实时荧光PCR检测艰难梭菌和微波隐孢子虫方法的建立及应用

摘要

目的:
　　 运用Taqman探针PCR技术建立鸡肉及粪便中艰难梭菌筛选及致病性的检测方法。同时运用该技术建立粪便中微小隐孢子虫卵囊的检测方法。并将其应用于临床腹泻患者粪便样本中艰难梭菌及微小隐孢子虫卵囊的检测。
　　 方法:
　　 1.以艰难梭菌标准菌株提取DNA，通过测定DNA含量和OD260/OD280值比较确定艰难梭菌最佳DNA提取方法。选择艰难梭菌看家基因tpi、毒素基因A、毒素基因B为靶基因，在其保守序列内设计特异性引物和探针建立Taqman探针PCR体系。对加标含有100to106CFU/ml艰难梭菌的人工污染鸡肉及粪便进行敏感性试验以确定检测低限，通过对其它肠道致病菌的检测进行特异性试验，对含有目标菌的多种细菌DNA混合样本的检测进行干扰试验，以验证方法的可行性。
　　 2.以DnaJ-like蛋白基因为靶基因设计微小隐孢子虫特异性的引物和探针，提取微小隐孢子虫卵囊标准品DNA为模板，建立粪便中微小隐孢子虫卵囊Taqman探针实时PCR检测体系。对含有2.6到2.6×105微小隐孢子虫卵囊的粪便模拟样本进行敏感性试验以确定检测低限，通过对其它肠道寄生虫和致病菌的检测进行特异性试验，对含微小隐孢子虫卵囊DNA混合样品的检测进行干扰试验验证其可行性;
　　 3.收集临床腹泻样本53份，将上述建立方法应用于临床腹泻样本中艰难梭菌和微小隐孢子卵囊检测，并与传统检测方法比对。用艰难梭菌选择性培养基鉴定53份样本中是否含有艰难梭菌，同时通过镜检的方法以判断是否含有微小隐孢子虫。用卡方检验分析比较传统方法与实时荧光PCR方法检测结果的一致性。
　　 结果:
　　 1.对艰难梭菌DNA的提取以试剂盒法效果最佳。建立的Taqman探针PCR技术对艰难梭菌筛选及致病性检测不受其它常见肠道致病菌干扰，特异性高。对艰难梭菌筛选性检出低限分别是标准品为10cfu/ml、粪便人工布菌模拟样本为103cfu/ml，人工污染鸡肉样品为102cfu/ml;对艰难梭菌致病性检测，标准样本中毒素A和B基因的检测低限均为2.5×10-3ngDNA。
　　 2.建立的粪便中微小隐孢子虫卵囊Taqman探针实时PCR方法只对微小隐孢子虫卵囊进行特异性扩增，其他肠道寄生虫及细菌均不能扩增;微小隐孢子虫纯卵囊和基因组DNA检测的灵敏度分别为26个/ml和2.5×10-1ng;对加标粪便样本可检测至2.6×103个/ml卵囊。
　　 3.收集53份临床样本中，经传统方法检测，艰难梭菌的检出率为9.4％(5/53)，微小隐孢子虫卵囊未检测到。经建立的实时荧光PCR方法检测，艰难梭菌的检出率为22.6％(12/53)，同时也未检测出微小隐孢子虫卵囊。12份艰难梭菌阳性样本经毒素基因致病性的检测全部为产毒菌株，均含有A/B毒素，该结果经测序验证与A/B毒素基因序列一致(12/12)。
　　 结论:
　　 本研究建立的粪便中艰难梭菌及微小隐孢子虫卵囊筛选的实时PCR方法具有敏感、准确、特异等优点，针对艰难梭菌及微小隐孢子虫卵囊靶基因设计的引物和探针高度特异，可用于相关病原体的检测，方法最低检测限能够满足临床样本检测需要。艰难梭菌筛选和致病性检测实时PCR方法优于传统方法，可用于对临床腹泻病人的快速检测，作出病因诊断。