一种用于实时荧光RAA检测环孢子虫DNA的引物探针组合物和试剂盒及其应用

摘要

本发明公开了一种用于实时荧光RAA法检测环孢子虫DNA的引物探针组合物，包括：核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的下游引物；以及核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的探针。此外，本发明还公开了包含了上述引物探针组合物的试剂盒及该引物探针组合物的应用。本发明能够快速、有效地检测环孢子虫，检测准确性、特异性和敏感性高，所述的检测试剂盒灵敏、稳定、有效。

说明书

技术领域

本发明涉及寄生虫的分子生物学检测技术领域，特别是涉及一种用于定性检测环孢子虫DNA的引物组、试剂盒及方法。

背景技术

环孢子虫(Cyclospora，又称圆孢子虫)是一种人畜共患的肠道致病性原虫，在免疫功能正常或免疫受损的个体中均可导致严重腹泻及其他胃肠道疾病，同时还伴随有食欲减退、乏力、腹胀、腹痛、恶心、呕吐、体质量减轻等症状，严重的甚至导致死亡。环孢子虫生活史属于典型的单宿主型，即在一个宿主体内完成无性繁殖和有性繁殖。宿主刚排出粪便中的环孢子虫卵囊无感染性，卵囊需在适宜的温度下(22～32℃)经过1～2周左右的孢子化过程才具有感染性。

19世纪90年代以前仅有散在的环孢子虫病的流行，以后，环孢子虫感染在全球范围内大规模暴发。环孢子虫病最初主要发生于尼泊尔、印度尼西亚、危地马拉、约旦等国家，因此被认为是发展中国家的地方性疾病。后来，环孢子虫病在美国、加拿大、德国、墨西哥和土耳其等国家相继暴发，其暴发流行通常与前往发展中国家的旅行者或食用进口新鲜食品有关。在我国河南、云南、陕西、安徽、广东和浙江等省份也报道了多起环孢子虫感染病例。

目前，环孢子虫常用的检测方法主要为直接涂片法、染色显微镜检查、流式细胞仪检测与及核酸检测。因其卵囊微小，故直接涂片法与显微镜检查存在一定的漏检和误诊；流式细胞仪的设备复杂、成本较高，不适宜大规模推广应用。以上方法对环孢子虫的检测均有一定的局限性，限制了环孢子虫暴发流行的及时检测和溯源。分子生物学方法因其高灵敏度、快速、廉价的特点被国内外研究人员所青睐，也成为环孢子虫检测研究的一个热点和趋势。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供环孢子虫实时荧光RAA检测试剂盒，使其能够快速、有效地对环孢子虫进行检测，准确性、特异性和敏感性高，稳定性好。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于实时荧光RAA检测环孢子虫DNA的引物探针组合物，包括引物和探针，所述引物包括上游引物和下游引物；

所述上游引物的序列如SEQ ID No.1所示；

所述下游引物的序列如SEQ ID No.2所示；

所述探针的序列如SEQ ID No.7所示。

优选的，所述探针为在SEQ ID No.7所示序列的第31位碱基修饰荧光报告基团、第35位碱基修饰淬灭基团和第33位碱基修饰四氢呋喃残基的物质。

优选的，所述荧光报告基团选自FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3和Cy5中任意一种。

优选的，所述淬灭基团选自TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3和DABCYL中任意一种。

本发明还提供了一种试剂盒，包括上述技术方案所述的引物探针组合物、RAA基础荧光通用反应试剂、反应缓冲液、阴性质控品、阳性质控品。

优选的，所述试剂盒中包括：引物探针组合物40～80μL，所述上游引物和下游引物的独立浓度为0.03～0.07mM，所述探针的浓度为0.01～0.03mM；RAA基础荧光通用反应试剂150～250μL；反应缓冲液1000～1800μL；阴性质控品25～35μL,成份为ddH

优选的，所述阴性质控品为ddH

优选的，所述阳性质控品为含有环孢子虫DNA片段的质粒，所述环孢子虫DNA片段的序列如SEQ ID No.10所示。

优选的，所述RAA基础荧光通用反应试剂组份包含重组酶，DNA聚合酶，单链DNA结合蛋白，dNTPs。

优选的，所述反应缓冲液包括：450～550mM的Tris-HCl、200～300mM的MgAc和质量体积百分含量为5～15％的PEG10000。

优选的，所述试剂盒在使用时，实时荧光RAA反应体系每50μL包括：RAA基础荧光通用反应试剂冻干粉，47μL反应缓冲液，2μL引物探针组合物，1μL样品、阴性质控品、阳性质控品。

所述实时荧光RAA反应的条件包括：所述实时荧光RAA反应的温度为30～45℃，所述实时荧光RAA反应的时间为15～20min。

RAA(Recombinase Aided Amplification)，重组酶介导的等温扩增技术，是一种利用重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶在等温条件37℃下，重组酶与引物形成聚合体扫描双链DNA，在与引物同源的序列处使双链DNA解旋。在单链结合蛋白(SSB)和DNA聚合酶的作用下，使引物和模板之间发生链替换，新的DNA片段可以在体外快速地扩增出来。在单链结合蛋白以及缩合剂聚乙二醇(PEG10000)存在的条件下，不断重复这一过程而最终实现核酸的高效扩增，5-20分钟之内就可以将目的基因扩增放大几百万倍，达到可以用仪器检测到的水平。RAA具有扩增时间短(<20min)、反应温度区间大(37-42℃)、操作简便、不需要昂贵仪器等特点。

本发明通过大量的对比实验筛选到一种用于实时荧光RAA法检测环孢子虫DNA的引物探针组合物，包括引物和探针，所述引物为上游引物和下游引物；所述上游引物的序列如SEQ ID No.1所示；所述下游引物的序列如SEQ ID No.2所示；所述探针的序列如SEQ IDNo.7所示，所述探针的荧光报告基团修饰在离5’端碱基数31bp位置上，所述探针的淬灭基团修饰在离3’端碱基数16bp位置上；所述荧光报告基团与淬灭基团之间的碱基位置，由四氢呋喃残基修饰。该特定的引物探针组达到了其他引物探针组所预料不到的检测特异性和灵敏度。本发明实施例1-实施例3的结果显示：本方法与实时荧光PCR法相比具有以下优点：1)灵敏度：自建立的实时荧光RAA法最低检测限与现有的实时荧光PCR法最低检测限等同，均为10拷贝/μL；2)耗时：实时荧光PCR法一个实验轮回耗时为72min，而自建立的RAA法一个实验轮回为20min；3)仪器：目前现有的实时荧光PCR法检测仪器较大不适用于现场检测，而RAA法所用仪器体积小，携带方便，适用于现场检测。

附图说明

图1、图2为实施例2的检测扩增图；图1为实时荧光RAA检测结果；图2为实时荧光PCR检测结果；阴性对照即试剂盒中阴性质控品；

图3为实施例3的检测扩增图；图3中，阴性对照即试剂盒中阴性质控品；

图4为实施例4的检测扩增图；图4中，NC：阴性对照；10

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如J.Sambrook等在《分子克隆实验指南》(科学出版社，1992)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选引物探针组

本发明提供了一种基于RAA荧光法检测环孢子虫的引物、探针及试剂盒，其实现方法有以下几个步骤：

1)引物探针设计以及选择探针上荧光修饰基团和荧光淬灭基团；

2)合成引物探针；

3)合成阳性质粒；

4)制备阳性质粒标准品；

5)引物筛选；

6)最佳引物组合确认；

7)提取环孢子虫样本DNA进行验证；

根据样本环孢子虫(Cyclospora cayetanensis)名称，通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)，获得多条环孢子虫18S ribosomal RNA基因序列信息，运用DNAMAN软件进行同源性分析和Blast序列分析，筛出环孢子虫高度保守序列如下(SEQ ID No.10)；

GTTGGTTTCTAGGACCGAGGTAATGATTAATAGGGACAGTTGGGGGCATTCGTATTTAACTGTCAGAGGTGAAATTCTTAGATTTGTTAAAGACGAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAAGAACGACAGTAGGGGGTTTGAAGACGATTAGATACCGTCGTAATCTCTACCATAAACTATGCCGACTAGAGATAGGGAAATGCCTACCTGAGGTATTCTTACCTGAGAA

以该高度保守序列作为检测目的基因，合成阳性质粒并委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成DNA质粒，质粒大小为247bp；

1、引物探针设计

以上述高度保守序列(SEQ ID No.10)作为检测目的基因，根据RAA技术引物及探针设计原则进行设计，在该片段上下游各设计3条引物以及3条探针，具体序列信息见下表1：

表1引物及探针序列信息

2、选择荧光修饰基团和荧光淬灭基团

根据实验仪器采用的是无锡奇天生物科学仪器有限公司生产的QT-RAA-F1620恒温核酸扩增检测仪，所检测的荧光为FAM荧光，因此荧光修改基团选为FAM，荧光淬灭基团选为BHQ1；

也可以根据仪器检测荧光的性能，将荧光修饰基团选择为HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5。荧光淬灭基团选择TAMRA、Eclipse、BHQ2、BHQ3或DABCYL。但优选荧光修饰基团为FAM，优选荧光淬灭基团为BHQ1。

3、所述探针的修饰方法优选包括：探针P001:第31位碱基修饰荧光报告基团、第35位碱基修饰淬灭基团和第33位碱基修饰四氢呋喃残基的物质，经过修饰的探针(P001)为5’-CTGCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCA/i6FAMdT/T/idSp/A/iBHQ1dT/CAAGAACGACAGTAG-3’C3 Spacer；探针P002:第31位碱基修饰荧光报告基团、第33位碱基修饰淬灭基团和第32位碱基修饰四氢呋喃残基的物质，经过修饰的探针(P002)为5’-GAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGATG/i6FAMdT/idSp/iBHQ1dT/TCATTAATCAAGAACG-3’C3Spacer；探针P003:第31位碱基修饰荧光报告基团、第34位碱基修饰淬灭基团和第32位碱基修饰四氢呋喃残基的物质，经过修饰的探针(P003)为5’-CTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTT/i6FAMdT/idSp/A/iBHQ1dT/TAATCAAGAACGAC-3’C3Spacer。

4、引物探针及质粒均委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成。

5、阳性质粒标准品制备。

重组质粒通过转接大肠杆菌培养并提取，得到质粒后用超微量紫外分光光度计进行浓度测定并进行拷贝数计算，按浓度梯度稀释制备成1.0×10

6、引物筛选

将合成的上下游各3条引物，按3×3分别与3条探针组合进行引物筛选。筛选过程中所用阳性质粒浓度为1.0×10

表2探针P001与9对引物组合筛选结果

从表2中可以看出，F001/R001在1.0×10copies/μL、1.0×10

表3探针P002与9对引物组合筛选结果

从表3中可以看出，F002/R002组合在1.0×10copies/μL、1.0×10

表4探针P003与9对引物组合筛选结果

从表3中可以看出，F002/R003组合在1.0×10copies/μL、1.0×10

7.引物组合确认

将人阳性粪便中提取的环孢子虫核酸用双蒸水进行10倍梯度稀释至10

表5引物确定结果

从表5中可以看出，引物探针组合F001/R001/P001检测灵敏度最高，样本稀释100倍仍可检出，符合试剂盒的要求，且达到了其他引物探针组所预料不到的技术效果，因此将引物F001/R001、探针P001作为试剂盒组份。

8.试剂盒组成

基于RAA荧光法检测环孢子虫的核酸试剂盒，包括所述的引物探针组合物、RAA基础荧光通用反应试剂、反应缓冲液、阴性质控品、阳性质控品。

本发明提供的试剂盒优选包括40～80μL的引物探针组合物，更优选为50～70μL，最优选为60μL。在本发明中，所述上游引物和下游引物的浓度独立的优选为0.03～0.07mM，更优选为0.04～0.06mM，最优选为0.05mM；所述探针的浓度优选为0.01～0.03mM，更优选为0.02mM。在本发明中，所述引物和探针的溶剂优选为ddH2O。

本发明提供的试剂盒优选包括RAA基础荧光通用反应试剂，所述RAA基础荧光通用反应试剂的管数优选为24管，所述RAA基础荧光通用反应试剂优选以冻干粉的形态提供。本发明对所述RAA基础荧光通用反应试剂的来源没有特殊限定，本发明的RAA基础荧光通用反应试剂采购自江苏奇天基因生物科技有限公司(货号为F00001)。所述RAA基础荧光通用反应试剂组份包含重组酶，DNA聚合酶，单链DNA结合蛋白，dNTPs

本发明提供的试剂盒优选包括1000～1800μL的反应缓冲液，更优选为1200～1600μL，最优选为1400μL。反应缓冲液的PH值在7.0－8.4，更优选为7.4－8.0，最优选为7.6；在本发明中，所述反应缓冲液优选包括：450～550mM的Tris-HCl、200～300mM的MgAc和质量体积百分含量为10％的PEG10000；更优选包括：480～520mM的Tris-HCl、220～280mM的MgAc和质量体积百分含量为8～12％的PEG10000；最优选包括：500mM的Tris-HCl、250mM的MgAc和质量体积百分含量为10％的PEG10000。

本发明提供的试剂盒优选包括阴性质控品25～35μL，所述阴性质控品为ddH2O；所述阴性质控品的体积更优选为28～32μL，最优选为30μL。

本发明提供的试剂盒优选包括浓度为1.0×10

GTTGGTTTCTAGGACCGAGGTAATGATTAATAGGGACAGTTGGGGGCATTCGTATTTAACTGTCAGAGGTGAAATTCTTAGATTTGTTAAAGACGAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAAGAACGACAGTAGGGGGTTTGAAGACGATTAGATACCGTCGTAATCTCTACCATAAACTATGCCGACTAGAGATAGGGAAATGCCTACCTGAGGTATTCTTACCTGAGAA

根据SEQ ID No.10所示的序列委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成DNA质粒，质粒大小247bp。

在本发明中，所述试剂盒在使用时，实时RAA荧光反应体系每50μL包括：47μL反应缓冲液，2μL引物探针组合物，1μL样品或阴性质控品或阳性质控品。

在本发明中，所述实时RAA荧光反应的条件包括：所述实时RAA荧光反应的温度优选为30～45℃，更优选为35～40℃，最优选为39℃；所述实时RAA荧光反应的时间优选为15～25min，更优选为18～22min，最优选为20min。

在本发明中，所述检测环孢子虫DNA的结果分析条件优选设定为：在20min内FAM荧光检测仪器检测到信号明显增强，增加的荧光值达到本底值的30％以上为阳性；在20min内FAM荧光仪器信号无增加，显示扩增结果为阴性。

在本发明中，待测样品为经巢氏PCR扩增鉴定的人粪便阳性环孢子虫DNA；所述待测样品的制备方法优选包括：临床病人的腹泻样本用粪便核酸提取试剂盒提取核酸，操作步骤按照试剂盒说明书进行，后续经nest-PCR扩增和测序验证为环孢子虫阳性。在试剂盒使用时，样品的量优选为1μL。下面结合具体实施例对本发明所述的一种检测环孢子虫DNA的引物探针组合物和试剂盒做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例2

试剂盒的组成：

引物和探针的设计与具体实施方式中的引物和探针的设计相同，在此不再赘述，引物和探针的序列与具体实施方式中的引物和探针的序列相同，在此不再赘述，探针的荧光报告基团、淬灭基团和四氢呋喃残基的修饰与具体实施方式中的修饰相同，在此不再赘述。

试剂盒的组成见表6。

表6试剂盒组成

将5μL重组质粒转接大肠杆菌培养并提取出来的浓度为10

标准工作品1，含有1.0×10

标准工作品2，含有1.0×10

标准工作品3，含有1.0×10

标准工作品4，含有1.0×10

标准工作品5，含有1.0×10

反应体系配制：按吸取282μL反应缓冲液，加入12μL引物探针组合物，充分混均；吸取混均后的缓冲液49μL试剂分别加入到6个装有RAA基础荧光通用反应试剂的管中，使冻干粉充分溶解并混均；在6个配制好的管中分别加入1μL阴性质控品、标准工作品5、标准工作品4、标准工作品3、标准工作品2、标准工作品1为模板，每个反应管进行充分混均，每个反应管总体积为50μL；

检测仪器为RAA-F1620荧光检测仪(江苏，奇天)；

仪器设置为：反应温度39℃，反应时间20min。

将混匀的反应管放入RAA-F1620恒温核酸扩增检测仪中，在39℃反应20min。

检测结果如图1所示。结果显示最快4min明显有扩增，15min内所有标准工作品均有扩增，重复以上实施例，能得到相同的扩增荧光信号，重复性好。能检测到标准工作品5含有10copies/μL的荧光信号。

用实时荧光PCR法对试剂盒中的标准工作品5、标准工作品4、标准工作品3进行检测，具体操作步骤如下：

实时荧光PCR所用引物探针序列如表7：

表7荧光PCR引物探针序列信息

反应体系配置如下表8：

表8荧光PCR反应体系

检测仪器为TL988荧光PCR检测仪(苏州天隆科技有限公司)；

仪器反应程序设置如下表9：

表9荧光PCR扩增程序

表10标准工作品荧光PCR扩增结果

如表10所示，标准工作品3、标准工作品4、标准工作品5均可被实时荧光PCR法检测到，其灵敏度为10copies/μL(标准工作品5)，扩增图见图2。

本实施例的结果表明，2种不同方法学(实时荧光RAA法VS实时荧光PCR法)比对结果相一致，灵敏度均为10copies/μL。

实施例3

试剂盒的组成与实施例2相同。

样本来源及DNA提取：

样本由中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所提供，为临床腹泻病人粪便样本，DNA提取采用商品化的粪便样本DNA提取试剂盒，提取操作步骤按试剂盒说明书进行，提取后的DNA-80℃保存备用。

反应体系配制：取3个反应管，分别按如下操作，吸取47μL反应缓冲液，加入2μL引物探针组合物，充分混匀；将混匀后的缓冲液49μL试剂加入到装有RAA荧光基础通用反应管中，使冻干粉充分溶解并混匀；在3个配制好的反应管中分别加入1μL阴性质控品、1μL提取好的样本DNA为模板，每个反应管进行充分混匀，每个反应管总体积为50μL；

检测仪器采用江苏奇天基因生物科技有限公司提供的RAA-F1620恒温核酸扩增检测仪；

仪器设置为：反应温度39℃，反应时间20min。

将混匀的反应管放入RAA-F1620恒温核酸扩增检测仪中，在39℃反应20min，检测结果如图3所示。结果显示6min明显有扩增，重复以上实施例，能得到相同的扩增荧光信号，重复性好。

实施例4

试剂盒的组成同实施例2。

样本来源及DNA提取：

所有样本均由中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所提供，包括日本血吸虫成虫，感染细粒棘球绦虫的犬粪便，感染微孢子虫的动物粪便，感染贾第虫的动物粪便，感染隐孢子虫的动物粪便，感染芽囊原虫的人粪便，感染溶组织内阿米巴的人粪便，感染华支睾吸虫的人粪便，以及健康人粪便样本。DNA提取分别采用QIAGEN组织和粪便基因组DNA试剂盒，提取操作步骤按试剂盒说明书进行，提取后的DNA-80℃保存备用。

反应体系配制：取26个反应管，分别按如下操作，吸取47μL反应缓冲液，加入2μL探针与引物的混合物，充分混均；将混均后的缓冲液49μL试剂加入到装有RAA基础荧光通用反应试剂的管中，使冻干粉充分溶解并混均；在26个配制好的管中分别加入1μL阴性质控品、1μL环孢子虫样本DNA、1μL日本血吸虫样本DNA、1μL细粒棘球绦虫样本DNA、1μL微孢子虫样本DNA、1μL贾第虫样本DNA、1μL隐孢子虫样本DNA、1μL人芽囊原虫样本DNA、1μL溶组织内阿米巴DNA、1μL华支睾吸虫样本DNA及1μL健康人样本DNA为模板，每个反应管进行充分混均，每个反应管总体积为50μL；

检测仪器为RAA-F1620恒温核酸扩增检测仪(江苏，奇天)。

仪器设置为：反应温度39℃，反应时间20min。

将混匀的反应管放入RAA-F1620恒温核酸扩增检测仪，在39℃反应20min。

检测结果如图4所示，结果显示只有环孢子虫样本DNA明显有扩增，其他样本及阴性质控品均没有扩增，均为阴性，表明本发明的试剂盒特异性好。重复以上实施例，能得到相同的扩增荧光信号，重复性好。

由以上实施例可以得出，本发明提供的引物探针组合物能够快速检测环孢子虫，操作简便，在20min内能够得到检测结果。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所（国家热带病研究中心）

江苏奇天基因生物科技有限公司

<120> 一种用于实时荧光RAA检测环孢子虫DNA的引物探针组合物和试剂盒及其应用

<130> WH-NP-20-100860

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 1

tctaggaccg aggtaatgat taatagggac agttg 35

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 2

taggcrtttc cctatctcta gtcggcat 28

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 3

cattcgtatt taactgtcag aggtgaaatt cttag 35

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 4

ctatctctag tcggcatagt ttatggtaga g 31

<210> 5

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 5

tcttagattt gttaaagacg aactactgcg aaagc 35

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 6

ctagtcggca tagtttatgg tagagattac g 31

<210> 7

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 7

ctgcgaaagc atttgccaag gatgttttca ttaatcaaga acgacagtag 50

<210> 8

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 8

cgaactactg cgaaagcatt tgccaaggat gttttcatta atcaagaacg 50

<210> 9

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 9

ctactgcgaa agcatttgcc aaggatgttt tcattaatca agaacgac 48

<210> 10

<211> 247

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 10

gttggtttct aggaccgagg taatgattaa tagggacagt tgggggcatt cgtatttaac 60

tgtcagaggt gaaattctta gatttgttaa agacgaacta ctgcgaaagc atttgccaag 120

gatgttttca ttaatcaaga acgacagtag ggggtttgaa gacgattaga taccgtcgta 180

atctctacca taaactatgc cgactagaga tagggaaatg cctacctgag gtattcttac 240

ctgagaa 247

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 11

taaagacgaa ctactgcga 19

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 12

gtcggcatag tttatggtag a 21

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 13

aagcatttgc caaggatgtt ttc 23