孔测序的病原分子检测方法流程图。

图2是本发明实施例提供的从获取的咽拭子样本或鼻咽拭子样本中进行核酸提取的方法流程图。

图3是本发明实施例提供的cDNA的扩增和纯化的步骤流程图。

图4是本发明实施例提供的纳米孔文库构建的流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于纳米孔测序的病原分子检测方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。

如图1所示，本发明实施例提供的基于纳米孔测序的病原分子检测方法包括：

S101：获取咽拭子或鼻咽拭子样本；对获取的咽拭子或鼻咽拭子样本进行核酸提取和纯化；

S102：cDNA的制备:以不依赖于序列的单引物扩增法制备带通用接头的逆转录的cDNA；

S103：cDNA的扩增及纯化:以cDNA为模板,接头序列为引物,进行cDNA随机片段的PCR扩增，PCR产物用AMPure XP磁珠纯化；

S104：纳米孔测序文库的制备及测序：用基于条形码的文库构建技术纳米孔测序文库，每个样本的测序DNA总量保持相等；将制备好的纳米孔测序文库添加到纳米孔测序芯片中并上机测序；

S105：病原微生物生物信息学分析：将测序获得的序列进行定量分析，然后进行病原微生物数据库比对，获取病原微生物的相对丰度及组成，即病原分子检测结果。

如图2所示，步骤S101中，本发明实施例提供的从获取的咽拭子样本或鼻咽拭子样本中进行核酸提取包括：

S201，取新鲜咽拭子或鼻咽拭子样本于1.5ml离心管中，并向其中加入哈扎拉病毒；同时利用无菌移液枪头向该离心管中加入300ul生理盐水和50ul蛋白酶处理液，震荡混匀5min，60℃水浴静置5min；

S202，取50-200ul样本处理液于1.5ml离心管中，使用无菌移液枪头向离心管中加入320ul裂解液、310ul异丙醇和纳米磁珠25ul，震荡混匀2min，室温静置15min；

S203，将离心管置于磁力架上40s，待纳米磁珠完全吸至管壁之后，使用无菌移液枪头吸弃上清溶液；使用无菌移液枪头向离心管中加入300-800ul洗涤液，将离心管震荡混匀2min，置于磁力架上40s，待纳米磁珠完全吸至管壁之后，使用无菌移液枪头吸弃上清溶液；

S204，重复一次步骤S203后于室温下开盖干燥25min直至管内无液体残留；使用无菌移液枪头向离心管中加入100-200ul洗脱液，60℃水浴15min；

S205，将离心管震荡混匀2min，置于磁力架上40s，待纳米磁珠完全吸至管壁之后，使用无菌移液枪头吸取上清至新的离心管，即获得样本中的病原体核酸。

步骤S201中，本发明实施例提供的蛋白酶处理液浓度为60mg/ml；所述蛋白酶处理液包括蛋白酶K。

本发明实施例提供的裂解液为异硫氰酸胍、碘化锂、柠檬酸、Tween20中的其中一种。

如图3所示，步骤S102中，本发明实施例提供的制备纳米孔文库包括：

S301，获取咽拭子或鼻咽拭子样本，并对样本进行离心处理弃上清，重悬离心所得沉淀，制成重悬液；

S302，向重悬液中添加浓度为0.36％的皂苷，孵育20mim；孵育结束后再加入60U/mL的HL-SAN酶，孵育10～25min，进行DNA降解；

S303，向降解后的样本中加入PBS缓冲液，混匀后于16000rpm离心2min，弃上清，保留沉淀；即可得分离后的DNA；对分离后的DNA进行纯化；并进行定量和稀释；

S304，通过NEBNext末端修复/dA尾添加模块进行修复和dA尾添加，并用磁珠纯化S-dsDNA-A，将纯化的S-dsDNA-A添加条码并放大后，利用测序平台对DNA进行测序，即可得纳米孔文库。

步骤S301中，本发明实施例提供的离心力为16000rpm，离心时间为2min。

如图4所示，本发明实施例提供的纳米孔文库构建包括：

S401，对纳米孔测序数据过滤测序接头序列、过滤质量值小于7的reads、过滤长度小于500bp的reads；同时将干净数据mapping到参考基因组，进行比对效率、全基因组reads覆盖度、测序深度统计；

S402，进行纳米孔测序数据整体比对质量评估，判断三代数据异常，若比对效率高于70％，并且全基因组覆盖度高于50％，则进行下游分析；并基于比对结果挖掘within-alignmentreads和split reads信息；

S403，基于reads支持信息界定结构变异和分型；进行多样本数据变异类型整合；同时基于整合结果对纳米孔测序数据对变异处的碱基位置进行最大可能性的碱基型和质量值预测；

S404，根据最大可能性的碱基型和质量值，将所述多个变异片段整合为一条读长；

S405，建立含有300多条Refseq标准病毒数据库，并根据RefSeq数据库对得到的序列进行分类；

S406，将测序得到的序列映射到选择的引用序列上，通过使用生成一致序列草案确定每个位置的核苷酸的，并得到协商一致草案序列；

S407，对病毒序列数据库进行BLAST搜索；读取再次映射到引用序列；读取映射的百分比和覆盖深度即可。

以上所述，仅为本发明较优的具体的实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。