隐孢子虫和弓形虫重组酶聚合酶扩增检测方法的建立及应用

摘要

隐孢子虫(Cryptosporidium spp.)和弓形虫（Toxoplasma gondii）是两种不同种属的寄生性原虫。它们能够感染几乎所有的温血动物，并广泛分布于世界各地，对人类健康和畜牧业的发展构成严重威胁。奶牛感染隐孢子虫后，其大量的卵囊由奶牛的粪便散布到环境中。随着奶牛畜牧业的发展，奶牛粪便成为隐孢子虫的重要传染源。猫科动物感染弓形虫后，大量的弓形虫卵囊可随猫的粪便散播到环境中，孢子化的卵囊具有极强的感染能力，并且对外界环境有较强的抵抗力。因此建立高效、快速检测奶牛粪便中隐孢子虫卵囊和环境中弓形虫卵囊的方法，对控制隐孢子虫病和弓形虫病的传播显得尤为重要。
　　重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification，RPA)是近几年出现的有望替代PCR的一种新的核酸扩增技术。反应过程中不需要模板链的热变性，可以在恒定的低温条件下快速扩增DNA或者RNA。其具有特异性强、灵敏度高、快速、操作简便、适用于现场快速诊断等特点，在动物病原的快速检测方面具有巨大的前景和市场。结合相应的探针，RPA扩展产物可以在侧流层析试纸条（lateral flow strip）上显色，从而形成的侧流层析-重组酶聚合酶扩增技术(LF-RPA)比PCR更加适合于现场检测。本研究应用LF-RPA技术，建立了快速检测奶牛粪便中隐孢子虫和环境中弓形虫的方法。研究结果如下:
　　1.隐孢子虫卵囊的DNA可在月桂酰肌氨酸钠(LSS)浓度为0.1％的热水中释放。释放的隐孢子虫DNA用LF-RPA方法进行检测，在30-45℃的条件下，30分钟内最低可检测到0.5个隐孢子虫卵囊的DNA，敏感性高于传统的PCR检测方法，并且与弓形虫、蓝氏贾第虫、柱状艾美尔球虫和微孢子虫无交叉反应。对12份奶牛粪便进行检测，巢式PCR检测出4份为隐孢子虫阳性，而LF-RPA检测出6份为隐孢子虫阳性。
　　2.由于弓形虫卵囊壁结构的坚固性，本研究将环境样品用液氮冷冻并进行反复研磨以得到弓形虫卵囊的DNA。基于弓形虫B1基因设计的引物和探针，结合该DNA提取方法建立了检测环境中弓形虫卵囊的LF-RPA检测方法，以高于巢式PCR检测方法10倍的敏感性，可检测出0.1个弓形虫卵囊的DNA。该方法特异性强。对35份环境样品进行检测，巢式PCR和LF-RPA均检测出5份阳性样品。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 隐孢子虫与弓形虫简介

1．1．1 隐孢子虫

1．1．2 弓形虫

1．2 隐孢子虫与弓形虫检测方法的研究进展

1．2．1 显微检测技术

1．2．2 动物接种分离技术

1．2．3 免疫学检测技术

1．2．4 分子生物学检测技术

1．3 重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification，RPA)

1．3．1 RPA反应原理

1．3．2 RPA引物的设计

1．3．3 目的基因的选取

1，3．4 扩增产物的长度

1．3．5 RPA衍生技术

1．3．6 RPA技术的应用

1．4 本研究的主要内容及目的意义

第二章 隐孢子虫RPA检测方法的建立及应用

2．1 材料

2．1．1 实验材料

2．1．3 实验试剂

2．2 实验方法

2．2．1 隐孢子虫卵囊的纯化

2．2．2 粪便DNA提取试剂盒提取样品DNA

2．2．3 月桂酰肌氨酸钠(LSS)提取隐孢子虫卵囊DNA

2．2．4 引物和探针的设计

2．2．5 RPA凝胶检测方法的建立

2．2．6 LF-RPA检测方法的建立

2．2．7 巢式PCR检测方法的建立

2．3 实验结果

2．3．1 隐孢子虫卵囊DNA提取方法的优化

2．3．2 LF-RPA保守性和特异性分析

2．3．3 LF-RPA与巢式PCR敏感性比较

2．3．4 LF-RPA扩增反应条件的优化

2．3．5 临床样品的检测

2．4 讨论

第三章 弓形虫RPA检测方法的建立及应用

3．1 材料

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验仪器

3．1．3 实验试剂

3．2 实验方法

3．2．1 弓形虫卵囊DNA的提取

3．2．2 土壤DNA的提取

3．2．3 引物和探针的设计

3．2．4 LF-RPA检测方法的建立

3．2．5 巢式PCR检测方法的建立

3．3 实验结果

3．3．2 LF-RPA保守性分析

3．3．4 LF-RPA扩增反应条件的优化

3．3．5 临床样品的检测

3．4 讨论

第四章 全文结论

参考文献

致谢

作者简历