通过利用混合原料的全发酵进行的寡糖的发酵生产

摘要

本发明公开了用于生产在其还原端包含半乳糖‑β1,4‑葡萄糖部分的寡糖的遗传工程化的微生物细胞，其中所述微生物细胞能够在没有外源添加的乳糖的情况下生产所述寡糖，以及使用所述微生物细胞生产所述寡糖的方法。

说明书

本发明涉及能够产生乳糖或在其还原端包含半乳糖-β1,4-葡萄糖部分的目的寡糖的细菌宿主细胞，以及涉及产生乳糖或包含末端半乳糖-β1,4-葡萄糖部分的目的寡糖的方法。

背景技术

人乳包含碳水化合物、脂肪、蛋白质、维生素、矿物质和微量元素的复杂混合物。人乳的最多的级分由碳水化合物组成。人乳中碳水化合物的级分可进一步分成(i)乳糖和(ii)寡糖(人乳寡糖，HMO)。鉴于乳糖(半乳糖-β1,4-葡萄糖)被用作能源，寡糖却不被婴儿代谢。寡糖的级分占总碳水化合物级分的最高达1/10，并且可能由150多种不同的寡糖组成。这些复杂寡糖的存在和浓度是人类所特有的，因此无法在其他哺乳动物(包括乳场动物)的乳中大量发现。

最重要的人乳寡糖为2’-岩藻糖基乳糖和3’-岩藻糖基乳糖，它们共同占总HMO级分的最高达1/3。人乳中存在的其他重要的HMO为乳-N-四糖、乳-N-新四糖和乳-N-岩藻戊糖I。除这些中性寡糖以外，还可在人乳中发现酸性HMO，例如3’-唾液酸乳糖、6’-唾液酸乳糖以及3-岩藻糖基-3’-唾液酸乳糖、唾液酸-乳-N-四糖、二唾液酸-乳-N-四糖。值得注意的是，绝大多数HMO在它们的还原端包含半乳糖-β1,4--葡萄糖部分。HMO的结构与上皮细胞表面糖缀合物的表位(Lewis组织血型抗原，例如Lewis x(LeX))是近缘的。HMO与上皮表位的结构相似性说明了针对细菌病原体的HMO保护特性。

人乳中寡糖的存在早已为人所知，几十年来一直对这些寡糖的生理功能进行医学研究。对于一些更丰富的人乳寡糖，已经确定了特定的功能。

除了本文前面提到的肠道中的局部效应外，HMO还被证明通过进入婴儿的全身循环而引起全身效应。此外，HMO对蛋白质-碳水化合物相互作用(例如选择蛋白-白细胞结合)的影响可调节免疫应答和减少炎症应答。此外，越来越多的人认识到HMO是婴儿微生物群发育的关键底物。

由于益生元寡糖(特别是HMO)的有益特性得到充分研究，但其天然来源的可获得性受限，因此非常需要HMO的高效的商业(即大规模)生产。

为尝试大规模生产单个人乳寡糖，开发了这些寡糖中的一些的化学途径。然而，这些方法包括使用几种有毒化学品，这增加了污染最终产物的风险。迄今为止，还不能通过化学合成提供至少足以用于食品应用的大规模数量以及质量。

为了避免与人乳寡糖化学合成相关的缺点，开发了几种酶法和发酵法用于它们的生产。已开发了用于几种HMO的发酵生产方法，所述HMO为例如2’-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、乳-N-四糖、乳-N-新四糖、3’-唾液酸乳糖和6’-唾液酸乳糖。这些生产方法通常使用遗传工程化的细菌菌株，如重组大肠杆菌(Escherichia coli)。

如今，生产HMO的所有发酵生产方法以及生物催化反应都完全基于外源添加的乳糖作为起始底物。在这些方法中向乳糖中添加一种或多种单糖(US 7,521,212 B1；Albermann et al.,(2001)Carbohydr.Res.334(2)第97-103页)。可以通过糖基转移酶或糖苷酶，使用合适的活化单糖底物催化单糖向乳糖中的添加。此外，可以通过转葡糖苷酶反应向乳糖中添加额外的单糖。

具体地，HMO的发酵生产被证明是有效的，因为由所使用的微生物细胞的代谢提供了必需但难以合成的核苷酸活化单糖。然而，与生物催化方法相比，利用全细胞合成HMO也有几个主要缺点，这些缺点涉及跨细胞膜的转运过程、代谢副反应以及由微生物细胞合成的寡糖必须被从尤其含有各种多元醇(例如碳水化合物)、核酸、多肽、无机材料等的复杂混合物中纯化的必要性。

需要克服的涉及在发酵过程中使用乳糖(特别是当要生产的寡糖要用于人类食用时)的一个技术问题是在乳糖的热处理后，乳糖(β-D-半乳糖吡喃糖基-(1->4)-D-葡萄糖)重排成乳果糖(β-D-半乳糖吡喃糖基-(1->4)-D-呋喃果糖)。这种重排可以通过乳糖的热灭菌而广泛发生，从而导致在发酵培养基中或乳糖发酵进料中存在的乳糖的百分之几重排成乳果糖。然而，乳果糖是人类不可消化的糖，被广泛用作治疗慢性便秘的泻药。

乳糖向乳果糖的转化不仅导致产生不想要的乳果糖，而且为微生物细胞中的糖基化反应提供了不想要的底物。因此，产生作为副产物的更复杂的寡糖(例如2’-岩藻糖基-乳果糖)。因此，从乳糖产生乳果糖导致了密切相关的寡糖对所需产物的污染，所述寡糖很难或甚至不可能被从所需产物中分离。

此外，如果把乳糖提供给β-半乳糖苷酶阳性大肠杆菌菌株，乳糖可以转化为异乳糖(β-D-半乳吡喃糖基-(1→6)-D-吡喃葡萄糖)——另一种不想要的污染物(Huber etal.,“Efflux of beta-galactosidase products from Escherichia coli”(1980)J.Bacteriol.141,528-533)。

此外，乳糖的添加可能会引起一种被称为“乳糖诱导细胞杀伤”的有充分记载的效应。这种效应最有可能是由微生物细胞对乳糖的过度摄取和跨细菌膜的质子梯度的相关崩溃所致。特别是乳糖渗透酶基因(例如大肠杆菌的lacY)的过表达与重组微生物细胞暴露于过量乳糖相结合，可引起重组菌株的相当大的生长延迟和细胞多糖合成的增加(Grube etal.,“Hydrogen-producing Escherichia coli strains overexpressing lactosepermease:FT-IR analysis of the lactose-induced stress”(2013)Biotechnol.Appl.Biochem.5,31)。

此外，如今任何市售的乳糖均源自乳清，乳清是乳制品行业的废料。在奶酪和酪蛋白制造中大量产生乳清。因此，由于乳糖源自乳制品行业，人们仍然担心朊蛋白对它的潜在污染，朊蛋白是牛海绵状脑病(BSE)(也被广泛称为疯牛病)的病原体。BSE是牛的一种致命的神经退行性疾病，引起大脑和脊髓的海绵状变性。BSE可以传染给人类，并被称为克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)的变体。

最重要的是，乳糖仍然是发酵培养基中最昂贵的成分之一，用葡萄糖、甘油、蔗糖等替代乳糖将导致更具成本效益的HMO生产。

为了克服上述缺点，开发了HMO生产的改进方式和方法。例如，WO 2015/150328 A1公开了能够产生包含末端半乳糖-(1→4)-葡萄糖二糖的寡糖的细菌宿主细胞，其中所述细菌宿主细胞表达至少一种编码β-1,4-半乳糖基转移酶的重组核酸序列，所述β-1,4-半乳糖基转移酶能够将游离葡萄糖单糖半乳糖基化以在细胞内产生乳糖，并且所述细菌宿主细胞含有并表达至少一种编码岩藻糖基转移酶、唾液酸转移酶、葡糖胺基转移酶或半乳糖基转移酶的重组核酸序列。所述细菌宿主细胞能够在没有外源添加乳糖的情况下产生寡糖，从而使得细菌宿主细胞可在没有外源添加乳糖的培养基中培养以产生所述寡糖。更具体地说，WO 2015/150328A1公开了一种用于生产2’-岩藻糖基乳糖的遗传工程化的大肠杆菌菌株，该菌株利用蔗糖或者葡萄糖和蔗糖的组合作为碳源。为了利用蔗糖，所述大肠杆菌菌株被遗传工程化来表达大肠杆菌W的csc-基因簇的四个基因，即编码蔗糖通透酶(cscB)、果糖激酶(cscK)、蔗糖水解酶(cscA)和转录抑制因子(cscR)的基因。

然而，所述遗传工程化的大肠杆菌菌株利用蔗糖作为唯一碳源和能源生产2’-FL也有其缺点，即难以在没有相当大程度的水解且不形成不想要的副产物的情况下对蔗糖进行热灭菌。可以使用一种替代的蔗糖溶液的无菌过滤，但无菌过滤具有很高的发酵的外来生长污染的风险，特别是在工业规模的发酵中。

此外，培养一种微生物细胞用于在存在蔗糖作为碳源的情况下生产HMO，其中所述微生物细胞已被遗传工程化以具有分裂代谢(split metabolism)，使得组成蔗糖的单体被用于不同的代谢途径，导致细菌细胞培养物的不想要的生长特性，这可能是由于细胞内蔗糖水解产生的单体的化学计量与不同途径中不同单体的数量需求不匹配。

为了克服上述缺点，提供了一种遗传工程化的微生物细胞，当在作为主要碳源和能源的混合单糖原料中培养，但没有外源添加的乳糖时，所述细胞能够产生在其还原端包含半乳糖-β1,4-葡萄糖部分的目的寡糖。

发明内容

在第一方面，本发明提供了用于生产乳糖或在其还原端包含半乳糖-β1,4-葡萄糖部分的目的寡糖的遗传工程化的微生物细胞，其中所述微生物细胞能够以从头合成途径产生所述乳糖或当在没有外源添加的乳糖的情况下培养时产生所述目的寡糖。

在第二方面，本发明提供了遗传工程化的微生物宿主细胞用于生产乳糖或在其还原端包含半乳糖-β1,4-葡萄糖部分的目的寡糖的用途。

在第三方面，本发明提供了一种用于生产乳糖或在其还原端包含半乳糖-β1,4-葡萄糖部分的目的寡糖的方法，所述方法是通过在存在含有葡萄糖的混合原料的情况下培养遗传工程化的微生物细胞，并回收目的寡糖。

附图说明

图1示出了根据本发明的用于生产2’-岩藻糖基乳糖的遗传工程化的微生物细胞的一个示例性实施方案的示意图。

图2示出了根据本发明的用于生产2’-岩藻糖基乳糖的遗传工程化的微生物细胞的另一个示例性实施方案的示意图。

图3示出了根据本发明的用于生产2’-岩藻糖基乳糖的遗传工程化的微生物细胞的另一个示例性实施方案的示意图。

图4示出了大肠杆菌菌株在培养过程中的生长特性，所述培养是在葡萄糖

(A)或由葡萄糖和果糖组成的混合单糖原料上进行；

(B)作为唯一的碳源和能源下进行。

具体实施方式

根据第一方面，本发明提供了用于生产乳糖或在其还原端包含半乳糖-β1,4-葡萄糖部分的目的寡糖的遗传工程化的微生物细胞，其中所述微生物细胞具有至少一种葡萄糖转运蛋白，其用于将葡萄糖从培养基中转运到微生物细胞的细胞质中；UDP-半乳糖生物合成途径，其用于在细胞内生物合成UDP-半乳糖；和至少一种半乳糖基转移酶，其能够将游离的细胞内葡萄糖半乳糖基化以在细胞内产生乳糖。

遗传工程化的微生物细胞能够产生乳糖。在某些实施方案中，微生物细胞可以利用自身产生的乳糖来生产在其还原端具有半乳糖-β1,4-葡萄糖部分的目的寡糖。对于所述目的寡糖的生产，没有必要向微生物细胞提供外源乳糖供应。

遗传工程化的微生物细胞具有至少一种葡萄糖转运蛋白，其用于将葡萄糖从培养所述微生物细胞的培养基中转运到微生物细胞的细胞质中，从而使得游离的葡萄糖可用于乳糖的细胞内生物合成。

通常，遗传工程化的微生物细胞包含至少一种编码所述葡萄糖转运蛋白的功能性基因，所述葡萄糖转运蛋白能够将葡萄糖(Glu)从培养基中转运到细胞的细胞质中。

本文使用的术语“功能性基因”是指一种核酸分子，它包含编码蛋白质或多肽的核苷酸序列，它还包含可操作地连接到所述编码蛋白质的核苷酸序列的调节序列，使得编码该蛋白质或多肽的核苷酸序列可以在/通过具有所述功能性基因的微生物细胞表达。因此，当在允许功能性基因表达的条件下培养时，所述功能性基因被表达，而表达所述功能性基因的微生物细胞通常包含由该功能性基因的蛋白质编码区编码的蛋白质或多肽。正如本文所使用的，术语“核酸”和“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，除非另有限制，它包括天然核苷酸的已知类似物，它们以与天然存在的核苷酸类似的方式与核酸杂交。除非另有说明，特定的核酸序列包括其互补序列。

本文使用的术语“可操作地连接的”应当意指核酸表达调控序列(例如启动子、信号序列或一系列转录因子结合位点)和第二核酸序列之间的功能连接，其中表达调控序列影响对应于第二序列的核酸的转录和/或翻译。相应地，术语“启动子”指通常在DNA聚合物中的基因“之前”并且提供向mRNA的转录的起始位点的DNA序列。“调节子”DNA序列也通常在给定DNA聚合物中的基因的“上游”(即之前)，结合决定转录起始频率(或速率)的蛋白。这些位于功能性DNA聚合物中的所选基因(或一系列基因)之前的序列统称为“启动子/调节子”或“调控”DNA序列，它们共同合作以确定基因的转录(和最终表达)是否发生。在DNA聚合物中的基因“之后”并且提供向mRNA的转录的终止信号的DNA序列被称为转录“终止子”序列。

术语“重组”，在本文中用于细菌宿主细胞时表示所述细菌细胞复制异源核酸，或表达由异源核酸(即“对所述细胞而言是外源的”序列)编码的肽或蛋白。重组细胞可包含在天然(非重组)形式的细胞内不存在的基因。重组细胞还可包含在天然形式的细胞中存在的基因，其中所述基因被修饰并通过人工方式被重新引入到细胞中。该术语还涵盖了包含对细胞而言为内源的且已被修饰的核酸的细胞，而在未将所述核酸从细胞移出；这类修饰包括通过基因置换、位点特异性突变以及相关技术获得的那些。因此，“重组多肽”是通过重组细胞产生的多肽。本文使用的“异源序列”或“异源核酸”是源自特定宿主细胞以外的来源(例如来自不同的物种)的核酸，或者，如果来自相同来源，则由其天然形式被修饰。因此，与启动子可操作地连接的异源核酸来自与启动子的来源不同的来源，或者，如果来自相同的来源，则由其天然形式被修饰。异源序列可被稳定地引入(例如通过转染、转化、缀合或转导)到宿主微生物细胞的基因组中，其中可应用的技术取决于待引入所述序列的宿主细胞。各种技术是本领域技术人员已知的，并且例如公开于Sambrook et al.，MolecularCloning:A Laboratory Manual,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.(1989)。

因此，“遗传工程化的微生物细胞”应理解为已被转化或被转染的细菌细胞，或能够被外源多核苷酸序列转化或转染的细菌细胞。

因此，本发明中使用的核酸序列可例如被包含于载体中，所述载体将被稳定转化/转染或以其他方式被引入到宿主微生物细胞中。

多种表达系统可用于产生本发明的多肽。这类载体尤其包括染色体衍生载体、附加体衍生载体和病毒衍生载体，例如衍生自细菌质粒、衍生自噬菌体、衍生自转座子、衍生自酵母附加体、衍生自插入元件、衍生自酵母染色体元件、衍生自病毒的载体，以及衍生自其组合的载体，例如衍生自质粒和噬菌体遗传元件(例如粘粒和噬菌粒)的那些。表达系统构建体可包含调控区，其调节以及引起表达。通常，任何在宿主中适于维持、增殖或表达多核苷酸和适于合成多肽的系统或载体可在这方面用于表达。通过多种公知和常规技术(例如上文Sambrook et al.中所述的那些)中的任何技术，可将适合的DNA序列插入到表达系统中。

本领域中涉及“重组DNA”方法的专利和文献出版物很多，这些方法用于分离、合成、纯化和扩增遗传物质以用于转化所选的宿主生物体。因此，使用包含所选的外源(即外源的或“异源的”)DNA序列的“杂合”病毒或环形质粒DNA来转化宿主生物体是公知常识。本领域中已知的程序首先包括通过酶切环形病毒或质粒DNA以形成线性DNA链来产生转化载体。通过使用相同/相似的酶以线性形式制备所选的外源DNA链，所述DNA链通常包含编码所需蛋白质产物的序列。线性病毒或质粒DNA与外源DNA在存在能够进行恢复过程的连接酶的情况下孵育，并形成“杂交”载体，其包含“拼接”到病毒或环形DNA质粒中的所选的外源DNA片段。

术语“编码……的核苷酸序列”通常指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可以是未经修饰的RNA或DNA或者经修饰的RNA或DNA，并且通常代表编码某一多肽或蛋白的基因的部分。该术语包括但不限于单链和双链DNA，作为单链区和双链区的混合物或单链区、双链区和三链区的混合物的DNA，单链和双链RNA，作为单链区和双链区的混合物的RNA，包含DNA和RNA的杂合分子(所述DNA和RNA可以是单链或更通常是双链或三链区，或单链区和双链区的混合物)。该术语还涵盖了多核苷酸，其包含编码多肽的单个连续区或不连续区(例如，被整合的噬菌体或插入序列或编辑所中断)以及也可包含编码序列和/或非编码序列的其他区域。

在一个实施方案中，一种合适的葡萄糖转运蛋白为葡萄糖促进扩散蛋白。一种合适的葡萄糖促进融合蛋白是由运动发酵单胞菌运动亚种(Zymomonas mobilissubsp.mobilis)(菌株ATCC 31821/ZM4/CP4)的glf基因编码。

在一个额外的和/或替代的实施方案中，另一种合适的葡萄糖转运蛋白为葡萄糖转运通透酶。一种合适的葡萄糖转运通透酶是由大肠杆菌K-12galP基因编码。葡萄糖转运通透酶也被称为半乳糖-质子同向转运体(symporter)或半乳糖通透酶，但也跨细胞膜输入葡萄糖。

因此，在一个额外的和/或替代的实施方案中，遗传工程化的微生物细胞包含并表达至少一个基因，所述基因包含运动发酵单胞菌运动亚种(菌株ATCC 31821/ZM4/CP4)的glf基因、大肠杆菌K-12galP基因或其功能性变体的蛋白质编码区。

本文使用的术语“变体”是指这样的多核苷酸或多肽，即其分别不同于参照多核苷酸或多肽，但是保留了参照多核苷酸或多肽的必需(酶)特性。典型的多核苷酸变体的核苷酸序列与另一参照多核苷酸不同。变体核苷酸序列的变化可改变或不改变由参照多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列。核苷酸变化可导致由参照序列编码的多肽中的氨基酸置换、添加、缺失、融合和截短，如下文讨论的。典型的多肽变体的氨基酸序列与另一参照多肽不同。通常，差异是有限的，使得参照多肽和变体的序列在整体上非常相似，并且在许多区域是相同的。变体和参照多肽的氨基酸序列的差异可以为任意组合的一个或多个置换、添加、缺失。被置换或插入的氨基酸残基可以是或不是由遗传密码编码的氨基酸残基。多核苷酸或多肽的变体可以是天然存在的，例如等位基因变体，或可以是已知非天然存在的变体。多核苷酸和多肽的非天然存在的变体可通过诱变技术、通过直接合成和通过本领域技术人员已知的其他重组方法来制备。

在本发明的范围内，那些术语还包括核酸/多核苷酸和多肽多态性变体、等位基因、突变体和物种间同源物，其氨基酸序列与野生型蛋白质编码的多肽具有大于约60％的氨基酸序列同一性，65％、70％、75％、80％、85％、90％，优选91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更大的氨基酸序列同一性，优选地在至少约25、50、100、200、500、1000或更多氨基酸的区域上。

因此，本文公开的任何基因/蛋白的“功能性变体”意欲指仍然保留与衍生出各片段的基因或蛋白相同或略低活性的基因/蛋白的序列变体。

因为乳糖的细胞内生物合成需要有效的UDP-半乳糖供应，遗传工程化的微生物细胞具有UDP-半乳糖生物合成途径，其用于细胞内形成GDP-半乳糖(GDP-Gal)。

在一个额外的和/或替代的实施方案中，UDP-半乳糖可以从微生物细胞自身的代谢中获得，即磷酸葡萄糖变位酶、UTP-葡萄糖-1-磷酸-尿苷酰基转移酶和UDP-葡萄糖-4-差向异构酶的活性。

通过遗传修饰(如表达或过表达一种或多种编码多肽的基因)可改善细胞内GDP-半乳糖供应，所述多肽分别表现出磷酸葡萄糖变位酶活性、UDP-葡萄糖-1-磷酸-尿苷酰基转移酶活性和UDP-葡萄糖-4-差向异构酶活性。

本文使用的术语“过表达”或“过表达的”是指酶或多肽表达的水平大于在同一物种的野生型细胞(作为未被遗传改变的宿主细胞)中测量的水平。

磷酸葡萄糖变位酶是促进葡萄糖-1-磷酸到葡萄糖-6-磷酸的相互转化的酶，即它在从1’到6’位置或6’到1’位置的α-D-葡萄糖单体上。一种编码合适的磷酸葡萄糖变位酶的示例性基因为大肠杆菌K-12pgm基因(GenBank:U08369.1)。因此，在一个额外的和/或替代的实施方案中，遗传工程化的微生物细胞包含并表达/过表达编码磷酸葡萄糖变位酶的基因，所述基因优选地包含大肠杆菌pgm基因或其变体的蛋白质编码区。

UTP-葡萄糖-1-磷酸-尿苷酰基转移酶，如GalU或其功能性变体，利用UTP催化α-D-葡萄糖-1-磷酸转化为UDP-葡萄糖。一种编码合适的UTP-葡萄糖-1-磷酸-尿苷酰基转移酶的示例性基因为大肠杆菌K-12galU基因(GenBank:M98830.1)。因此，在一个额外的和/或替代的实施方案中，遗传工程化的微生物细胞包含并表达/过表达编码UTP-葡萄糖-1-磷酸-尿苷酰基转移酶的基因，所述基因优选地包含大肠杆菌galU基因或其变体的蛋白质编码区。

UDP-葡萄糖-4-差向异构酶，如GalE或其功能性变体，催化UDP-葡萄糖差向异构化为UDP-半乳糖。一种编码UDP-葡萄糖-4-差向异构酶的示例性基因为大肠杆菌K-12galE基因。因此，在一个额外的和/或替代的实施方案中，遗传工程化的微生物细胞包含并表达/过表达编码UDP-葡萄糖-4-差向异构酶的基因，所述基因优选地包含大肠杆菌galE基因或其变体的蛋白质编码区。

在一个额外的和/或替代的实施方案中，UDP-半乳糖生物合成途径还包含葡萄糖-6-磷酸异构酶的酶活性，所述葡萄糖-6-磷酸异构酶将果糖-6-磷酸转化为葡萄糖-6-磷酸，反之亦然。一种编码葡萄糖-6-磷酸异构酶的示例性基因为大肠杆菌K-12pgi基因。因此，在一个额外的和/或替代的实施方案中，遗传工程化的微生物细胞包含并表达/过表达编码葡萄糖-6-磷酸异构酶的基因，所述基因优选地包含大肠杆菌pgi基因或其变体的蛋白质编码区。

或者，可通过经由培养基向微生物细胞进料半乳糖获得UDP-半乳糖。半乳糖被细胞吸收并被磷酸化为半乳糖-1-磷酸，然后其转化为UDP-半乳糖。在文献(Groissoird etal.,“Characterization,Expression,and Mutation of the Lactococcus lactisgalPMKTE Genes,Involved in Galactose Utilization via the Leloir Pathway(2003)J.Bacteriol.185(3)870-878)中已知编码具有所需酶活性的酶的基因。

遗传工程化的微生物细胞包含β-1,4-半乳糖基转移酶，其能够将游离的葡萄糖单糖半乳糖基化。在一个额外的和/或替代的实施方案中，合适的β-1,4-半乳糖基转移酶源自脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria menningitidis)、源自嗜沫聚集杆菌(Aggregatibacteraphrophilus)或源自多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)，优选地由脑膜炎奈瑟氏菌lgtB基因、嗜沫聚集杆菌的lex-1基因或来自多杀性巴氏杆菌的β-1,4-半乳糖基转移酶基因galTpm1141(GenBank:AEC04686)编码的β-1,4-半乳糖基转移酶。因此，在一个额外的和/或替代的实施方案中，遗传工程化的微生物细胞包含并表达/过表达编码β-1,4-半乳糖基转移酶的基因，所述基因优选地包含脑膜炎奈瑟氏菌lgtB基因、嗜沫聚集杆菌lex-1基因、多杀性巴氏杆菌galTpm1141基因或其变体的蛋白质编码区。

β-1,4-半乳糖基转移酶使用UDP-半乳糖作为底物，用于将半乳糖部分转移到游离的葡萄糖单糖，从而合成半乳糖-β1,4-葡萄糖二糖，即乳糖。

在一个额外的和/或替代的实施方案中，遗传工程化的微生物细胞包含至少一种额外的糖基转移酶，即除了所述β-1,4-半乳糖基转移酶以外。

通常，在本公开内容通篇中，术语“糖基转移酶活性”或“糖基转移酶”意指并涵盖负责二糖、寡糖和多糖的生物合成的酶，它们催化单糖部分从活化的核苷酸单糖/糖(“糖基供体”)转移到糖基受体分子。

在一个优选的实施方案中，至少一种额外的糖基转移酶为岩藻糖基转移酶、唾液酸转移酶、葡糖胺基转移酶或半乳糖基转移酶，更优选地，至少一种额外的糖基转移酶选自以下至少一种：α-1,2-岩藻糖基转移酶、α-1,3-岩藻糖基转移酶、β-1,3-N-乙酰葡糖胺基转移酶、β-1,3-半乳糖基转移酶、α-2,3-唾液酸转移酶、α-2,6-唾液酸转移酶、β-1,4-半乳糖基转移酶或β-1,6-半乳糖基转移酶。

至少一种额外的糖基转移酶的酶活性允许通过使用乳糖作为额外的糖基转移酶的活性的受体生产目的寡糖，所述目的寡糖在其还原端包含半乳糖-β-1,4-葡萄糖部分。表1确定了最丰富的HMO，这些HMO可通过本文公开的微生物细胞和方法作为目的寡糖生产。

表1：可通过使用本文描述的遗传修饰的微生物细胞和/或方法生产的目的寡糖的列表。

在一个额外的和/或替代的实施方案中，微生物细胞包含葡萄糖转运磷酸转移酶系统(PtsG)。葡萄糖转运磷酸转移酶系统催化进入的葡萄糖的磷酸化，伴随其跨细胞膜的转运。

Pts系统的一般机制如下：磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的磷酰基通过信号转导途径转移到酶I(EI)，所述酶I(EI)又将其转移到磷酰基载体组氨酸蛋白(HPr)上。然后磷酸-HPr将磷酰基转移到糖特异性通透酶——一种称为酶2(EII)的膜结合复合物，其将糖转运到细胞。EII由至少三个结构上不同的结构域IIA、IIB和IIC组成。它们可以在单条多肽链中融合在一起，或作为两条或三条相互作用的链存在，以前称为酶II(EII)和III(EIII)。

第一结构域(IIA或EIIA)携带第一通透酶特异性磷酸化位点——由磷酸-HPr磷酸化的组氨酸。第二结构域(IIB或EIIB)由磷酸-IIA在半胱氨酰或组氨酰残基上磷酸化，这取决于所转运的糖。最后，磷酰基从IIB结构域转移到糖底物，伴随着IIC结构域处理的糖摄取。该第三结构域(IIC或EIIC)形成转运通道和特异性底物结合位点。

因此，PtsG系统获得外源葡萄糖，并在微生物细胞中提供葡萄糖-6-磷酸。葡萄糖-6-磷酸可用于UDP-半乳糖生物合成途径和/或转化为果糖-6-磷酸，而果糖-6-磷酸又可用于在中心代谢中和/或例如在核苷酸活化糖(如GDP-岩藻糖)的生物合成中产生高能三磷酸(energy-rich triphosphate)。

在一个额外的和/或替代的实施方案中，微生物细胞的葡萄糖激酶基因已被缺失或功能性失活，使得微生物细胞不具有任何具有葡萄糖激酶活性的多肽。葡萄糖激酶(Glk)b在游离葡萄糖的碳原子6处将其磷酸化以产生葡萄糖-6-磷酸。在没有葡萄糖激酶活性的情况下，转运到微生物细胞的细胞质中的游离葡萄糖可被用作β1,4-半乳糖基转移酶的底物以产生乳糖，而从PtsG活性中获得的葡萄糖-6-磷酸可用于UDP-半乳糖的形成或其他代谢途径。

在一个额外的和/或替代的实施方案中，遗传工程化的微生物细胞包含果糖转运蛋白，其用于将果糖(Fru)从培养基中转运到微生物细胞的细胞质中。一种用于摄取游离果糖的合适的果糖转运蛋白为如Kornberg et al.PNAS 97:1808-1812(2000)描述的同种型(PtsG-F)。

然后内化的果糖可被果糖激酶(FrK)磷酸化，以提供果糖-6-磷酸(Fru-6-P)。果糖-6-磷酸可用于UDP-半乳糖生物合成途径和/或其他代谢途径，如在中心代谢中和/或例如在核苷酸活化糖(如GDP-岩藻糖)的生物合成中产生高能三磷酸。

在一个额外的和/或替代的实施方案中，遗传工程化的微生物细胞包含显示果糖激酶-6活性的多肽和显示6-磷酸果糖激酶-1活性(FruK或磷酸果糖激酶)的多肽，以提供从内化果糖经由果糖-6-磷酸到果糖-1.6-二磷酸的代谢途径。

在一个额外的和/或替代的实施方案中，遗传工程化的微生物细胞包含果糖转运磷酸转移酶系统(PtsF)。果糖转运磷酸转移酶系统催化进入的果糖的磷酸化，伴随其跨细胞膜的转运。

因此，PtsF系统获得外源果糖，并在微生物细胞中提供果糖-1-磷酸。PtsF系统包含跨膜蛋白FruA、1-磷酸果糖激酶(FruK)和二磷酰基转移蛋白FruB。通过FruA和FruB转运果糖，以在细胞质中提供果糖-1-磷酸。果糖-1-磷酸可被磷酸果糖激酶(FruK)进一步磷酸化，以产生果糖-1,6-二磷酸，而果糖-1,6-二磷酸又可被微生物细胞用于在中心代谢中产生高能三磷酸。

另一个合适的PtsF系统包含LevD、LevE、LevF和LevG。LevD为果糖特异性磷酸转移酶IIA组分。LevE为果糖特异性磷酸转移酶IIB组分。LevF为果糖通透酶IIC组分，LevG为果糖通透酶IID组分。已知对应的基因levD、levE、levF和levG例如来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(菌株168)。所述PtsF系统在细胞中提供果糖-1-磷酸。

在一个额外的和/或替代的实施方案中，遗传工程化的微生物细胞包含至少一种1-磷酸果糖激酶(FruK)。

在一个额外的和/或替代的实施方案中，遗传工程化的微生物细胞包含果糖-1,6-二磷酸酶(GlpX)。所述果糖-1,6-二磷酸酶将果糖-1,6-二磷酸去磷酸化以提供果糖-6-磷酸。果糖-6-磷酸可由微生物细胞用于GDP-半乳糖生物合成途径中，或用于另一种代谢途径中，例如核苷酸活化糖(如GDP-岩藻糖)的生物合成。

优选地，微生物细胞还包含其磷酸果糖激酶基因的缺失或功能性失活。磷酸果糖激酶基因的缺失或功能性失活导致微生物细胞缺乏磷酸果糖激酶的活性，使得可以防止Fru-6-P转化为Fru-1,6-二P。在大肠杆菌中，存在磷酸果糖激酶的两个同种型，命名为PfkA和PfkB。对应的基因为pfkA和pfkB。

在一个额外的和/或替代的实施方案中，遗传工程化的微生物细胞具有GDP-L-岩藻糖生物合成途径。在一个额外的和/或替代的实施方案中，GPD-岩藻糖生物合成途径包含甘露糖-6-磷酸异构酶(ManA)、磷酸甘露糖变位酶(ManB)、甘露糖-1-磷酸-鸟苷酰基转移酶(ManC)、GDP-甘露糖-4,6-脱水酶(Gmd)、GDP-L-岩藻糖合酶(WcaG)。优选地，具有GDP-L-岩藻糖生物合成途径的微生物细胞也具有岩藻糖基转移酶。

在一个额外的和/或替代的实施方案中，微生物细胞包含从细胞中输出目的寡糖的输出蛋白或通透酶，优选地糖外排转运蛋白。

在一个额外的和/或替代的实施方案中，遗传工程化的微生物细胞包含其葡萄糖-6-磷酸异构酶基因的缺失或功能性失活，使得微生物细胞缺乏葡萄糖-6-磷酸异构酶活性。葡萄糖-6-磷酸异构酶(在大肠杆菌中命名为Pgi)将葡萄糖-6-磷酸转化为果糖-6-磷酸。通过缺失葡萄糖-6-磷酸基因或通过使它们的表达失活，存在于微生物细胞的细胞质中的任何葡萄糖-6-磷酸均可以被导向乳糖生产。

在一个额外的和/或替代的实施方案中，微生物细胞为选自以下细菌属的细菌细胞：埃希氏菌属(Escherichia)、乳杆菌属(Lactobacillus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、链球菌属(Streptococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳球菌属(Lactococcus)和梭菌属(Clostidium)，优选地选自以下细菌种的细菌细胞：大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、解纤维素梭菌(Clotridium cellulolyticum)、永达尔梭菌(Clostridium ljungdahlii)、自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。在另一个实施方案中，微生物细胞为大肠杆菌。本领域技术人员在阅读本公开内容时将认识到其他细菌菌株。

根据第二方面，本发明提供了本文所述的遗传工程化的微生物细胞用于生产乳糖或在其还原端包含半乳糖-β1,4-葡萄糖部分的寡糖的用途。在一个额外的和/或替代的实施方案中，遗传工程化的微生物细胞用于生产乳糖或在其还原端包含半乳糖-β1,4-葡萄糖部分的寡糖的方法，其中微生物细胞是在存在包含葡萄糖和至少一种额外碳源的混合原料的情况下培养。所述额外的碳源可选自果糖、半乳糖、甘露糖、木糖、鼠李糖、甘油、琥珀酸、丙酮酸和苹果酸。优选地，混合原料为葡萄糖和果糖的混合物，更优选地为葡萄糖和果糖的等摩尔混合物，最优选地包含水解蔗糖或由水解蔗糖组成。

根据第三方面，本发明提供了一种用于生产乳糖或在其还原端包含半乳糖-β1,4-葡萄糖部分的目的寡糖的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供如本文所述的遗传工程化的微生物细胞；

b)在培养基中和允许生产所述乳糖或目的寡糖的条件下培养微生物细胞，其中所述培养基含有葡萄糖和至少一种选自以下的额外化合物的混合物作为主要碳源：果糖、半乳糖、甘露糖、木糖、鼠李糖、甘油、琥珀酸、丙酮酸和苹果酸；和

c)从培养基和/或微生物细胞中回收乳糖或目的寡糖。

在一个额外的和/或替代的实施方案中，目的寡糖为选自以下的人乳寡糖：2’-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、2’,3-二岩藻糖基乳糖、3’-唾液酸乳糖、6’-唾液酸乳糖、3-岩藻糖基-3’-唾液酸乳糖、乳-N-四糖、乳-N-新四糖、乳-N-岩藻戊糖I、乳-N-岩藻戊糖II、乳-N-岩藻戊糖III、乳-N-岩藻戊糖V、乳-N-二岩藻糖基己糖I、乳-N-二岩藻糖基己糖II、乳-N-唾液酸戊糖LSTa、LSTb、LSTc。

优选地，葡萄糖和至少一种额外的单糖的混合物为葡萄糖和果糖的混合原料，优选地通过水解蔗糖得到。

在一个额外的和/或替代的实施方案中，在没有外源乳糖供应的情况下培养微生物细胞，特别是当培养用于生产目的寡糖时。

将用具体实施方案和附图来描述本发明，但本发明不限于此，而仅通过权利要求来限定。此外，说明书和权利要求中的术语第一、第二等用于区分相似要素，而并不必然用于在时间上、空间上、以排序方式或以任何其他方式描述顺序。应该理解，如此使用的术语在适当情况下是可互换的，并且本文描述的本发明的实施方案能够以不同于本文描述或举例说明的顺序的其他顺序操作。

应当注意的是，权利要求中使用的术语“包括”不应被解释为限于其后列出的方式；它不排除其他要素或步骤。因此，它被解释为指明所述特征、整数、步骤或组分的存在，但不排除存在或添加一个或多个其他特征、整数、步骤或组分，或其群组。因此，表述“包括装置A和B的设备”的范围不应限于仅由组件A和B组成的设备。这意味着，就本发明而言，该装置仅有的相关组件是A和B。

在本说明书通篇中，提及“一个(one)实施方案”或“一个(an)实施方案”是指在本发明的至少一个实施方案中包括就实施方案描述的特定的特性、结构或特征。因此，在本说明书通篇中各处出现的短语“在一个(one)实施方案中”或“在一个(an)实施方案中”并不必然都是指同一实施方案，而是可能是指同一实施方案。此外，在一个或多个实施方案中，可以以任何适当的方式组合特定的特性、结构或特征，基于本公开内容，这对于本领域术人员的来说是显而易见的。

类似地，应当意识到，在本发明的示例性实施方案的描述中，为了简化本公开内容并有助于理解本发明的一个或多个方面，本发明的各种特征有时在单个实施方案、其图或描述中被分组在一起。然而，这种公开方法不应被解释为反映了所要求保护的发明需要比在每个权利要求中明确记载的特征更多的特征的意图。相反，正如以下权利要求所反映的，本发明的方面在于少于单个前述公开实施方案的所有特征。因此，在具体的说明书之后的权利要求被明确地纳入所述具体的说明书中，每一项权利要求本身作为本发明的单独的实施方案。

此外，虽然本文描述的一些实施方案包括其他实施方案中包括的一些特征但不包括其他特征，但不同实施方案的特征的组合在本发明的范围内，并形成不同的实施方案，正如本领域技术人员所理解的那样。例如，在以下权利要求中，任何要求保护的实施方案都可以以任何组合使用。

此外，本文将一些实施方案描述为可以由计算机系统的处理器或通过执行该功能的其他手段来实现的方法或方法要素的组合。因此，具有执行这种方法或方法要素的必要指令的处理器构成用于执行所述方法或方法要素的手段。此外，本文描述的装置实施方案的元件是为了实施本发明，用于执行由所述元件行使的功能的手段的实例。

在本文提供的说明书和附图中，列出了许多具体的细节。然而应理解，本发明的实施方案可以在没有这些具体细节的情况下实施。在其他情况下，公知的方法、结构和技术未被详细地示出，以避免混淆对本说明书的理解。

现在将通过对本发明的几个实施方案的具体说明来描述本发明。显然，在不偏离本发明的真正主旨或技术教导的情况下，可以根据本领域技术人员的知识来设置本发明的其他实施方案，本发明仅受所附的权利要求的术语限制。

在一个实施方案中，具有基因型lacY

此外，表达/过表达大肠杆菌基因manA、manC、manB、gmd、wcaG、pgm、galU和galE的至少一种，以及表达异源β-1,4-半乳糖基转移酶(其能够将半乳糖从UDP-半乳糖转移到葡萄糖上从而产生乳糖)，以及α-1,2-岩藻糖基转移酶(其能够将岩藻糖从GDP-岩藻糖转移到乳糖，从而产生2’-岩藻糖基乳糖)。

在一个优选的实施方案中，通过降低和/或减少磷酸果糖激酶基因pfkA和/或pfkB和/或葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因zwf和/或葡萄糖-6-磷酸异构酶基因pgi的表达而进一步工程化该生产菌株。这种进一步的遗传修饰允许在作为主要的碳源和能源的混合单糖原料(例如水解蔗糖)上培养由此工程化的生产菌株，同时避免阻碍菌株的代谢，但增加前体供应(葡萄糖和果糖-6-磷酸和葡萄糖-6-磷酸)用于通过全发酵生产2’-岩藻糖基乳糖。

参照图1，示意地示出了本发明的一个示例性微生物细胞。所述微生物细胞能够在由葡萄糖(Glu)和果糖(Fru)组成的混合原料上培养时产生2’-FL，但该混合原料不含乳糖(Lac)。微生物细胞表达编码葡萄糖转运蛋白(Glf)和果糖转运蛋白的多核苷酸，分别用于将葡萄糖和果糖输入细胞。由于葡萄糖激酶Glk的表达已通过缺失或功能性失活glk基因而被消除，任何由细胞输入的葡萄糖都可被用作β1,4-半乳糖基转移酶GalTpm1141的底物，通过UDP-半乳糖生物合成途径在细胞内产生乳糖(Lac)。

通过细胞的果糖-6激酶磷酸化输入的果糖，以产生细胞内Fru-6-P池。一部分Fru-6-P池用于“UDP-Gal生物合成途径”，以细胞内合成UDP-Gal，其作为GalTpm1141半乳糖基转移酶的Gal供体，产生Lac。另一部分fru-6-P池用于“GDP-L-Fuc生物合成途径”，以生产GDP-L-岩藻糖。所述GDP-L-岩藻糖作为2’-岩藻糖基转移酶WbgL的岩藻糖供体。然而，细胞内Fru-6-P池的第三部分用于能源和生物质生产，即通过细胞磷酸果糖激酶PfkA和/或PfkB将其fru-6-P转化为Fru-1,6-二P。

图2示意地显示了本发明的另一个示例性微生物细胞，所述微生物细胞当在由葡萄糖(Glu)和果糖(Fru)组成的混合原料上培养时能够产生2’-FL，但所述混合原料不含乳糖(Lac)。除了图1中所示的示例性微生物细胞，微生物细胞还包含葡萄糖特异性Pts系统(PtsG)。所述PtsG系统输入和磷酸化Glu，以在细胞的胞质溶胶中提供Glu-6-P。所述Glu-6-P可被微生物细胞用于产生UDP-Gal或Fru-6-P。在微生物细胞的一个变体(未显示)中，编码葡萄糖-6-磷酸异构酶(Pgi)的细胞的pgi基因被缺失。随着glk基因的缺失，微生物已被遗传工程化，使得通过Glf获得的游离葡萄糖单体可被用作β1,4-半乳糖基转移酶的底物，而通过PtsG获得的任何Glu-6-P可被用于UDP-Gal生物合成。

图3示意地显示了本发明的另一个示例性微生物细胞，所述微生物细胞当在由葡萄糖(Glu)和果糖(Fru)组成的混合原料上培养时能够产生2’-FL，但所述混合原料不含乳糖(Lac)。除了图2中所示的示例性微生物细胞，微生物细胞还包含果糖特异性Pts系统(PtsF)。所述PtsF系统输入和磷酸化Fru以提供Fru-1-P。通过FruK磷酸化Fru-1-P以提供Fru-1,6-二P。微生物细胞具有果糖-1,6-二磷酸酶(GlpX)活性。因此，遗传工程化的微生物细胞被代谢工程化，使得果糖和/或果糖-1-P可以被细胞用于UDP-Gal生物合成。

此外，缺失或功能性失活磷酸果糖激酶基因，使得细胞不具有磷酸果糖激酶(PfkA/PfkB)活性。磷酸果糖激酶基因的缺失或功能性失活损害了Fru-6P到Fru-1,6-P的转化，从而防止了使用Fru-6-P来产生高能三磷酸，并增加了2’-FL的生产。

实施例1-混合单糖原料的制备

通过将500g蔗糖溶于水中，制备50％(w/v)蔗糖溶液。溶液最终体积为1升。在30℃到35℃的温度下，通过用96％(v/v)硫酸调节pH。然后，将溶液垂直高压釜(Systec VX-65,Linden,Germany)中在121℃下杀菌45分钟。在热灭菌前后取样，并在进行高效液相色谱(HPLC)分析前保持冷冻。采用连接到Shimadzu HPLC系统的RID-10A折射率检测器(Shimadzu,Germany)和Waters XBridge Amide柱3.5μm(250x4.6mm)(Eschborn,Germany)进行HPLC。用30％溶剂A(50％(v/v)乙腈溶于双蒸馏水中，0.1％(v/v)NH4OH)和70％溶剂B(80％(v/v)乙腈溶于双蒸馏水中，0.1％(v/v)NH4OH)在35℃下进行等度洗脱，流速为1.4mLmin

表1：在热灭菌前后经pH调节的50％(w/v)蔗糖溶液中检测到的糖的相对量。用96％(v/v)硫酸进行pH调节。描述了HPLC检测到的糖的百分比量(曲线下面积；AUC)。

实施例2-各种基因缺失菌株的原料依赖性生长

比较了大肠杆菌BL21(DE3)菌株(野生型)以及突变菌株大肠杆菌pfkA

实施例3-通过工程化大肠杆菌菌株在混合单糖原料上生长过程中进行的2’-岩藻糖基乳糖的全发酵

通过过表达用于从头合成GDP-岩藻糖(ManB、ManC、Gmd、WcaG)的酶，来自大肠杆菌:O126的2’-岩藻糖基转移酶基因wbgL、来自波可望耶尔森菌(Yersinia bercovieri)ATCC 43970的糖外排转运蛋白基因yberc0001_9420、来自运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)的葡萄糖促进因子基因glf、来自多杀性巴氏杆菌的β-1,4-半乳糖基转移酶基因galTpm1141(GenBank:AEC04686)以及分别编码UDP-葡萄糖4-差向异构酶和磷酸葡萄糖变位酶的大肠杆菌基因galE和pgm，进一步遗传工程化显示出基因型pfkA

在30℃下，在3L发酵罐(New Brunswick,Edison,USA)中培养得到的大肠杆菌菌株，以1000mL矿物盐培养基开始，所述培养基含有7g·L

通过控制搅拌速率，使溶解氧保持在20-30％的饱和度。通过加入25％氨溶液使pH保持在6.7。培养持续86小时，并在培养上清液中产生大量2’-FL。