一种基于果蝇生理学指标评估微塑料污染水平的方法

摘要

本发明属于微塑料污染评估技术领域，具体涉及一种基于果蝇生理学指标评估微塑料污染水平的方法，包括以下步骤：(1)收集相同发育阶段的果蝇，挑选健康的果蝇；(2)微塑料污染培养基的制备；(3)将健康的果蝇置于微塑料污染培养基中，恒温连续培养5天，采集果蝇产卵数量，测定不同浓度下微塑料污染所造成的生殖毒性；(4)将健康的果蝇置于微塑料污染培养基中，恒温连续培养20天，测定其行为活动性、进食量及体内代谢物质含量；(5)对生殖毒性、行为活动性、进食量及体内代谢物质含量运用T‑检验进行活动性相关分析。本发明为评价微塑料污染物对生态系统以及人类健康的安全问题提供科学的理论支持。

说明书

技术领域

本发明属于微塑料污染评估技术领域，具体涉及一种基于果蝇生理学指标评估微塑料污染水平的方法。

背景技术

环境污染已经成为全世界普遍存在的问题。近年来，微塑料作为新型环境问题受到全球重视。2015年召开的第二届联合国环境大会上，微塑料污染被列入环境与生态科学研究领域的第二大科学问题，成为与全球气候变化、臭氧耗竭等并列的重大全球环境问题，且微塑料污染日趋严重。

微塑料不仅仅存在环境中，它还可以通过食物传递方式进入人体。研究表明：茶包中的塑料放置在95℃的热水5分钟后，将会释放出116亿个微塑料以及31亿个纳米微塑料。此外，在食盐、啤酒、包装水瓶中都发现了微塑料的存在。所以，在食用在一些用塑料包装的食物中，都可能摄入微塑料。

目前，对于微塑料的风险评估大多围绕海洋以及淡水生物展开研究，以果蝇为模式生物进行研究未被研究。对于模式生物对微塑料污染水平的评估可以通过致死率来判断，但是实验周期较长。因此，在探究微塑料污染带来的潜在危害基础上，如何快速测试微塑料的污染水平是当前亟需解决的难题。

发明内容

基于现有技术中存在的上述缺点和不足，本发明提供一种基于果蝇生理学指标评估微塑料污染水平的方法。

为了达到上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种基于果蝇生理学指标评估微塑料污染水平的方法，包括以下步骤：

(1)收集相同发育阶段的果蝇，挑选健康的果蝇；

(2)微塑料污染培养基的制备；

(3)将健康的果蝇置于微塑料污染培养基中，恒温连续培养5天，采集果蝇产卵数量，测定不同浓度下微塑料污染所造成的生殖毒性；

(4)将健康的果蝇置于微塑料污染培养基中，恒温连续培养20天，测定其行为活动性、进食量及体内代谢物质含量；

(5)对生殖毒性、行为活动性、进食量及体内代谢物质含量运用T-检验进行活动性相关分析。

作为优选方案，所述健康的果蝇为发育正常、体态良好的果蝇。

作为优选方案，所述微塑料污染培养基的制备包括：在基础培养基中添加微塑料；基础培养基每升含琼脂15g、酵母100g、白砂糖50g、氯化钙0.7126g、对羟基苯甲酸乙酯9g溶于30mL的95％乙醇、丙酸6mL。

作为优选方案，所述微塑料配置成悬浮液，添加至基础培养基，以均匀分散于基础培养基中。

作为优选方案，所述微塑料分散于乙醇的水溶液中，配置成悬浮液。

作为优选方案，所述乙醇的水溶液中乙醇与水的体积比为1：1。

作为优选方案，所述微塑料为聚对苯二甲酸乙二酯、聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯或聚苯乙烯。

作为优选方案，所述恒温连续培养的条件为湿度为60％，温度为25℃。

作为优选方案，所述体内代谢物质为葡萄糖。

本发明与现有技术相比，有益效果是：

本发明以果蝇为模式生物测定微塑料污染物暴露后，对果蝇的生殖能力、行为活动性、进食量以及体内物质代谢影响，研究表明微塑料污染可以造成果蝇生殖能力下降，行为活动性增加，具有统计学意义；但是微塑料暴露对果蝇的进食量和体内代谢物质没有显著影响。本发明可以为评价微塑料污染物对生态系统以及人类健康的安全问题提供科学的理论支持。

附图说明

图1是本发明实施例的PET微塑料污染物暴露下对果蝇生殖能力风险评价对比图；

图2是本发明实施例的PET微塑料暴露下对雌雄果蝇行为活动风险评价对比图；

图3是本发明实施例的PET微塑料暴露下对果蝇进食量风险评价对比图；

图4是本发明实施例的PET微塑料暴露下对果蝇体内代谢物质含量风险评估对比图。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步解释说明。

本发明实施例的基于果蝇生理学指标评估微塑料污染水平的方法，包括以下步骤：

步骤1：首先进行相同发育阶段的果蝇收集，挑选健康的果蝇进行实验；

步骤2：微塑料污染培养基的制作；

步骤3：将健康的果蝇置于微塑料污染的培养基中，在湿度为60％，温度为25度的恒温培养箱中连续培养5天，采集果蝇产卵数量，测定不同浓度下微塑料污染所造成的的生殖毒性；

步骤4：将健康的果蝇置于微塑料暴露培养基中，在湿度为60％，温度为25度的恒温培养箱中连续培养20天，测定其行为活动、进食量、体内代谢物质含量；

步骤5:将实验组与对照组的进行比较，运用t-test(其中活动性为双尾配对T检验，其他均为双尾非配对T检验)，使用pysolo(https://www.pysolo.net/)来进行活动性相关分析。评价的显著水平为p<0.05。选择合适的生理指标评估微塑料污染水平。

其中，步骤1具体包括：在进行果蝇的收集时，我们选择发育正常，体态良好的果蝇进行实验。将发育异常，如过于瘦小或翅膀残破的果蝇排除在外。

步骤2具体包括：在微塑料污染物培养基制作时，微塑料不溶于有机溶剂，我们需要先将微塑料制成悬浮液，之后加入基础培养基中，使其均匀分布在培养基中；

微塑料属于微、纳米级别的颗粒，在制备悬浮液时需要助溶剂，使颗粒可以悬浮而且分布均匀。常用的助溶剂包括甲基纤维素(MC)、羟乙基纤维素(HEC)或羟丙基纤维素(HPC)，但是这些物质会增加溶液的粘稠度，使微塑料加入培养基后容易聚合在一起，不能保持原有的颗粒大小。在综合测试比较后本实验使用乙醇作为悬浮液的溶剂。

乙醇具有生物毒性，毒性级别属于低毒。因此我们将乙醇和水按照1:1进行配置助溶剂。在微塑料加入助溶剂之后，进行超声和磁力搅拌使颗粒分布的更加均匀。此方法操作简单，成本低，而且可以使微塑料较好的悬浮在溶液中。

步骤4具体包括：对于体内代谢物质，我们主要研究葡萄糖的含量。物质代谢主要包括糖、脂肪、蛋白质和核酸等生物大分子的分解和合成代谢。而葡萄糖代谢是物质代谢的中心环节。葡萄糖可以为机体生命活动提供最重要的能源和碳源，因此我们检测葡萄糖含量作为观测PET微塑料暴露后是否对果蝇体内代谢产生显著影响。

步骤5具体包括：通过对生殖能力，行为活动性，进食量，体内代谢4个方面测定，选择对微塑料污染最为敏感的生理指标，将其运用于微塑料污染水平评估。

本发明实施例的评估过程，具体如下：

1、模式生物

基因型为Canton-S的红眼黑腹果蝇，培养条件为25℃、60％湿度、12小时亮12小时暗。

2、基础培养基

本实验所采用的的是1.0X低热量培养基，即每升食物中含琼脂15g、酵母100g、白砂糖50g、氯化钙0.7126g、对羟基苯甲酸乙酯9g溶于30ml的95％乙醇中、丙酸6mL。

3、PET微塑料污染物培养基建立

试剂：PET(聚对苯二甲酸乙二酯)(2000目)

微塑料的种类繁多，按材料划分有聚乙烯，聚丙烯，聚氯乙烯，聚苯乙烯等。但是PET(聚对苯二甲酸乙二酯)是环境中最丰富的聚合物之一，广泛用于包装材料中，例如矿泉水瓶以及茶包，与人类生活息息相关，因此在本次实验中选择PET微塑料进行研究。

方法：分别称取1g、10g、20gPET微塑料。向其中加入60ml乙醇，60ml纯净水，使乙醇与纯净水的配置为1：1。用磁力搅拌器搅拌1小时，再超声30min,使其均匀分布。在上述基础培养基将制作完成时，将3个浓度的微塑料悬浮液以及仅含悬浮液溶剂分别加入1升食物中，搅拌均匀，灌入试管中，低温冷藏保存。

4、PET微塑料暴露下对果蝇生殖能力风险评价

生殖能力的指标是产卵数目的多少

方法：在PET微塑料污染物培养基中培养至5天，将果蝇放入添加100ul的1.08％的亮蓝溶液培养基中进食22小时之后，丢弃父母代，显微镜下计数。实验应平行重复5组，每组20只果蝇。

实验结果如图1所示，当微塑料浓度为20g/L时，产卵数量由65下降至35，效果显著。说明暴露于微塑料之后，会带来生殖毒性。而且微塑料浓度越大，带来的毒性效果越明显。因此我们可以将果蝇产卵数量作为评价微塑料毒性指标，能够快速、直观地检测微塑料污染物的发育毒性，周期较短。

5、PET微塑料暴露下对果蝇行为活动风险评价

检测运动能力指标，确定PET微塑料暴露下是否会对活动行为造成显著差异

仪器：DAM(Drosophila Activity Monitoring System)(Trikinetics公司)

方法：在在PET微塑料污染物培养基中培养至20天，将果蝇放入监测器中。在放置过程中，一般追求对称原则，保证实验组与对照组的果蝇所处环境相同，避免外界的干扰。监测时间在26小时以上，舍弃开始后以及结束前的一小时的数据，选取中间的24小时数据，即果蝇已经适应新环境后的数据，确保数据的准确性。实验平行重复4组，每组10只果蝇。

实验结果如图2所示，PET微塑料暴露下，果蝇的行为活动性显著增强。探究其原因是微塑料摄入后会造成饱腹感，这种饱腹感会使果蝇的行为活动增加。蝇活动行为的增强效果不随污染物暴露浓度的高低呈递进关系。由图2可知，雄性果蝇在10g/L、20g/L的PET微塑料培养基中，活动性增强效果较1g/L的PET微塑料培养基高。但是对于雌性果蝇来说，1g/L的PET微塑料暴露下，活动性增强显著。10g/L、20g/LPET微塑料暴露下，果蝇行为活动相对于对照组比较，并没有更活跃。因此不能以果蝇的行为活动作为指标检测微塑料污染水平。

6、PET微塑料暴露下对果蝇进食量、体内代谢物质含量风险评价

检测进食量以及D-葡萄糖含量，确定PET微塑料暴露下是否会造成显著差异

仪器：酶标仪(Thermo Fisher，美国)离心机(Thermo Fisher，美国)

进食量测定方法：在PET微塑料污染培养基培养至第20天，将果蝇放入添加200uL的5.4％蓝色染料溶液的培养基，进食4个小时。然后麻醉收进1.5mL离心管中，-18℃冷冻20分钟。先向离心管中加入200uL水，使用研磨器使果蝇完全研磨碎，再加入1000uL水清洗研磨器。放入离心机中离心(9000r/min，15min，25℃)，然后取上清液200uL放入酶标板中，测量629nm处吸光值。实验平行重复4组，每组20只果蝇。

代谢物质测定方法：为了测定D-葡萄糖含量，用海藻糖酶培养样品，将海藻糖转化为葡萄糖，然后用葡萄糖(GOPOD格式)分析试剂盒(Megazyme Inc.)测量葡萄糖浓度。实验平行重复3组，每组40只果蝇。

实验结果如图3和图4所示，无论对于雌性果蝇还是雄性果蝇，PET微塑料暴露浓度或高或低，进食量和D-葡萄糖含量都没有显著变化。根据活动性数据分析，认为在一定颗粒大小范围内，以及在一定暴露浓度水平上，果蝇可以通过自身的代谢系统，消除微塑料带来的影响。

因为果蝇体内进食量和D-葡萄糖含量对PET微塑料不敏感，因此，不能选择进食量以及D-葡萄糖含量作为微塑料污染水平检测。

研究发现微塑料暴露浓度的越高，对生殖能力造成的影响越大。我们可以以生殖功能作为生理指标用于微塑料污染水平的评估。此方法周期较短，操作简便快速、成本低廉。

以上所述仅是对本发明的优选实施例及原理进行了详细说明，对本领域的普通技术人员而言，依据本发明提供的思想，在具体实施方式上会有改变之处，而这些改变也应视为本发明的保护范围。