一种盐酸克伦特罗分子印迹聚邻苯二胺修饰电极及其制备方法和应用

摘要

该发明以邻苯二胺为功能单体、盐酸克伦特罗（CLB）为模板、体积配比为1:2的乙腈与去离子水的混合液为洗脱剂，在以玻碳电极为工作电极、铂丝电极为对电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极的三电极系统中，采用循环伏安（CV）法扫描20圈。该模板分子经过洗脱后，使玻碳电极表面形成了CLB分子印迹的聚合物修饰膜，即CLB分子印迹电化学传感器。以该传感器为工作电极对CLB实施了电化学测定。结果表明，在5mol·L‑1 K3[Fe(CN)6]溶液中，该传感器的DPV峰电流与CLB浓度在2.02×10‑8～2.19×10‑6 mol·L‑1范围内有良好的线性关系。通过对三种与CLB结构类似的干扰物选择性实验的结果表明该传感器的选择性能良好。

说明书

技术领域

本发明涉及电化学分析检测技术领域，具体涉及盐酸克伦特罗分子印迹聚苯二胺修饰玻碳电极的制备和应用。

背景技术

盐酸克伦特罗(Clenbuterol hydrochloride，CLB)，化学名称为4-氨基-α-(叔丁胺甲基)3,5-二氯苯甲醇盐酸盐。曾做为药物应用于支气管哮喘和保胎等，但因其毒副作用较大已经被禁止使用。80年代初期意外发现它具有促进瘦肉生长、减少脂肪的作用，而很快被应用于养殖业中。2002年国家有关部门发布《禁止在饲料和动物饮用水中使用的药物品种目录》已经将其列为禁用药品。

目前，测定盐酸克伦特罗的方法有分光光度法、荧光光谱法、化学发光法、毛细管电泳法、高效液相色谱法、电化学法等。其中电化学方法以其操作简单，快速，成本低廉的优点被应用于盐酸克伦特罗的测定。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测盐酸克伦特罗新方法，该方法选择性高、快速、灵敏。

本发明提供了一种盐酸克伦特罗分子印迹聚苯二胺修饰玻碳电极的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

①玻碳电极的预处理：

将GCE抛光、超声清洗后置于5 mmol·L

②盐酸克伦特罗分子印迹聚苯二胺修饰玻碳电极的制备：

将步骤①所得到的GCE置于含2.5～3.0 mmol•L

将步骤②所得到的电极(CLB/POPD/GCE)浸入体积配比为1:2的乙腈与去离子水的混合液中浸泡20min，用以洗脱CLB模板。

本发明的另一目的是提供上述本发明所述的方法制备得到的盐酸克伦特罗分子印迹修饰电极。

本发明所述应用方法优选为盐酸克伦特罗分子印迹电极(MIP/GCE)作为工作电极、银/氯化银电极作为参比电极、铂丝电极作为辅助电极，将上述三个电极置于含有5mmol•L

本发明的有益效果为：

①与现有玻碳电极相比，该修饰电极用于盐酸克伦特罗的测定具有明显的选择性。

②本发明所述的印迹有盐酸克伦特罗的邻苯二胺聚合膜修饰玻碳电极应用于实际检测盐酸克伦特罗，具有快速、灵敏、准确、稳定等特点。

③现有检测盐酸克伦特罗的方法为高效液相色谱法，该方法仪器设备昂贵、操作繁琐、检测费用高，并且产生的流动相污染环境。

附图说明

本发明附图6幅，

附图1 为分子印迹聚合过程曲线。其中1～20：表示电聚合过程中扫描第1至20圈时的CV曲线（从上至下）。

附图2为 CLB印迹膜洗脱前后的CV曲线。其中曲线1 为模板洗脱前，CLB/POPD/GCE为工作电极时的CV曲线;曲线 2为模板洗脱后，CLB分子印迹玻碳电极（MIP/GCE）为工作电极的CV曲线。

附图3聚合底液pH对峰电流的影响。图中显示出pH值在5.3～5.5范围内所制备的修饰电极响应值较好。pH值为5.4时最高。

附图4不同浓度CLB的DPV曲线。图中显示在含有5mmol•L

其中，c（1～8）： 2.02×10

附图5为CLB在该印迹电极上响应的标准曲线。

附图6为选择性测定曲线。以硫酸特布他林(TES)、硫酸沙丁胺醇(SAL)、邻苯二酚作为干扰物质，按前述方法检测该印迹电极对结构相识的几种待测物的电化学响应特性。其中曲线1为CLB; 2为TES; 3为SAL; 4为邻苯二酚。

具体实施方式

实例1

一种CLB分子印迹修饰电极制备方法，所述制备方法包括步骤如下：

①玻碳电极的预处理：

将GCE在麂皮上依次用1.0、0.3和0.05μm的Al

② CLB分子印迹修饰电极的制备：

将步骤①所得到的GCE置于含2.5～3.0 mmol•L

将步骤②所得到的电极(CLB/POPD/GCE)浸入体积配比为1:2的乙腈与去离子水的混合液中浸泡20min，用以洗脱CLB模板。见图2。洗脱模板后，用二次蒸馏去离子水冲洗，并保存在二次馏去离子水中备用，得到CLB分子印迹聚邻苯二胺修饰电极。

应用例1

聚合单体与模板分子用量比的确定：

分别以CLB与OPD的用量比为1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5制备传感器并考察性能，结果表明，当二者浓度比例为1:2.5时，该CLB印迹修饰电极的响应电流最高。

聚合底液种类的确定：

试验了磷酸盐（PBS）、Na2HPO4-NaH2PO4、NaCl、硼酸-硼砂以及乙酸-乙酸钠缓冲溶液分别作为聚合底液时，所制备出的印迹电极性能的区别。结果表明在乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，所制备出的电极表现为峰电流最高。

聚合底液pH值的确定：

考察了不同pH值的支持底液对所制备出的印迹电极性能的影响。如图3所示。在pH值为5.4时的聚合底液中所制备出电极的峰电流最高。在pH值为5.3～5.5时所制备出的电极性能都能满足测定要求。

模板洗脱液的确定：

分别试验了水、甲醇/乙酸混合液、乙醇、丙酮和乙腈等洗脱液，对CLB的洗脱效果。结果表明在1:2的乙腈/水的混合液中浸泡洗脱，有更好的洗脱效果。洗脱时间越久，CLB洗脱的越充分；当超过20min时，K3[Fe(CN)6]峰电流已经达到最大值并趋于平稳。

检测条件及工作曲线的确定：

所述盐酸克伦特罗分子印迹电化学传感器的应用，工作电极为如上所述的盐酸克伦特罗分子印迹电极(MIP/GCE)、参比电极为银/氯化银电极、辅助电极为铂丝电极，采用DPV法通过铁氰化钾探针间接检测CLB。

将制备好的分子印迹电极放入一定浓度的CLB溶液中浸泡，使印迹膜充分吸附CLB分子，再将该电极放入5 mmol•L

DPV方法的电化学条件设置为：初始电位为-0.3 V、终止电位为1 V，电位增量为5mV•s

图4、图5为CLB印迹修饰电极分别在2.02×10

电极更新时间确定：

将测试后的实施例1得到的CLB分子印迹修饰电极浸泡在该实例的模板洗脱液中10min时。即可达到更新要求，可进行下次测定。

在上述实验条件下，采用D差分脉冲伏安法对2.02×10

采用实施例1的方法平行制备了8支CLB分子印迹修饰电极，8只电极之间的RSD为4.1 %，同一电极连续测定10次的RSD为2.2 %，表面电极具有较好的重现性；将该CLB分子印迹修饰电极置于空气中，10天后对CLB检测的响应电流降为原来的79 %，表明该电极稳定性较好。

应用例2

CLB分子印迹修饰电极选择性实验：

以硫酸特布他林(TES)、硫酸沙丁胺醇(SAL)、邻苯二酚作为干扰物质，按应用例1所述的实验方法检测实施例1所制备出分子印迹修饰电极的选择性。实验结果如图6所示，该工作电极不仅对CLB的DPV峰电流值明显高于其他结构类似物，而且线性响应斜率也远远大于所对比的目标。表明该印迹修饰电极的选择性能良好。

应用例3

样品测定与对比试验：

称取2g猪肝样品于50mL离心管中,加入8mL乙酸钠缓冲液，充分混匀，再加入50μLβ-葡萄糖醛甙酶、混匀，37℃条件下水浴水解12 h。然后，离心10 min (5000 r/min),取4mL上清液加0.1 mol/高氯酸溶液5 mL，混合均匀后用高氯酸调节pH值到1±0.3。将该溶液离心10 min后,全部上清液转移到50 ml离心管中,用1 mol/L氢氧化钠调节pH值到11。加入10mL饱和氯化钠溶液和10 mL异丙醇-乙酸乙酯(6+4)混合溶液,充分提取,在 5000 r/min下离心10 min。转移全部有机相,在40℃水浴下用氮吹吹干,加入5 mL乙酸钠缓冲液,超声混匀,使残渣充分溶解。将阳离子交换小柱连接到真空过柱装置,将上述残渣溶液上柱,依次用2 mL的：水、2%甲酸水溶液和甲醇选涤柱子并彻底抽干,最后用2 ml.的5%氨水甲醇溶被洗脱柱子上的待测成份,洗脱液在40℃水浴下氮气吹干。准确加入200μL 0.1%甲酸/水-甲醇溶液(95+5),超声混匀,15 000 r/min离心10 min后，将溶液转移到1.5mL.离心管中待用。

按应用例1中标准曲线的建立的实验条件对该样品进行测定，检测结果表明该样品中盐酸克仑特罗的含量为零。

回收率实验。按同样的测定方法、对3个同一批次样品平行10次实验的平均精密度为2.8 %，评均回收率为101.2 %（见表1）。

表1 样品测定结果

对比实验：

将应用例3中所述处理好的样品按GB/T 22286-2008方法进行测定。

仪器：A1290-6460液相色谱—质谱联用仪；色谱柱：ZORBAX SB-C18: 2.1×50mm。柱温(℃)：30；进样量(μL)：20；流速(mL/min)：0.2；流动相：A相：0.1%甲酸-水 ；B相：0.1%酸化乙腈。

离子源种类： AJS-ESI； MRM扫描方式：正离子；干燥气温度 (℃)：325 ；干燥气流量(L/min)：8 ；雾化器压力（psi）：40 ；毛细管电压（V）：+4000v,-3500v；Fragmentor电压(V )：100。

标准使用液：1μg/mL。建立的标准曲线方程为：Y=3.176035X-0.432407（R